We thank Cora H&#252;bner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.

倫理文は：すべての実験手順は、研究における動物の使用に関するEU指令に従ったと地元の動物実験委員会によって承認された（Regierungspräsidiumチュービンゲン、バーデン・ヴュルテンベルク州、ドイツの状態）テュービンゲン大学の責任。 1.定位注入手順<ol><li>滅菌器を使用して滅菌ツール（はさみ、メス、クランプ、ドリル、針、縫合糸材料）を準備します。例えば滅菌外科用ドレープ上の滅菌綿スワップ、消毒、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）で、およびH 2 O 2のような滅菌ツールや他の必要なソリューションや手術用品を配置します。 </li><li>製造元の指示に従って水平微小電極プラー上に幅3mmのボックスのフィラメントを使用して、注射剤（ 図1A、挿入図）用ガラスマイクロピペットを引き出します。 注：深い注射のために、電極のテーパーが十分でなければなりません腹最も座標に到達するのに長い（約5ミリメートル;座標のため、1.10を参照してください）​​。 </li><li>プレミックスウイルス溶液1μl及び滅菌PBS中の0.1％ファーストグリーン液0.2μlの（ガラスピペット内の溶液の優れた視認性のため）。先端の細い（ 図1A、挿入図）とマイクロリットルピペットを使用してウイルス液と高速グリーンの混合物とガラスピペットを埋めます。 注：組換えアデノ随伴ウイルスベクター（rAAVの）と協力はバイオセーフティーレベル1（BSL 1）仕事と考えられ、BSL 1実験室で実施する必要があります。この研究（ 図1C）で使用rAAVsは以下の通りであった：1）のmPFC：のrAAV-HSYN-のChR2（H134R）-eYFP（血清型2/9）16。 2）MGM / PIN：のrAAV-CAGh-のChR2（H134R）-mCherry（血清型2/9）23。 3）mpITC / BLA：のrAAV-EF1A-DIOhChR2（H134R）-YFP（血清型2/1）23 </li><li>小動物麻酔機（：誘導のための酸素中3％イソフルラン）を使用して、マウスを麻酔。 注：この研究で使用したマウスは4でした -7週齢と以下の株と遺伝子型の：のC57Bl6 / J野生型（ 図2Aと3A-Dでの実験）。 GAD67-GFP 24（ 図2Bおよび3E-Hでの実験）。 TAC2-Creを25（ 図2Cおよび3I-Jでの実験）。 </li><li>耳と目の間に頭を剃ります。綿棒を使って剃った頭に消毒剤（ベース - イオジン）を適用します。 </li><li>麻酔中に目の乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。皮下鎮痛剤（メロキシカムベースの5mg / mlの溶液0.1 ml）でマウスを注入します。 </li><li> （：保守のための酸素中2％イソフルラン）定位フレーム（ 図1A）でマウスを置き、ガス麻酔のマスクを介して麻酔を維持します。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。 注：全体の外科手術中に無菌状態並びに可能を維持します。使い捨てフェイスマスクを着用し、手術用外出WN、および手袋。 </li><li>はさみを使って頭の上に皮膚切開を行います。優しく、鈍鉗子を使用して、側に皮膚を引っ張って頭蓋骨の表面を露出するようにクランプで固定し、そしてH 2 O 2とクリーン頭蓋骨。 </li><li> （ 図1B）両半球のための先端の細い油性マーカーとドリル穴を使用して頭蓋骨上のマーク注射部位。 （ブレグマ（ミリメートル）から）この研究での注射のためにされている座標：のmPFC：0.3±横前方1.9、腹2.1。 MGM / PIN：1.8±横、3.0事後、腹側3.8。 mpITC / BLA：3.35、および4.75腹±横、1.45後部。 </li><li>圧力噴射装置に接続された定位フレーム上に充填されたガラスピペットをマウントし、ブレグマの位置にピペットをもたらします。 </li><li>ファインストレートチップピンセットを用いてガラスピペットの先端を折り。ウイルス溶液のエアロゾル発生を防止するために静かにこれを行います。いくつかの圧力パルスを印加し、ヴィルの液滴の押し出しを観察することにより、ピペットチップが開いていることを確認しますsのソリューション。 </li><li>目標噴射座標に移動し、圧力噴射装置で次の設定を使用してピペットコンテンツ（〜0.5マイクロリットル）の半分を注入：圧力：20 psiで、平均パルス長さ：30ミリ秒、パルスの平均数：50。 </li><li>それを後退ゆっくり（1ミリメートル/分）の前〜1分間の場所にピペットを残します。 注：必ずピペットは、他の半球で同じピペットで手順を繰り返す前にブロックされていないことを確認します。ブロックされたチップの場合には、クリーンまたは再びブレグマで先端とゼロピペット位置を断ちます。 </li><li> PBS（pH7.4）でクリーン頭蓋骨、一緒に皮膚を引っ張って、個々のボタンの縫合糸で切開部を縫合優しく、クランプを取り外します（3から4ノット）。傷の周りに消毒剤（ベース - イオジン）を適用します。 </li><li>麻酔を停止し、それが完全に目を覚ましになるまで無人マウスを放置しないでください。単一収容さを維持するか、完全に回復するだけで他の動物の会社に戻ります。術後、健康状態を監視し続ける、とadminisター鎮痛剤必要に応じて。地元の動物実験委員会が提案したルールに従って手順に従ってください。 </li></ol>急性スライスの調製<ol><li> ACSF、切削液、ツール（はさみ、メス、鉗子、へら、パスツールピペット）、および寒天ブロックを準備します。 注：人工脳脊髄液（ACSF）の1 Lは、実験ごとに必要であり、以前に公表16,23のように二重蒸留H 2 O中の化学物質を溶解することにより調製されます。切断溶液を2 M 硫酸マグネシウムストック溶液0.87 mlをACSF 200mlのを補充することによって調製されます。 </li><li>含酸素ACSFおよび95％O 2および5％CO 2を用いて実験を通して溶液を切断します。 </li><li>深くイソフルラン（酸素中3％）を使用して、小動物麻酔機を用いてマウスを麻酔。続行する前に肢引っ込め反射を使用して麻酔深度を確認してください。 </li><li>大きなハサミを用いてマウスを刎ねると、すぐに冷やします氷のように冷たい切削液中のヘッド。 </li><li>吻側に尾からの単一の正中切開によるオープン頭蓋骨と優しく鉗子を使用して、側面に頭蓋骨の部分を押してください。急速にそっと小さな丸いスパチュラを用いて頭蓋骨からそれを持ち上げることにより、脳を削除します。メスで小脳をカット。氷のように冷たい切削液に脳を置きます。 </li><li> mPFCの注射部位の場合：（のmPFC含む）メスを用いて脳の前部を切断し、スライスまで氷冷切断溶液に入れました。 </li><li>濾紙で余分な切削液を削除し、ビブラトームステージに脳の後部を接着。 </li><li>傾斜扁桃体スライスについては、35°の角度（ 図1D、中央）で切断寒天ブロック（4％）に脳を接着。冠状扁桃体スライス、MGM / PINの注射部位とのmPFCの注射部位については、ステージ上で直接脳を接着（ 図1D、左、右）。スライスしながら、安定性のための脳の後ろに追加寒天ブロックを配置します。 </li><li> Plac冷却ユニットを用いて4℃に維持する氷冷酸素切削液でチャンバー切削Eステージ。サファイアブレードを用いて扁桃体（320ミクロン）の急性スライスを準備します。室温で酸素ACSFに付属のインターフェースチャンバー内のスライスを配置します。 </li><li> 45分 - 急性扁桃体スライスの調製後、35スライスを回復するために、36℃の水浴中でインターフェースチャンバーを配置。その後、RTにインターフェースチャンバーを返します。これらのスライスから記録するために、ステップ3.2に進みます。 </li><li>急性扁桃体スライス（ - 2.9 2.8ステップ）のために、前述したようにステップ2.10の開始時には、注射部位のスライスをカット。水浴内のスライスの回復は、ここで必要とされていません。オプション：すぐに蛍光灯や適切なフィルターセットを搭載したステレオスコープ上のスライスを観察し、注射部位の位置を推定するために。 </li><li> 2濾紙とsubmer間を挟んで事後分析のための注射部位を含むスライスを修正しました。PBS溶液をO / Nで4％パラホルムアルデヒド（PFA）でそれらを銀杏。注射部位の分析のためのステップ4.1に進みます。 </li></ol>シナプス前繊維の3可視化と刺激<ol><li>繊維と細胞の光遺伝学活性化のためのパッチ顕微鏡を準備します。 <ol><li>光伝送路に取り付けられた発光ダイオード（LED）を中心。 </li><li>後焦点面でのLEDの光強度を測定し、470nmでの適切な波長を選択するパワーメータとの各目的の出力で。 </li><li>ミリワット/ mm 2での光強度を計算し、470 nmの波長の測定値のための各目的のための（光出力（ミリワット/ mm 2）と対LEDの輝度（％））の検量線を作成します。 </li></ol></li><li>蛍光ランプを備えた正立顕微鏡に装着スライスチャンバー内のインターフェース室と場所から急性扁桃体スライスを取得します。