Name: in situ characterization of hydrated proteins in water by salvi and tof-sims
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS at JoVE.com

We are grateful to the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development (CII-LDRD) and Materials Synthesis and Simulation across Scales (MS3) Initiative LDRD fund for support. Instrumental access was provided through a W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) Science Themed Proposal. EMSL is a national scientific user facility sponsored by the Office of Biological and Environmental Research (BER) at PNNL. The authors thank Mr. Xiao Sui, Mr. Yuanzhao Ding, and Ms. Juan Yao for proof reading the manuscript and providing useful feedback. PNNL is operated by Battelle for the DOE under Contract DE-AC05-76RL01830.

サルヴィマイクロチャネルの1クリーニングと滅菌<ol><li>サルヴィにおけるマイクロチャンネルの滅菌<ol><li> 、シリンジに70％エタノール水溶液2mlを描くサルヴィの入口端でシリンジを接続し、ゆっくりと10分間で液を1ml注入。注射の終了時に注射器を取り外します。次に、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）ユニオンを使用してサルヴィの入口と出口を接続します。代わりに、同じ手順を行うためにシリンジポンプを使用しています。たとえば、100μL/分での流速を設定します。 </li><li> 4時間室温で70％のエタノール溶液で満たされたサルヴィマイクロチャネルを保管してください。 </li></ol></li><li>サルヴィに脱イオン（DI）水を導入<ol><li> 、シリンジに滅菌DI水の2ミリリットルを描くサルヴィの入口で注射器を接続し、ゆっくりと10分内の液体の1ミリリットルを注入。シリンジを取り外し、およびPEEKユニオンを使用してサルヴィの入口と出口を接続します。で述べたように、交互に、シリンジポンプを使用しステップ1.1.1。 </li></ol></li></ol>サルヴィにおけるタンパク質フィルムの2の固定化<ol><li>サルヴィにタンパク質フィルムを固定化<ol><li>ゆっくりと、10分に液体の1ミリリットルを注入シリンジを取り外し、入口を接続し、サルヴィの入口で注射器を接続し、シリンジにフィブロネクチンの2ミリリットル（リン酸緩衝生理食塩水、PBS中10μg/ mlの）ソリューションを描きますそして、PEEKユニオンを使用してサルヴィの出口。 </li><li>サルヴィをインキュベート12時間室温でフード内で皿を維持し、クリーンな培養皿にフィブロネクチン溶液で満たされました。 </li><li>シリンジに滅菌DI水の2ミリリットルを描き、サルヴィの入口で注射器を接続します。ゆっくりと、10分間で水1ミリリットルを注入シリンジを取り外し、サルヴィの入口と出口を接続します。 注意：光顕微鏡を備えた場合は、このSiN膜は、TOF-SIMS分析の前に完全であることを確実にするために、顕微鏡下でサルヴィを確認してください。今サルヴィデバイスがのために準備ができているTOF-SIMSalysis。 </li></ol></li></ol> 3. TOF-SIMSロードロックチャンバ内にサルビをインストールします。 注：サルヴィデバイスを処理し、表面分析の間に潜在的な汚染を避けるために、TOF-SIMSのステージにそれをインストールする際に手袋を常に着用します。 <ol><li>ステージ上にマウントサルビ<ol><li>平らで清潔な表面にTOF-SIMSのステージを置きます。上向きにシリコンウェハとSiN膜とステージ上にサルヴィデバイスを置きます。 4金属製のクランプ片を用いサルビを修正し、4本のネジにより金属板にデバイスの角を保持する金属片をねじ込みます。 </li><li>静かにマイクロ流体チャネルに接続されたPFTEチューブをロールアップ。硬い部分を長押しする4つの金属片と4本のネジを使用してください。それは分析中に一次イオンビームと干渉しないように、デバイスをSIMSステージ上のオープンスペースに配置されていることを確認します。サルヴィfabricatの追加の画像およびイラストイオンとインストールは、以前の出版物でご利用いただけます。8,9,11 </li></ol></li><li>ステージ上にファラデーカップをマウントします<ol><li>ネジで、ステージ上のファラデーカップを修正しました。 </li></ol></li><li> TOF-SIMSロードロックチャンバ内にステージをロード<ol><li> 、TOF-SIMSのロードロックを開いて保持し、荷台の上に水平にステージを設定し、ロードロックのドアを閉じます。 </li></ol></li></ol> 4. TOF-SIMSデータ集録<ol><li> （10 -6ミリバールまたはトルのオーダーで、 例えば ）真空ポンプの電源をオンにし、適切な真空を確保するためには、ロードロックチャンバに到達します。 </li><li>真空は、約30分後に安定化されると、主室にサルヴィを移動します。 注：真空は、データ取得時のメインチャンバー内の5×10 -6ミリバールの真空よりも低くなければなりません。そうでなければ、より高い真空サルヴィシステムにおける漏れを示します。 </li><li>でTOF-SIMSの一次イオンビームとアナライザを調整します製造業者の推奨に従って、約400nmの空間分解能。サイクル時間は、DCモードで30マイクロ秒であるが、一次ビームの電流1,200ペンシルバニア。 注：このプロセスは、主にメーカーの推奨に従っています。 </li><li>光学顕微鏡を用いて、マイクロ流体チャネルを探します。基準となる光学像の中心を使用し、二次イオン像の中心と一致するように、それを揃えます。 </li><li>各測定の前に、表面汚染を除去するために〜15秒500×500μmの2エリアでのSiNウィンドウにスキャンする1キロ電子ボルトのO 2 +ビーム（〜40 NA）を使用します。また、すべての測定中に表面の帯電を補償するために、電子フラッド銃を使用しています。このステップのデフォルトモードでフラッドガンの自動機能を使用してください。 </li><li>データ収集の前に正または負のモードを選択します。すべての測定における一次イオンビームとして25 keVのバイ3 +ビームを使用してください。 注：手順は、同様のFですまたは正と負のデータ取得。スペースの関心については、ポジティブモードは、ここで詳細に説明されています。 <ol><li>デプスプロファイリング<ol><li> 32ピクセルの解像度によって32ピクセルで〜2ミクロンの直径を有する円形のエリアでのBi 3 +ビームを走査します。 </li><li>パンチスルーするのSiN膜に必要な時間を最小限に抑えるために、長いパルス幅を使用する（ すなわち 、180ナノ秒、100マイクロ秒のサイクルタイムでのビーム電流〜1.0 PA）のBi 3 +ビーム。液面の上昇からの二次イオンを表すの強度は、パンチスルーが達したとき。パンチスルー時間は、このSiN膜のバッチに応じて、300秒から500秒まで変化します。 注：この違いは、我々の経験に応じて取得したSiN膜のバッチに関連すると思われます。しかし、パンチスルー時間は本当にデータ分析には影響を与えません。 </li><li>このSiN膜のパンチスルーした後、約200秒で同じ最新の状態に保ちます2D画像再構成のための十分なデータを得ます。 </li><li>優れた質量分解能でスペクトルを取得するために、データ収集のために80ナノ秒にパルス幅を減らします。さらに約200秒間、この買収を続けます。 図1に示されたスペクトルデータは、この領域から得られます。 </li></ol></li><li> 2Dイメージングおよび質量スペクトル<ol><li>プロファイリングデータを深さを測定すると同時に、2Dイメージングおよび質量スペクトルデータを収集します。 TOF-SIMSの測定器は、実験中に各スポットのすべての情報を保存します。 （ - スペクトル、FPanel - プロファイルとFPanel - 個別に画像FPanel）デジタル制御ソフトウェアのデータが別のウィンドウに表示されています。慎重にデータ取得時に各パネルのデータを確認してください。 </li></ol></li></ol></li></ol> 5. TOF-SIMSデータ解析注：データ解析は、最初IonToF TOF-SIMS楽器ソフトウェアを使用して行われます。 <ol><li> ANを開きます。次いで、SIMS（測定エクスプローラ）とのalysisソフトウェアは、深さプロファイルのm / zスペクトル、及び画像データを処理するために、それぞれ、「プロファイル」、「スペクトル」と「画像」ボタンをクリックします。 </li><li>拡張子「.ita」を持っているデータファイルを開きます。 </li><li>関心のピークを選択し、「イオン」ボックスに種名を入力し、スペクトルの異なる色でそれらにラベルを付けます。 x軸に沿ってドラッグして、マウスのスクロールホイールを使用してください。ピーク高さと幅を調整するには、Ctrlとスクロールホイールを使用してください。 y軸に沿ってリニアとログモード間の文字「L」スイッチ。 </li><li>質量校正前にデータの再構築を行っています。それ以外の場合は、質量較正ステップのピーク間の間隔を選択することは困難です。 <ol><li>関心の深さプロファイリングデータを選択し、深さプロファイル時系列に従ってスペクトルを再構築します。 </li><li>復興ボタンをクリックします。 int型の走査範囲で「スタート復興」ウィンドウで、タイプerest。深さプロファイルデータを再構築するために「OK」をクリックします。 </li></ol></li><li>質量キャリブレーションを実行します。押して「F3」は「質量キャリブレーション」ウィンドウを開きます。 。特定のサンプルに基づいて、本研究では21を校正するためのピークを選択して、CH 3 +（のm / z 15）、H 3 O +（のm / z 19）以下のピークを使用し、C 2 H 5 +（のm / z 29 ）、H 5 O 2 +（M / Z 37）、C 3 H 7 +（M / Z 43）、H 7 O 3 +（M / Z 55）、H 9 O 4 +（M / Z 71） H 11 O 5 +（のm / z 99）とポジティブモード用H 13 O 6 +（のm / z 109）。以下のピークCH使用- （のm / z 13）、O - （のm / z 16）、OH - （のm / z 17）、C 2 H - （のm / z 25）、C 3 H - （のm / z 37）、およびC 4 H - （M / Z 49）ネガティブモードで。 <ol><li>ピークを選択し、下向きの矢印は、ウィンドウの左下隅にあるピークに指摘されていることを確認してください。そのピークをクリックして、「質量キャリブレーション」ウィンドウ内のピーク名を入力し、「追加」をクリックし、目的のイオンは、質量キャリブレーションに含まれています。 </li><li>最後に、「再校正」ボタンをクリックします。ピークの面積は電荷比、それらの質量に応じて適切な場所にあるかどうかを確認してください。 「スペクトラム」メニューで、選択して行われている特定の分析に応じて、「すべてのスペクトル」または「選択したスペクトル」に「マスキャリブレーションの適用」をクリックします。 </li></ol></li><li>ピーク選択は、サンプル分析のために必要であるように、文学や他の以前の知見によれば、試料の特徴的なピークを決定します。 