このプロトコルは、マイクロポア足場に相互リンクするマイクロゲルロッドの製造について説明しています。これらの足場は、効率的な細胞細胞相互作用に必要なスペースを提供する細胞と組み合わせて利用することができます。2つの異なるタイプのマイクロゲルロッドは、接触すると相互リンクします。
高アスペクト比では、球状マイクロゲルと比較して少ない合成材料を使用して足場の安定性を維持しながら、より大きな細孔をもたらす。微細孔足場は、損傷した組織を修復するための内因性細胞の浸潤と相互作用を大幅に増強します。大きな毛穴は血管形成を促進し、成長組織に栄養素を交換します。
足場材料の減少は、組織形成のために提供されるより多くのオープンスペースとして有益であり、これはin vitroおよびin vivoアプリケーションの両方にとって重要である。重要な側面は、マイクロフィティックオンチップ技術です。マイクロゲルロッドの連続生産を確実にするために、製品は目詰まりすることなくチューブから効果的に輸送されなければなりません。
はじめに、針をポリエチレンチューブに挿入し、シリンジとチューブからガスを取り除きます。次に、追加のポリエチレンチューブをコンセントに挿入して製品を収集します。次に、すべてのガラスシリンジとシリンジポンプを配置し、各チューブの端を対応する入口に挿入します。
次に、顕微鏡を油水断面に焦点を合わせます。最初のオイルシリンジポンプを始動して、分散相によるチャネルの濡れを防ぐために、最初にチャネルをオイルで満たします。次に、最初のオイル流量を毎時30マイクロリットルに減らし、分散した水相が断面で観察できるまでプレポリマーシリンジポンプを起動します。
次に、プレポリマーの流量を毎時30マイクロリットルに設定し、顕微鏡を出口に焦点を合わせます。次に、2番目のオイルシリンジポンプを始動し、流量レジームが安定するまで待ちます。出口管を回収容器に入れ、放射照度が900〜1000ミリワット/平方の範囲になるようにUV照射システムを設定します。
そして照射スポットは出口の前の直流路部分です。UV照射前に、プレポリマーと第1油の流量を調整して3.0〜4.5の範囲で所望のアスペクト比を達成し、分散相の照射時間を照射スポットの大きさに応じて約2.3秒に設定する。その後、UV照射を開始し、必要に応じて、前のサブセクションに従って流量を再度調整します。
次に、回収容器を変更し、製品の回収開始時刻と流量をメモします。収集を終了するには、時刻をメモして収集コンテナーを削除します。その後、照射とすべてのシリンジポンプを停止します。
その後、製品をn-ヘキサン、イソプロパノール、および脱イオン水でそれぞれ5回洗浄します。次に、ロッド沈降後の上澄み液を除去します。第1成分分散液を円錐形の1.5または2ミリリットルの透明バイアルに移す。
次に、100マイクロリットルのピペットを使用した連続操作で制御された方法で2番目の成分を追加し、ピペットを使用して内容物を直接混合して液体を取り込み、再度追加します。次に、G R G D S P C溶液を連結構造に加え、遊離アミンとチヤールを有する細胞接着ペプチドで残りのすべてのエポキシ基を修飾し、室温で一晩放置します。次に、イオン交換水で洗浄して未反応分子を除去し、上清を除去する。
水位を下げた後、バイアルを開け、波長250〜300ナノメートルのUV光を除染します。次に、バイアルを閉じて、バイアルをクリーンベンチに移します。その後、滅菌水で洗ってください。
バイアル内の水を細胞培養培地と交換し、5分間平衡化します。次に、マクロ多孔質足場をスパチュラを用いて流し込むか、実験用の細胞培養ウェルプレートに移す。共焦点顕微鏡検査により、3Dマクロ多孔質構造は、相互結合したアミンとエポキシ官能化マイクロゲルロッドで構成されていることが明らかになりました。
この構築物は、2〜3秒以内に形成された約10, 000本のマイクロゲルロッドのコンパクトな形状を示す。アミンおよびエポキシマイクロゲルロッドの有効ヤング率、ならびにアミンおよびエポキシマイクロゲル球は、ナノインデンテーションによって測定されます。活性官能基を検出するために、フルオレセインイソチオシアネートを使用して第一級アミノ基を可視化することができ、フルオレセインアミン異性体1つをエポキシ基の標識に使用することができます。
アミンマイクロゲルロッドの寸法は、脱イオン水中での平均長さ553マイクロメートル、平均幅193マイクロメートルであり、アスペクト比は約3.0です。マクロ細孔とマイクロゲル棒で構成された足場の平均値は100マイクロメートルで、細孔径の90%は30マイクロメートルから150マイクロメートル以上の範囲です。マイクロゲルのような球は、約10〜55マイクロメートルの細孔サイズを持つクラスターをもたらし、平均値は約22マイクロメートルです。
記載されたマイクロゲルロッドは、ランダム混合によって連結されたミクロ細孔足場を生成するように設計されている。制御された混合手順により、将来、よりカスタマイズされた足場形状の製造が可能になります。マイクロゲルの剛性と生化学的手がかりは、販売要件に基づいて変えることができます。
異なるビルディングブロックを組み合わせることで、1つの足場内でさまざまな形状とプロパティを実現できます。このようにして、特定の細胞を効率的に標的にして多細胞組織を形成することができます。