このようなSLICそのスライスを配置するように注意してくださいインターフェースチャンバーに上向きE面は、記録チャンバー内に上向きに向いています。 〜31℃の温度で2 ml /分 - 1の割合で新鮮な、酸素ASCFでスライスを灌流。 </li><li>発現される特異的蛍光タンパク質のための適切なフィルターセットとの組み合わせで蛍光灯を使用して、スライス内のシナプス前線維を観察します。概要（ 図1E）を得るために5倍対物レンズを使用し、対象領域内の繊維密度の評価のために60倍対物レンズ。 注：GFPとYFPの場合、使用フィルターセット「グリーン」（励起20分の472、ビームスプリッタ495、放射490 LP）mCherryをするために指定されているフィルタセット「赤」（励起40分の560、ビームスプリッタ585、放射70分の630）を使用します材料/機器テーブルインチ</li><li>開くか実験（ 図2D）のために所望のように顕微鏡光路の開口を制限します。 </li><li>パッチ記録を入手するには、内部溶液でパッチピペットを記入し、私はマウントn電極ホルダー。パッチピペットに正の圧力を適用し、ゆっくりとマイクロマニピュレーターを用いて、スライスに視覚的な制御の下で最初に浴溶液にした後、それを下げます。 <ol><li>サイドとトップからパッチピペットを用いて、関心のニューロンに近づきます。ピペットは、細胞の表面上にあるときに正の圧力を解放し（細胞表面上に目に見えるディンプル）と、負圧を適用することによって、「ギガシール」を得ます。 </li><li>全細胞記録を得るために、膜パッチを破壊するために、さらに吸引を適用します。続いて、細胞からの電気的応答を記録しながらCHR（470 nm）を活性化するための適切な波長を使用して接続したLEDとラベルされた繊維を刺激します。 </li><li>シナプス刺激のために、低いLED強度で開始し、所望のシナプス電流振幅に達するまで増加します。 図中の（タイミングやパルス長さを制御するためのデータ取得ソフトウェアでデジタル出力を設定することで、LEDの例をトリガー3）。 注：他のソフトウェア及び/又はTTL発生装置は、LEDをトリガするために使用することができます。 </li></ol></li><li>次に記録セルのためおよび/または特定の薬物の存在下で所望のように顕微鏡光経路におけるオープンまたは制限された開口部（ステップ3.4）で繰り返し刺激。 </li><li>記録した後、2枚の濾紙の間でそれらを挟んで、4％PFA O / Nでそれらを沈めることによって事後分析のためのスライスを修正します。 </li><li>電気生理学的データを分析します。 注意：使用して、適切なソフトウェアは、個々の刺激をオフライン用に記録されたスイープデータを視覚化します。薬物の効果を分析する場合、すべての個々のスイープのためのシナプス電流振幅に対する薬物効果の時間経過を得るために、ピーク検出ルーチンを使用します。薬剤効果が定常状態に達したときに決定します。実験条件ごとの平均≥10個々のスイープにソフトウェアを使用し、数値のための代表的な平均応答を準備する（CF 図3B-D、FH、J右パネル）。 注：いくつかの代替のソフトウェアパッケージは、データ分析のために使用することができます。 </li></ol> 4.注射部位の事後分析<ol><li> （再イメージングは​​、ステップ3.7から、所望される場合）PBS中で3回の部位を記録する（ステップ2.12から）注射部位のスライスを洗ってください。これは、繰り返し10分間回転シェーカー上に新鮮なPBSで3回溶液を交換することによって行われます。 </li><li> PBS中の2％寒天溶液を調製し、そしてそれは〜65℃に冷却しましょう​​。小さな直径30mmのペトリ皿の底に平らな場所スライスは、寒天内のスライスを埋め込み、それが固体になるまで冷却しましょう​​。 </li><li>ビブラトームのステージに埋め込まれたスライスまたはスライスと寒天ブロックを接着し、PBSでチャンバーを切断内のステージを配置します。 </li><li>切除70μmの厚さにスライスを埋め込まれました。オプション：切除した後、切片を細胞構築（ 図3A、C）、および/ ​​またはBを明らかにするNeurotraceと、 すなわち 、染色することができますYFPまたはmCherryをするためのyの免疫蛍光染色は、CHR融合タンパク質からの信号をブーストします。 </li><li>取り付けメディアとスライドとカバースリップ上のマウントスライス。画像注射部位と、所望であれば、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡（ 図2A-C）を用いて、投影領域内の繊維を含む、画像スライス。 </li></ol>