m / zスペクトルにおける関心のピークの強度を比較してください。必要に応じて、ピークリストに無用なピークを新たなピークを追加または削除。 <ol><li>ピークを追加します。左下のウィンドウに赤い線を見つけ、ピークをクリックします。ホルDの &quot;Ctrl&quot;キー、自動的にピークリストにピークを追加してピーク幅を、定義するために水平方向にマウスをスクロールします。ピークを追加するもう1つの方法は、メインスペクトルウィンドウでピークを選択するために、次にウィンドウの上に「ピークを追加」ボタンをクリックすることです。 「スペクトラム」メニューで、追加する多くのピークがある場合は、「検索ピーク」を選択し、必要に応じてその後のピークを追加し、新しく開いたウィンドウに関連する仕様をご確認ください。 </li><li>ピークリストをエクスポートするには、「ピークリスト」メニューで、「保存... &quot;&quot; itmil」形式のピークリストを選択します。スペクトルに沿ってドラッグするCtrlキーと左ボタンを使用してください。スペクトルウィンドウで、関心のピークを選択し、望ましい位置に2本の破線をドラッグします。 </li><li>ピークリストをインポートするには、「マス間隔リスト」メニューで、「インポート...」を選択し、ファイル拡張子「.ITPL」で、既存のピークリストファイルを探します。 「開く」をクリックしてください。 </li><li>で、「itmil「ピークリストを使用するには「マス間隔リスト」メニューには、「開く...」をクリックし、ファイルを検索し、「開く」をクリックします。 </li></ol></li><li>さらに、データを分析するために、ピークリストを適用します。 「スペクトル」ウィンドウの左底部には、「マス間隔リスト」と呼ばれるウィンドウがあります。インポートされたピークリストは、ここに示されています。 <ol><li> 、使用されるピークリストファイルを右クリックし、「アクティブスペクトル」または「全てのスペクトル」に適用します。 </li></ol></li><li>データプロファイルを表示します。 「プロファイル」ウィンドウで、使用して文字「M」は、y軸に合うようにウィンドウ（フルレンジ）と文字「N」にフィットします。プロファイルの幅を調整するには、Ctrlとスクロールホイールを使用してください。または、「/」を使用し、y軸の範囲と高さを変更するためにキーボード上の「*」。 </li><li>さらに、初期分析後、他のグラフィックソフトを使用してプロットするためのデータをエクスポートします。 <ol><li> 「ファイル」メニューをクリックし、「プロファイル」ウィンドウで、深さプロファイルをエクスポートするには、「エクスポート＆＃を選択その後、34 ;,および「.txtの「ファイル」として保存」を選択します。 </li><li> 、「スペクトル」ウィンドウで、のm / zスペクトルファイルを書き出す「ファイル」メニューをクリックし、次に「エクスポート」を選択し、「.txtの「ファイル」として保存」を選択します。 </li><li> 「イメージ」ウィンドウ、印刷画面では、画像ファイルをエクスポートし、画像ファイルとして保存します。 </li></ol></li></ol> 6. TOF-SIMSデータプロットとプレゼンテーション注：SIMSデータは、楽器のソフトウェアを使用して処理された後、データをプロットするグラフィックツールを使用します。 <ol><li>データをインポートするグラフィックツールを使用します。 </li><li>再構成されたスペクトルを示すために、y軸とx軸とのピーク強度としてのm / zを使用してプロットをします。例えば、図1に示されています。 </li><li>再構成された深度プロファイル時系列を表示するには、y軸とx軸とのピーク強度として、スパッタ時間を使ってプロットをします。例はFiguに与えられています2再。 </li><li>異なるのm / zの再構成された2次元画像を合成し、イオンマッピングを表示するマトリックスを形成します。例が図2に示されています。 </li></ol>

