軸索が複雑な中枢神経系マトリックスをどのようにナビゲートするかは、神経生物学における基本的な問題である。このプロトコルは、高解像度イメージングによる生理学的環境における軸索成長および成長円錐ダイナミクスの研究を可能にする。このプロトコルは、マウス胚性脳におけるDNAの送達のためのユーザーフレンドリーなエンドツーエンドパイプライン、高品質の有機型スライスの準備、および画像取得および分析のためのステップバイステップガイドを記述しています。
もともとは胚性中枢神経系における軸索ダイナミクスを研究するために設計されていたが、このプロトコルは、外傷性または病理学的状態後の器官型培養および軸索可塑性の視覚化を可能にするように調整することができる。プロトコル自体は比較的簡単です。しかし、脳構造の最初のラベリングと保存を達成することは重要なポイントです。
したがって、エレクトロポレーション、脳解剖、およびスライスのステップには特別な注意が必要です。手順のデモンストレーションは役に立ち、博士課程の学生はブラケットの研究室の出身です。妊娠中の雌マウスを麻酔した後、温かい生理食塩水または鉗子に浸した綿芽を使用して両方の子宮角を引き出す切開を行い、胚の間の空間を慎重につかむ。
その後、湿ったガーゼの上に胚を置きます。子宮嚢を切り開いた後、各胚を除去する。胚を、氷上のグルコースを添加したHBSSを含む10センチメートルの皿に入れる。
元子宮エレクトロポレーションのために、胚を拾い上げてホルダーに入れます。次に、DNAファストグリーンミックスを含むガラスキャピラリーを胚頭蓋骨を通して側脳室に慎重に挿入し、DNAプラスミドミックスを各心室に2〜3マイクロリットル注入する。次に、胚の頭を白金ピンセット電極の間に適切な角度で保持して、所望の脳領域を標的とし、陰極をDNA転写が意図される領域に向ける。
子宮エレクトロポレーションでは、子宮の角を引き出し、前述のように胚を湿ったガーゼの上に置いた後、指先を使用して、子羊矯正縫合糸とたるみ縫合糸が見つかるまで子宮内で胚を静かに回転させます。次に、DNAファストグリーンミックスを含むガラスキャピラリーを子宮壁および胚頭蓋骨を通って側脳室に慎重に挿入し、DNAプラスミドミックスの2〜3マイクロリットルを、必要に応じて片方または両方の心室に、心室あたり最大2マイクロリットルで注入する。注射後、胚の頭を白金ピンセット電極の間に適切な角度で保持し、DNA移植が意図されている領域に陰極を向けて所望の脳領域を標的とする。
必要な胚がすべてエレクトロポレーションされたら、生理食塩水に浸した綿棒を使用して、子宮の角を腹腔内に静かに戻します。5-0の縫合材料を用いて筋肉および皮膚切開部を縫合し、次いで縫合クリップを用いて創傷を固定し、ベタジンを噴霧することによって創傷を消毒する。マウスを回復ケージに戻し、遠赤外線加温光を使用して、処置後に少なくとも20分間暖かさを維持します。
解剖顕微鏡下で胚の頭を固定する。次に、頭の付け根から鼻に向かって正中線に沿って切断することによって、頭蓋骨の皮膚を除去します。頭蓋骨の皮膚を横方向に剥がし、脳を切除するのに十分な大きさの隙間を作ります。
次に、無菌解剖ハサミの閉じた先端を嗅球の下から脳幹に向かって移動させて挿入して脳を取り外す。その後、脳幹を切り取り、脳の周りの髄膜の多くの緩い部分をトリミングします。穴あきスプーンを使って脳を拾い上げ、スプーンの底を乾いたティッシュペーパーに叩きつけて余分な液体を取り除きます。
その後、氷の上のアガロース皿に脳を置きます。次に、小さなスプーンを使用してアガロースを10秒間混ぜて冷却し、脳を皿の真ん中まで動かし、背側を上にして水平に置き、あらゆる方向からアガロースで完全に覆われていることを確認します。Vibratomeワークステーションからアガロースブロックを優しく拾い上げ、ティッシュペーパーに軽く叩いて底を乾かします。
次に、脳の吻側を上に向けて標本ホルダーの接着領域にブロックを置き、試料ホルダーを氷の上に置きます。接着剤を1分間乾燥させます。脳をコロナスライスで15度の角度で切断する。