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</ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

このプロトコルは、すべてではない簡単に、最も上に実装することができ、神経回路やローカル接続のex vivo光遺伝学調査のための方法を説明し、落射蛍光光ポートのLED〜470 nmのとそれらを装備することにより、直立スライスパッチクランプ記録のセットアップ。スライスにおける軸索突起の光遺伝学刺激の主な利点は、対応する線維路が明確に定義されていない、またはに保存されな...

可視化および脳領域および神経細胞の特定のタイプとの間の特定の接続の同時活性化のための正確なツールは、健康な脳機能及び疾患状態の根底にある機能的接続性を理解する上でより重要になってきています。理想的には、これは、ニューロンが通信識別される正確なシナプス特性の生理学的な調査を必要とします。これは、単一の急性脳スライスに保存することができない脳の領域間の接続に特に当てはまります。過去において、これは、主に別の実験で達成されました。一方、 生体内で注入された神経トレーサーは、後続の光や前およびシナプス後パートナーの電子顕微鏡分析と組み合わせて使用されてきました。原点の領域からの線維トラクトがスライス標本に保存し、アクセスされたとき一方、電気刺激は、標的領域内の細胞とシナプス通信メカニズムを評価するために使用されています。 彼らの可視化を可能にし、事後解剖学的分析の1-ながら、光遺伝学の出現により、蛍光タンパク質に融合したようなChannelrhodopsins（CHRS）などの光依存性陽イオンチャネルの標的発現は、今ニューロンとその軸索軌道の活性化を可能にします4。線維路が分離または特定の軌道ではないので、1）従来の電気刺激によるアクセスできませんでした脳領域からの入力を評価：親細胞体5から切断場合でもCHRを発現する軸索は刺激することができるので、それはに脳スライスで可能です不明です。 2）明確に想定するが完全には理解された特定の入力の出身地域を特定します。そして、3）の両方のローカルおよび長距離の突起で、定義された細胞型の間の機能の接続性を調べます。そのため、多くの利点を、脳スライス内の回路のこの光遺伝学マッピングは、ワイドになっていますlyが最後の年で使用され、蛍光タグ付きCHRSの発現のための種々のウイルスベクターは、商業的な供給業者から容易に入手可能です。電気刺激はまた、通路または他の近くの細胞、および均等に迅速かつ時間的に正確な刺激の繊維を募集する可能性があるため、従来の電気刺激を超える光遺伝学活性化のいくつかの重要な利点は、刺激電極の配置、繊維の刺激の特異性に起因する組織への損傷はありません。さらに、ウイルスベクターの定位注射を容易Cre依存の発現および/ ​​または特異的プロモーター7を用いて達成することができる特定の脳領域6及び条件または細胞型特異的発現を標的とすることができます。ここでは、この技術は、恐怖システムにおける長距離のマッピングとローカル回路に印加されます。 扁桃体は恐怖と感情的な思い出8,9の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。別にあちこち扁桃体、内側前頭前皮質（のmPFC）および海馬（HC）のmは、相互に扁桃体に接続されている構造は、恐怖や絶滅思い出10,11の買収、統合と検索の側面に関与しています。 mPFCの細分化における活性は12,13を述べてハイとローの両方の恐怖を制御する際に二重の役割を果たしていると思われます。これは、一部には扁桃体の活動と出力を制御することになる扁桃体へのmPFCからの直接接続によって媒介される可能性があります。そのため、最後の年に、いくつかの研究では、扁桃体14-17でのmPFCの求心性および特定の標的細胞間のシナプスの相互作用を調査するためにex vivoでスライス実験で始まりました。 恐怖学習中は、エアコンと無条件刺激についての感覚情報は、特定の視床と皮質領域からの突起を介して、扁桃体に到達します。 basolの側部（LA）内のニューロンへのこれらの入力の可塑性ateral扁桃体（BLA）が恐怖条件9,18の基礎となる重要なメカニズムです。増加する証拠は、扁桃体における並列プラスチックプロセスが恐怖記憶19を制御するための阻害要素を伴うことを示唆しています。クラスタ化された抑制性ニューロンのグループは、GABA作動性内側paracapsularインターカレーション細胞（mpITCs）であるが、その正確な接続性と機能が不完全20-22を理解されています。ここでは、光遺伝学の回路マッピングはmpITCsは視床と皮質中継局23からの直接の感覚入力を受け取ることを実証し、求心性および遠心性これらの細胞の接続と扁桃体における標的ニューロンへの影響を評価するために使用されます。 mpITCsまたはBLAニューロンにおけるCHRの特異的な発現を効果的BLAの活性を制御新規フィードフォワードとフィードバック抑制回路に置く、mpITCsを阻害することを明らかにし、局所的相互作用のマッピングを可能にするだけでなく、相互にBLA校長ニューロン、によって活性化されます23。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Steretoxic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)&amp;nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)&amp;nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectant</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointment</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Recordings, light stimulation, and analysis&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>artificial cerebrospinal fluid (ACSF)</td><td>for composition see references #16 and #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>internal patch solutions</td><td>for composition see references #16 and #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnesiumSulfate Heptahydrate</td><td>Roth, Germany</td><td>P027.1</td><td>prepare 2M stock solution in purified water</td></tr><tr><td>Slicer, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Cooling unit for tissue slicer, CU65</td><td>Fisher Scientific, Germany</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire blade</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>custom order, inquire with