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+plasma+proteins+and+fibronectin+on+poly(hydroxylethyl+methacrylate)+brushes+of+different+thickness+and+their+relationship+with+adhesion+and+migration+of+vascular+smooth+muscle+cells.">Adsorption of plasma proteins and fibronectin on poly(hydroxylethyl methacrylate) brushes of different thickness and their relationship with adhesion and migration of vascular smooth muscle cells.</a> Regen Biomater. , 17-25 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

サルヴィは、TOF-SIMS、走査型電子顕微鏡（SEM）等の真空ベースの機器によって動的液面と液体 - 固体界面の分析を可能にするマイクロ流体インターフェースです。真空中で液体を直接公開するための小さな開口の使用に、サルヴィは、任意の変更を加えることなく、多くの細く絞った分光法とイメージング技術に適しており、マイクロ流体工学の22移植性と汎用性は、真のマルチモー?...

水分補給は、構造、1コンフォメーション、2およびタンパク質の生物学的活性を3に不可欠です。それらを取り囲む水分子のないタンパク質は、生存可能な生物学的活性を持っていないでしょう。具体的には、水の分子が表面と相互作用およびタンパク質の内部構造、およびタンパク質の異なる水和状態は、このような相互作用が別個にする。4固体表面とのタンパク質の相互作用は、ナノテクノロジー、バイオマテリアルと組織工学プロセスにおける意義と基本的な現象です。研究は、長いタンパク質が表面に遭遇すると立体構造変化が発生する可能性があることが示されています。 TOF-SIMSは、タンパク質-固体界面を研究する可能性を秘めている技術として想定されている。5-7潜在的にその構造のメカニズムの基本的な理解を提供する固体表面上のタンパク質の水和を、理解することが重要です、コンフォメーション、および生物学アル・アクティビティ。 しかし、主要な表面分析技術は、主に真空ベースであり、揮発性液体の研究のための直接のアプリケーションが原因で、真空環境下での揮発性液体の急速な蒸発のために困難です。我々は、液体の表面および液体-固体相互作用（TOF-SIMS）飛行時間型二次イオン質量分析法を用いて直接観察を可能にするために、液体真空インターフェース（サルヴィ）で分析するために、互換性のあるマイクロ流体インターフェースシステム真空を開発しました。8- 1）検出ウィンドウ2）の表面張力を開口部内に液体を保持するために使用され、そして3）サルヴィは、液面の直接撮像を可能にする直径2-3ミクロンの開口部である：11のユニークな態様は、以下が挙げられます複数の分析プラットフォーム間でポータブル。11,12 サルヴィは、検出領域及びポリジメチルシロキサン（PDMS）からなるマイクロチャネルとして窒化シリコン（SiN）膜で構成されています。それはfabrですクリーンルーム内でicated、および製造および主要な設計要因は、前の論文や特許に詳述されている。8月12日 TOF-SIMSのアプリケーション分析ツールは、水溶液と、複雑な液体混合物のさまざまな方法を使って実証されたように、いくつかのこれはナノ粒子を含んでいた。13-17具体的には、サルヴィ液体TOF-SIMSは、 その場で凝縮相のための新しい機会を開き、ライブ生物系（ すなわち 、バイオフィルム）、単一細胞、および固体-電解質界面の液体-固体界面のプロービングダイナミックできますTOF-SIMSを使用して液体を含む研究。しかし、現在の設計は、まだ気液相互作用を許可していません。これは、将来の発展の方向性です。サルヴィは、初めてこの研究で水和タンパク質膜を研究するために使用されてきました。 フィブロネクチンは、ジスルフィド結合の組によって連結された2つの略同一のモノマーからなる、18れるI一般的に使用されるタンパク質二量体であります細胞に結合する能力についてよく知られているよ。19,20は、それが水和タンパク質フィルムを動的サルヴィ液体TOF-SIMS法を用いて調べることができたことを示すためにモデル系として選択しました。タンパク質溶液をマイクロチャネルに導入しました。 12時間インキュベートした後、水和タンパク質膜のSiN膜の裏面に形成されました。脱イオン（DI）水を、タンパク質導入の後にチャネルを洗い流すために使用しました。情報は、動的TOF-SIMSを用いサルヴィマイクロチャネル内の水和フィブロネクチンタンパク分子から収集しました。 DI水はまた、水和フィブロネクチン薄膜から得られた結果と比較するための対照として調べました。明確な違いは、水和タンパク質フィルムとDI水との間で観察されました。この作業は、液体環境における表面上のタンパク質吸着は、新規サルヴィと液体TOF-SIMS法を用いて研究することができることを示しています。ビデオプロトコルは、興味のある人々のための技術的なガイダンスを提供することを意図していますTOF-SIMSとサルヴィの多様なアプリケーションのためのこの新しい分析ツールを利用することで、不要な液体ハンドリングミスと同様にTOF-SIMSデータ収集と分析を減らします。

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF.SIMS 5</td><td>Resolution: &gt;10,000 m/&amp;Delta;m for mass resolution; &gt;4,000 m/&amp;Delta;m for high spatial resolution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td><td>Pacific Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum-based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.</td></tr><tr><td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td><td>for connecting the inlet and outlet of SALVI</td></tr><tr><td>5 Axes Sample Stage</td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure Water Purification System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>Range: 100 to 1,000 ml</td></tr><tr><td>Pipette Tip</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1,000 &amp;micro;l</td></tr><tr><td>Centrifuge Tube</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td>95% Denatured</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

