この技術の主な利点は、エンベロープ、ストロマ、またはチラコイド膜の局在に応じて、異なる役割を持つ類似の活動のタンパク質を区別できることです。一般的に、この方法に新しい個人は、古すぎる植物を使用したり、葉を長くブレンドしたり、無傷で壊れやすい葉緑体のペレットを再中断する際に十分な注意を払わないため、苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、パーコールまたはショ糖勾配ステップからの分数の読み込みまたは回収が困難であるため、非常に重要です。
勾配のブレンドのリスクのため、様々な葉蓋亜分画を交差汚染する。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の博士課程の学生であるイメン・ブーフナックと屋内エンジニアのルーカス・モイェットです。まず、1日に摂氏23度、夜に摂氏18度で12時間の光サイクルで5週間、1平方メートルあたり150マイクロモラーの光強度でシロイヌナズナズ植物を栽培します。
翌日、5リットルのビーカーの重量を事前に計量し、氷の上に置きます。シロイヌナズナの葉を収穫し、土壌を摘むのを避けるようにしてください。ビーカーの重量を再測定し、組織の重量を記録します。
収穫した葉を冷たい部屋に移します。2リットルの粉砕バッファーを含むブレンダーに葉を入れ、毎回2秒間高速で3回ブレンドして均質化します。ムスリンの4つの層とナイロンブルーテックスの1つの層をストレーナーに入れ、これをホモジネートをフィルタリングします。
ムスリンと青いテックスの中でブレンドされた葉を静かに絞り、すべての液体を抽出します。ブレンダーカップ内の残りの組織を回収し、新鮮な粉砕バッファーを使用して均質化プロセスを繰り返します。新しいモスリンの4〜5層を使用して、前述のように新しいビーカーでこの新しいホモゲネートをフィルタリングします。
粗細胞抽出物を6本の500ミリリットルボトルに均等に分配する。ボトルを氷の上に置きます。冷やしたボトルを2070Gで、摂氏4度で2分間遠心分離します。
その後、上清を軽く捨てます。ウォーターポンプを使用して残りの上清を吸引し、濃縮された粗葉芽を含むペレットを氷の上に置きます。10ミリリットルのピペットを使用して、各ボトルに洗浄媒体の3ミリリットルを追加し、葉包を壊さないように細かいピペットの先端を使用しないようにしてください。
次に、ペイントブラシまたは湾曲したプラスチックスパチュラを使用してペレットを穏やかに再中断します。10ミリリットルのピペットを使用して、再懸濁した葉芽を単一のチューブに集める。管を穏やかに反転して、均質な葉緑体懸濁液を得る。
まず、10ミリリットルのピペットを使用して、準備された6つのパーコール勾配の上に葉蓋スロンの6ミリリットルをゆっくりとロードします。スイングバケットローターを使用して、13、300 G、摂氏4度で10分間勾配を遠心分離します。水ポンプを使用して、壊れた葉芽細胞と無傷のミトコンドリアを含む上相を吸引します。
次いで、10ミリリットルのピペットを使用して、下の相に存在する無傷の葉芽を取り出し、チューブの底部に見つかった核および細胞の破片を無傷の葉芽と一緒に吸引しないように注意する。無傷の葉包を洗浄媒体で3~4倍に希釈します。SDS-Pageおよびウェスタンブロッティングによるさらなる分析のために、無傷の葉蓋端分のアリコートの約10ミリリットルを保管してください。
2070 Gで遠心分離機、摂氏4度で2分間。その後、上清を軽く捨てます。ウォーターポンプを使用して残りの上清を吸引し、濃縮された粗葉芽を含むペレットを氷の上に置きます。
精製した無傷の葉葉芽細胞を分解するには、プロテアーゼ阻害剤を含む低張性培地中のペレットを再懸濁させる。再懸濁した葉芽を10ミリリットルのハヤブサチューブに移します。テキスト プロトコルで説明されているように、スクロースのグラデーションを準備します。