company</td></tr><tr><td>Stereoscope, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Patch microscope, BX51WI</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B patch amplifier&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PClamp software, Version 10</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>used to control data acquisition and stimulation</td></tr><tr><td>Bath temperature controler, TC05</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Three axis micromanipulator Mini 25</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator controller SM7</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann, Germany</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>glass capillaries for patch pipettes</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber&amp;nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>LED unit, CoolLED pE</td><td>CoolLED, UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>LED unit, USL 70/470</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>L70-000</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>Dual port adapter</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>inquire with company</td><td>CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation</td></tr><tr><td>Filter set red (excitation)</td><td>AHF, Germany</td><td>F49-560</td><td>Filters can be bought as set F46-008</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (beamsplitter)</td><td>AHF, Germany</td><td>F48-585</td><td>Filters can be bought as set F46-008</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (emission)</td><td>AHF, Germany</td><td>F47-630</td><td>Filters can be bought as set F46-008</td></tr><tr><td>Filter set green (excitation)</td><td>AHF, Germany</td><td>F39-472</td><td>Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (beamsplitter)</td><td>AHF, Germany</td><td>F43-495W</td><td>Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; (emission)</td><td>AHF, Germany</td><td>F76-490</td><td>Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)</td></tr><tr><td>LaserCheck, handheld power meter</td><td>Coherent, USA</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, Version 6</td><td>Wavemetrics, USA</td><td></td><td>for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neuromatic suite of macros for IgorPro</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com</td><td></td><td>for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Post hoc analysis of injections and projections&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde powder (PFA)</td><td>Roth, Germany</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar for embedding and resectioning</td><td>Roth, Germany</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>30 x 10 mm petri dishes for embedding</td><td>SPL Life Sciences</td><td></td><td>alternatives can be used</td></tr><tr><td>Slides, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Germany</td><td>61303802</td><td>alternatives can be used</td></tr><tr><td>cover slips</td><td>R. Langenbrinck, Germany</td><td>3000302</td><td>alternatives can be used</td></tr><tr><td>Vecta Shield mounting medium</td><td>Vector Laboratories, USA</td><td>H-1000</td><td>alternative mounting media can be used</td></tr><tr><td>cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germany</td><td>11406--25------N</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710</td><td>Zeiss, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices

光遺伝学のアプローチは、現在広く光によって光活性化タンパク質と神経活動のその後の操作の標的発現を組み合わせることにより、神経集団や回路の機能を研究するために使用されています。 Channelrhodopsins（CHRS）は、光依存性カチオンチャネルであり、蛍光タンパク質に融合させたときに、それらの発現は、視覚化し、特定の細胞型の同時活性化と脳の定義された領域での軸索投射を可能にします。ウイルスベクターの定位注射によって、CHR融合タンパク質は、構成的にまたは条件規定された脳領域の特定の細胞で発現することができ、それらの軸索突起は、その後、脳切片におけるエクスビボ光遺伝学の活性化を介して、解剖学的及び機能的に研究することができます。従来の電気刺激の方法で対処することができなかった接続のシナプスの性質を理解することを目的とする場合に、または新規affeを識別する際に特に重要です以前に十分に理解された家賃と遠心性接続。ここでは、いくつかの例は、この技術が扁桃体に恐怖関連の回路の解明にこれらの質問を調査するために適用することができる方法を示しています。扁桃体は恐怖と感情的な思い出の取得と恐怖の表情、およびストレージのための重要な領域です。証拠の多くの行は、内側前頭前皮質（のmPFC）は恐怖の取得と絶滅のさまざまな側面に関与するが、扁桃体との正確な接続がちょうど理解され始めていることを示唆しています。まず、光遺伝学活性化は基底扁桃体（BLA）中のmPFCの求心性と標的細胞との間のシナプス伝達の側面を研究するために使用することができる方法をex vivoで示されています。また、このエクスビボ光遺伝学アプローチは、扁桃体においてGABA作動性ニューロンのグループを使用して新規の接続パターンを評価するために適用することができる方法を説明するが、一例としてparacapsularインターカレー細胞塊（mpITC）。

このセクションでは、ex vivo光遺伝学アプローチと感覚と調節長距離BLAとmpITCニューロンへの突出部だけでなく、mpITCとBLA間のローカル接続のプロパティの生理学的特性を調査するために、異なる実験戦略の代表的な結果のワークフローを示しています。 マウス脳への所望の座標に選択されるウイルスベクターの定位...