in situ characterization of hydrated proteins in water by salvi and tof-sims

この作業は、液体真空インターフェース（サルヴィ）および飛行時間型二次イオン質量分析法（TOF-SIMS）での分析のためのシステムを使用して、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場特徴付けに実証しています。フィブロネクチンタンパク質フィルムはサルヴィ検出領域を形成する窒化シリコン（SiN）膜上に固定化しました。 TOF-SIMS分析中、分析の三つのモードは、高空間分解能質量分析、二次元（2D）画像、深さプロファイリングを含む行いました。質量スペクトルは、正と負の両方のモードで取得しました。脱イオン水は、また、基準サンプルとして分析しました。我々の結果は、水中のフィブロネクチン膜は水のみと比較して、より明確で強い水クラスターのピークを有することを示します。アミノ酸断片の特徴的なピークは、水和タンパク質TOF-SIMSスペクトルにおいても観察されています。これらの結果は、表面上のタンパク質分子の吸着はdynamicaを研究することができることを示しますLLY初めて液体環境にサルヴィとTOF-SIMSを用いました。

代表的な結果の対は、提案されたプロトコルの利点を実証するために提示されています。サルヴィマイクロ流体インターフェイスを使用して、一次イオンビーム（BI 3 +）を直接脱イオン水中で水和フィブロネクチンフィルムに衝突することができます。したがって、液体表面の分子の化学的マッピングが正常に取得することができます。 <p class="jov...

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In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

この作業は、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場での飛行時間型二次イオン質量分析のためにマイクロチャネルに液体ハンドリング及び試料導入のためのプロトコルを示します。

サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

in-situ-characterization-hydrated-proteins-water-salvi-tof

Research

JoVE Journal

Chemistry

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

8.2K ビュー.  Pacific Northwest National Laboratory. この作業は、水溶液中のタンパク質の生体分子のその場での飛行時間型二次イオン質量分析のためにマイクロチャネルに液体ハンドリング及び試料導入のためのプロトコルを示します。 

ビデオ: In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of cancer, few studies have focused on the potential use of urine cell-free (UCF) DNA. Starting from the hypotheses that normal apoptotic cells produce highly fragmented DNA and that cancer cells release longer DNA, the potential role of UCF DNA integrity was evaluated as an early diagnostic marker capable of distinguishing between patients with prostate or bladder cancer and healthy individuals.
A UCF DNA integrity analysis is proposed on the basis of four quantitative real-time PCRs of four sequences longer than 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, and AR. Sequences that frequently have an increased DNA copy number in bladder and prostate cancers were chosen for the analysis, but the method is flexible, and these genes could be substituted with other genes of interest. The potential utility of UCF DNA as a source of biomarkers has already been demonstrated for urologic malignancies, thus paving the way for further studies on UCF DNA characterization. The UCF DNA integrity test has the advantage of being non-invasive, rapid, and easy to perform, with only a few milliliters of urine needed to carry out the analysis.

A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

がん研究

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the time-profile volume and enthalpy changes of light induced conformational changes in proteins on microsecond to millisecond time-scales that are not accessible using traditional stop-flow instruments. In addition, since overall changes in volume and/or enthalpy are probed, these techniques can be applied to proteins and other biomacromolecules that lack a fluorophore and or a chromophore label. To monitor dynamics and energetics of structural changes associated with Ca2+ binding to calcium transducers, such neuronal calcium sensors, a caged calcium compound, DM-nitrophen, is employed to photo-trigger a fast (&#964; &#60; 20 &#956;sec) increase in free calcium concentration and the associated volume and enthalpy changes are probed using photothermal beam deflection technique.

Here we report an application of the photothermal beam deflection technique in combination with a caged calcium compound, DM-nitrophen, to monitor microsecond and millisecond dynamics and energetics of structural changes associated with the calcium association to a neuronal calcium sensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator.