その後、きれいなヘラを用いて、脳スライスを収集し、パラフィンを用いて35ミリメートルのガラス底皿に固定化したPTFE膜上にそれらを置く。膜ごとに最大5つの脳スライスを収集します。次に、200マイクロリットルのピペットを用いて、スライスを半乾燥させたまま、膜上のスライスの周囲から過剰なHBSSグルコース溶液を除去し、次いで、500マイクロリットルの予め加温したスライス培地を膜の下の空間に直接加え、5%の二酸化炭素と共に摂氏35度でスライスをインキュベートする。
軸索の成長をイメージングするために、低~中程度の細胞密度を有する皮質領域を見つける。成長円錐ダイナミクスを画像化するために、皮質の即時ゾーンまたは脳室下ゾーンに成長円錐の位置を特定する。次に、Z スタックサイズを定義します。
大きなZスタック内の軸索成長の場合、ステップサイズを2マイクロメートルに設定し、より小さなZスタック内の成長円錐の場合、ステップサイズを1マイクロメートルに設定する。データ分析を行うには、[ファイル] をクリックしてフィジーの画像ファイルを開き、次に開いて画像を選択します。画像をクリックしてタイムラプスの最大強度投影を取得し、その後にスタック、Z投影、最大強度投影を続けます。
タイムラプスを通過し、成長している軸索を見つけます。位置が見つかったら、最初のフレームの軸索の先端から始まり、時間経過全体を通して軸索をたどり、成長する軸索に線を引きます。次に、プラグインkymoをワイドに再スライスして歌います。
キーモグラフのスケールを設定するには、画像に移動してからプロパティに移動します。距離をマイクロメートル単位、ピクセル幅と時間を秒または分単位、ピクセルの高さで設定した後、分析に移動して[測定]をクリックします。成長円錐の体積を測定するには、画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開き、ファイルをクリックして開き、目的のファイルを選択します。
次に、手順 1 で [新しいサーフェスの追加] ウィザードを選択し、アルゴリズム設定で対象領域のみをセグメント化し、手順 2 で、すべてのフレームの成長円錐全体に収まるようにフレームをトリミングします。次にステップ3で、閾値を絶対強度に保ち、ステップ4で、成長円錐領域全体が閾値化されていることを確認する。次に、ステップ5で、フィルタタイプの下でボクセルLMGの数を1つに選択します。
「実行」(Execute) ボタンを選択してすべての作成ステップを実行し、新規サーフェスの追加ウィザードを終了します。最後に、ウィザードウィンドウの上部にある統計タブで、詳細タブで特定の値とボリュームを選択します。典型的には、子宮内または子宮外エレクトロポレーションのいずれかに由来する首尾よく培養された脳スライスは、正常な細胞分布および頂端配向したピロ接触プロセスを有する放射状グリアの組織化された配列を示す。
時折、元子宮エレクトロポレーションが放射状グリア足場および培養脳スライスに顕著な障害を観察し、この対照染色を推奨する。Lyn-mNeonGreenを発現する代表的な錐体皮質突出ニューロンとその成長円錐の動的挙動がここに示されている。さらに、ニューロンをアクチンプローブを発現するプラスミドを用いて標識し、その場で軸索成長円錐のアクチン動態を分析した。
また、in situ実験は、プラスミド設計を発現するデュアルcre dre蛍光色素を用いても実施され、tRFPまたはZsGreen蛍光色素は、隣接するニューロンにおいてそれぞれdreまたはcreリコンビナーゼのいずれかによって特異的かつ個別に活性化され得る。キモグラフから、いくつかの軸索の成長速度および経時的な成長円錐体積などの動的成長パラメータが容易に得られる。これは、アクチントレッドミリングの速度および成長円錐探索活動中の糸状体と層状突起との間のバランスを評価するために使用することができる。
脳の構造を維持し、プラスミド濃度を微調整してまばらな標識を達成することが重要です。これは、皮質内の軸索および成長円錐を正確に視覚化するために重要である。選択された血漿および遺伝的背景に応じて、このプロトコルは、ユーザーがニューロンまたはそれらが成長する環境を変更することを可能にし、幅広い研究を可能にする。
その場でニューロンへの高解像度アクセスを可能にすることにより、この技術は、神経科学者が形態学的および分子的レベルの両方で成長円錐と中枢神経系メトリックとの間の動的相互作用を調査することを可能にする。