蠕動ポンプを使用して、事前に形成されたスクロース勾配の各上に3ミリリットルの分解された葉芽体をゆっくりとロードする。低張性のミディアムバッファーを使用してチューブのペアのバランスをとり、勾配を70,000 G、摂氏4度で1時間超遠心分離します。タンパク質濃度の決定に使用される可溶性の間質タンパク質のアリコートを取る。
次に、ウォーターポンプを用いて、黄色のバンドまでの勾配の残りの上相を吸引する。ピペットを使用して、封筒である黄色のバンドを取り出します。封筒を1本のチューブに引き込む。
次に、チラコイドペレットまでの勾配の残りの相を除去する。膜洗浄バッファー内のチラコイドペレットをプロテアーゼ阻害剤で再懸濁します。チラコイドの懸濁液を希釈し、洗浄媒体で3~4倍に包み、最終量を10ミリリットルに調整します。
膜洗浄バッファーと超遠心分離機でチューブのバランスペア 110, 000 G と摂氏 4 度で 1 時間.この後、上清を慎重に吸引するためにウォーターポンプを使用してください。約100マイクロリットルの膜洗浄バッファーをエンベロープペレットに加えます。
次いで、上清をチラコイド管から吸引する。3ミリリットルの膜洗浄バッファーにチラコイドペレットを再懸濁します。精製された3つのサブコンパートメントを液体窒素に保管し、さらなる実験に使用します。
膜の分画を回収し、洗浄し、濃縮した後、SDS-Pageはタンパク質を定量し、4つの画分の組成を分析するために使用されます。ストロマから最も豊富なタンパク質はRBCLであり、代表的な結果は、このタンパク質の大きなサブユニットのほとんどがチラコイドおよびエンベロープ膜画分を含まれていないことを示す。光収穫複雑なタンパク質は、エンベロープ膜をほとんど汚染してはいけないチラコイド成分が豊富です。
最後に、リン酸三重体リン酸トランスロケータは、葉包体抽出物全体と比較した場合のエンベロープ画分の強い濃縮のために、精製されたエンベロープ画分でのみ見える。3つのサブコンパートメントの交差汚染は、間質からの可溶性ケトール酸還元酵素、葉包の銅ATPase、およびチラコイド膜からの光収穫複合タンパク質を、免疫ブロッティングおよび質量分析の両方を用いて定量することができる。ストロマは通常、エンベロープまたはチラコイド分画によって汚染されていませんが、精製されたエンベロープ画分には3%のチラコイドタンパク質と、ストロマからのタンパク質の最大10%が含まれています。
チラコイドは、間質からのタンパク質によって十分に汚染されていないが、エンベロープ膜タンパク質の最大3%を含む。葉芽肉は、炭素、硫黄、窒素の同化、および必須代謝産物の合成など、多くの重要な機能を果たします。葉膜の生理学を制御する新しい調節機構を解読するためには、葉芽細胞タンパク質の驚くべき局在を定義することは、超標的研究にとって重要です。
葉芽細胞には複数のサブコンパートメントが含まれています。この方法は、特定の葉ロプラス体タンパク質がオルガネラ内のどこにあるかなど、葉芽細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手順を試みる間、プロテアレジストを精製された分画に移すために、4度で葉ロプラストの分離ステップをすべて行うことを忘れないでください。
この手順に従って、lascareプロテオームアプローチのような他の方法は、プラスティドサブコンパートメントの値のプロテオームの組成およびダイナミクスのような追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、植物生理学の分野の研究者が、プラスチドサブコンパートメント内で同定された候補タンパク質の標的分析を用いて、葉膜生物新生および機能の多くの異なる側面を探求する道を開いた。ボリュームブレンダー、液体窒素、プロテアーゼ阻害剤のような特定の化合物で作業するには、特別な注意が必要であることを忘れないでください。
この手順を実行する場合は、手袋、ラボコート、安全メガネの着用などの注意事項を必ずお受けください。
