Funding was provided by the Austrian Science Fund FWF grant No. P-22969-B11 to F. Ferraguti, and by the Charitable Hertie Foundation and the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience and by the DFG (CIN-Exc. 307) to I. Ehrlich.

<ol>
	<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+freeze-fracture+replica+labeling+electron+microscopy+to+study+the+two-dimensional+distribution+of+integral+membrane+proteins+and+phospholipids+in+biomembranes:+practical+procedure,+interpretation+and+application.">SDS-digested freeze-fracture replica labeling electron microscopy to study the two-dimensional distribution of integral membrane proteins and phospholipids in biomembranes: practical procedure, interpretation and application.</a> Histochem Cell Biol. 107 (2), 87-96 (1997).</li><li>Masugi-Tokita, M., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+quantitative+visualization+of+glutamate+and+GABA+receptors+at+central+synapses.">High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 387-393 (2007).</li><li>Rash, J. E., Yasumura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+immunogold+labeling+of+connexins+and+aquaporin-4+in+freeze-fracture+replicas+of+liver,+brain,+and+spinal+cord:+factors+limiting+quantitative+analysis.">Direct immunogold labeling of connexins and aquaporin-4 in freeze-fracture replicas of liver, brain, and spinal cord: factors limiting quantitative analysis.</a> Cell Tissue Res. 296 (2), 307-321 (1999).</li><li>Emes, R. D., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+synapse+complexity+and+diversity.">Evolution of synapse complexity and diversity.</a> Annu Rev Neurosci. 35, 111-131 (2012).</li><li>Matsuzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+geometry+is+critical+for+AMPA+receptor+expression+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Nat Neurosci. 4 (11), 1086-1092 (2001).</li><li>Rollenhagen, A., L&#252;bke, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+of+excitatory+central+synapses:+from+structure+to+function.">The morphology of excitatory central synapses: from structure to function.</a> Cell Tissue Res. 326 (2), 221-237 (2006).</li><li>Tarusawa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-specific+intrasynaptic+arrangements+of+ionotropic+glutamate+receptors+and+their+impact+on+postsynaptic+responses.">Input-specific intrasynaptic arrangements of ionotropic glutamate receptors and their impact on postsynaptic responses.</a> J Neurosci. 29 (41), 12896-12908 (2009).</li><li>Nusser, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type+and+pathway+dependence+of+synaptic+AMPA+receptor+number+and+variability+in+the+hippocampus.">Cell type and pathway dependence of synaptic AMPA receptor number and variability in the hippocampus.</a> Neuron. 21 (3), 545-559 (1998).</li><li>Ny&#236;ri, G., Stephenson, F. A., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+variability+in+synaptic+N-methyl-D-aspartate+receptor+density+on+interneurons+and+a+comparison+with+pyramidal-cell+spines+in+the+rat+hippocampus.">Large variability in synaptic N-methyl-D-aspartate receptor density on interneurons and a comparison with pyramidal-cell spines in the rat hippocampus.</a> Neuroscience. 119 (2), 347-363 (2003).</li><li>Nicholson, D. A., Geinisman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axospinous+synaptic+subtype-specific+differences+in+structure,+size,+ionotropic+receptor+expression,+and+connectivity+in+apical+dendritic+regions+of+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Axospinous synaptic subtype-specific differences in structure, size, ionotropic receptor expression, and connectivity in apical dendritic regions of rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> J Comp Neurol. 512 (3), 399-418 (2009).</li><li>Millhouse, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intercalated+cells+of+the+amygdala.">The intercalated cells of the amygdala.</a> J Comp Neurol. 247 (2), 246-271 (1986).</li><li>Busti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+fear+states+engage+distinct+networks+within+the+intercalated+cell+clusters+of+the+amygdala.">Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala.</a> J Neurosci. 31 (13), 5131-5144 (2011).</li><li>Amano, T., Unal, C. T., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+correlates+of+fear+extinction+in+the+amygdala.">Synaptic correlates of fear extinction in the amygdala.