光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

化学

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using conventional synthesis techniques. Coupling soft landing with in situ characterization using secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS) enables analysis of well-defined surfaces under clean vacuum conditions. The capabilities of three soft-landing instruments constructed in our laboratory are illustrated for the representative system of surface-bound organometallics prepared by soft landing of mass-selected ruthenium tris(bipyridine) dications, [Ru(bpy)3]2+ (bpy = bipyridine), onto carboxylic acid terminated self-assembled monolayer surfaces on gold (COOH-SAMs). In situ time-of-flight (TOF)-SIMS provides insight into the reactivity of the soft-landed ions. In addition, the kinetics of charge reduction, neutralization and desorption occurring on the COOH-SAM both during and after ion soft landing are studied using in situ Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR)-SIMS measurements. In situ IRRAS experiments provide insight into how the structure of organic ligands surrounding metal centers is perturbed through immobilization of organometallic ions on COOH-SAM surfaces by soft landing. Collectively, the three instruments provide complementary information about the chemical composition, reactivity and structure of well-defined species supported on surfaces.

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of novel materials. Coupled with analysis by in situ secondary ion mass spectrometry (SIMS) and infrared reflection absorption spectroscopy (IRRAS), soft landing provides unprecedented insights into the interactions of well-defined species with surfaces.

その場 SIMSおよび質量選択されたイオンのソフトランディングで調製し明確に定義された表面の赤外分光法における

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended solvent window, low background currents, corrosion resistance, etc., arise from the catalytically inert nature of the surface. However, if during the growth process, non-diamond-carbon (NDC) becomes incorporated into the electrode matrix, the electrochemical properties will change as the surface becomes more catalytically active. As such it is important that the electrochemist is aware of the quality and resulting key electrochemical properties of the BDD electrode prior to use. This paper describes a series of characterization steps, including Raman microscopy, capacitance, solvent window and redox electrochemistry, to ascertain whether the BDD electrode contains negligible NDC i.e. negligible sp2 carbon. One application is highlighted which takes advantage of the catalytically inert and corrosion resistant nature of an NDC-free surface i.e. stable and quantifiable local proton and hydroxide production due to water electrolysis at a BDD electrode. An approach to measuring the local pH change induced by water electrolysis using iridium oxide coated BDD electrodes is also described in detail.

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

A protocol is described for the characterization of the key electrochemical parameters of a boron doped diamond (BDD) electrode and subsequent application for in situ pH generation experiments.

ホウ素ドープダイヤモンド電極品質とアプリケーションの評価<em&gt;その場で</em&gt;水電解による局所のpHの変更

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

生化学

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American bullfrog, has become a mainstay of auditory and vestibular research. Studies of this organ have revealed how sensory cells hair can actively detect signals from the environment. Because of these studies, we now better understand the mechanical gating and localization of a hair cell&#39;s transduction channels, calcium&#39;s role in mechanical adaptation, and the identity of hair cell currents. This highly accessible organ continues to provide insight into the workings of hair cells. Here we describe the preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies on its hair cells. We include the complete dissection procedure and provide specific protocols for the preparation of the sacculus in specific contexts. We additionally include representative results using this preparation, including the calculation of a hair bundle&#39;s instantaneous force-displacement relation and measurement of a bundle&#39;s spontaneous oscillation.

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

The American bullfrog&#39;s (Rana catesbeiana) sacculus permits direct examination of hair-cell physiology. Here the dissection and preparation of the bullfrog&#39;s sacculus for biophysical studies is described. We show representative experiments from these hair cells, including the calculation of a bundle&#39;s force-displacement relation and measurement of its unforced motion.

サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで

要約

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この動画の章

尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

その場 SIMSおよび質量選択されたイオンのソフトランディングで調製し明確に定義された表面の赤外分光法における

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマコピー数検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

ホウ素ドープダイヤモンド電極品質とアプリケーションの評価

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

ウシガエルの球形嚢（からの有毛細胞の生理的な準備

サルヴィとTOF-SIMSによる水中で水和タンパク質のその場キャラクタリゼーションで

要約

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尿サンプル中の無細胞DNAインテグリティ解析

光熱ビーム偏向によって分離したタンパク質におけるミリ秒以下構造変化

その場 SIMSおよび質量選択されたイオンのソフトランディングで調製し明確に定義された表面の赤外分光法における

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

ホウ素ドープダイヤモンド電極品質とアプリケーションの評価

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

ウシガエルの球形嚢（からの有毛細胞の生理的な準備

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマコピー数検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出