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Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

15.9K ビュー.  University of Tuebingen. 光遺伝学アプローチは広く神経活動を操作し、脳機能の影響を評価するために使用されます。ここでは、この技術は、光活性化剤チャネルロドプシンのインビボでの発現の際に、恐怖に関連する回路内の特定の長距離およびローカル神経接続のシナプス特性のex vivo分析を可能にすることが概説されています。 

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Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

神経科学

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Optogenetic Activation of Afferent Pathways in Brain Slices and Modulation of Responses by Volatile Anesthetics

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect distinct cellular and network components of these circuits remains unclear. Ex vivo brain slices provide a means by which investigators may probe discrete components of complex networks and disentangle potential mechanisms underlying the effects of volatile anesthetics on evoked responses. To isolate potential cell type- and pathway-specific drug effects in brain slices, investigators must be able to independently activate afferent fiber pathways, identify non-overlapping populations of cells, and apply volatile anesthetics to the tissue in aqueous solution. In this protocol, methods to measure optogenetically-evoked responses to two independent afferent pathways to neocortex in ex vivo brain slices are described. Extracellular responses are recorded to assay network activity and targeted whole-cell patch clamp recordings are conducted in somatostatin- and parvalbumin-positive interneurons. Delivery of physiologically relevant concentrations of isoflurane via artificial cerebral spinal fluid to modulate cellular and network responses is described.

Ex vivo brain slices can be used to study the effects of volatile anesthetics on evoked responses to afferent inputs. Optogenetics are employed to independently activate thalamocortical and corticocortical afferents to non-primary neocortex, and synaptic and network responses are modulated with isoflurane.

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

Anesthetics influence consciousness in part via their actions on thalamocortical circuits. However, the extent to which volatile anesthetics affect ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

An Electrophysiological Study of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapses in Mouse Brain Slices

Source: Chen, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59680">Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function.</a> J. Vis. Exp. (2019).
The video describes the electrophysiological recording of retinogeniculate and corticogeniculate synapses in mouse brain slices. The slices containing the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) are placed in a recording chamber. A stimulating pipette is positioned on either the optic tract to stimulate retinal ganglion cells (RGCs) and investigate retinogeniculate synapses or the nucleus reticularis thalami to stimulate cortical neurons and investigate corticogeniculate synapses. Upon stimulation, the RGCs and cortical neurons release excitatory neurotransmitters, which produce synaptic currents in the LGN relay neurons. These currents are recorded using a patch-clamp recording pipette.

マウス脳切片における網膜形成型および皮質形成型シナプスの電気生理学的研究

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Solutions

	Dissection solution
	
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Electrophysiology Techniques

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

Source:&#160; Murphy, C. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61333">Optogenetic activation of afferent pathways in brain slices and modulation of responses by volatile anesthetics.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
...

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

マウス脳からの傾斜扁桃体スライスの生成

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

	...

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

要約

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Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

エクスビボ内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

マウス脳切片における網膜形成型および皮質形成型シナプスの電気生理学的研究

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

マウス脳からの傾斜扁桃体スライスの生成

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

要約

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Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

その場で 急性 エクスビボ 胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

マウス脳切片における網膜形成型および皮質形成型シナプスの電気生理学的研究

脳切片中の神経細胞の光学的および電気生理学的同時モニタリング

マウス脳からの傾斜扁桃体スライスの生成

その場で急性エクスビボ胚性脳スライス培養における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの可視化

エクスビボ内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