</a> Nat Neurosci. 13 (4), 489-494 (2010).</li><li>Duvarci, S., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+microcircuits+controlling+learned+fear.">Amygdala microcircuits controlling learned fear.</a> Neuron. 82 (5), 966-980 (2014).</li><li>J&#252;ngling, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropeptide+S-mediated+control+of+fear+expression+and+extinction:+role+of+intercalated+GABAergic+neurons+in+the+amygdala.">Neuropeptide S-mediated control of fear expression and extinction: role of intercalated GABAergic neurons in the amygdala.</a> Neuron. 59 (2), 298-310 (2008).</li><li>Asede, D., Bosch, D., L&#252;thi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+inputs+to+intercalated+cells+provide+fear-learning+modulated+inhibition+to+the+basolateral+amygdala.">Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala.</a> Neuron. 86 (2), 541-554 (2015).</li><li>Maren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+Pavlovian+fear+conditioning.">Neurobiology of Pavlovian fear conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 24, 897-931 (2001).</li><li>Pape, H. C., Pare, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+synaptic+networks+of+the+amygdala+for+the+acquisition,+expression,+and+extinction+of+conditioned+fear.">Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear.</a> Physiol Rev. 90 (2), 419-463 (2010).</li><li>Sigurdsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+potentiation+in+the+amygdala:+a+cellular+mechanism+of+fear+learning+and+memory.">Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning and memory.</a> Neuropharmacology. 52 (1), 215-227 (2007).</li><li>Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex-vivo+optogenetic+dissection+of+fear+circuits+in+brain+slices.">Ex-vivo optogenetic dissection of fear circuits in brain slices.</a> J. Vis. Exp. (110), e53628 (2016).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li><li>Bienvenu, T. C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+intercalated+neurons+of+amygdala+relay+noxious+sensory+information.">Large intercalated neurons of amygdala relay noxious sensory information.</a> J. Neurosci. 35 (5), 2044-2057 (2015).</li><li>Sandri, C., Akert, K., Livingston, R. B., Moor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+aggregations+at+specialized+sites+in+freeze-etched+postsynaptic+membranes.">Particle aggregations at specialized sites in freeze-etched postsynaptic membranes.</a> Brain Res. 41 (1), 1-16 (1972).</li><li>Likhtik, E., Popa, D., Apergis-Schoute, J., Fidacaro, G. A., Par&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amygdala+intercalated+neurons+are+required+for+expression+of+fear+extinction.">Amygdala intercalated neurons are required for expression of fear extinction.</a> Nature. 454 (7204), 642-645 (2008).</li><li>Fukazawa, Y., Shigemoto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-synapse-type+and+inter-synapse-type+relationships+between+synaptic+size+and+AMPAR+expression.">Intra-synapse-type and inter-synapse-type relationships between synaptic size and AMPAR expression.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 446-452 (2012).</li><li>Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogold+cytochemistry+in+neuroscience.">Immunogold cytochemistry in neuroscience.</a> Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).</li><li>Fukazawa, Y., Masugi-Tokita, M., Tarusawa, E., Hagiwara, A., Shigemoto, R., Cavalier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDS-digested+Freeze-fracture+replica+labelling+(SDS-FRL).">SDS-digested Freeze-fracture replica labelling (SDS-FRL).</a> Handbook of Cryo-Preparation Methods for Electron Microscopy. , 567-586 (2007).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 547-576 (2007).</li><li>Tanaka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Number+and+density+of+AMPA+receptors+in+single+synapses+in+immature+cerebellum.">Number and density of AMPA receptors in single synapses in immature cerebellum.</a> J Neurosci. 25 (4), 799-807 (2005).</li><li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+subsynaptic+localization+of+type+1+metabotropic+glutamate+receptors+at+glutamatergic+and+GABAergic+synapses+in+the+rodent+cerebellar+cortex.">Distinct subsynaptic localization of type 1 metabotropic glutamate receptors at glutamatergic and GABAergic synapses in the rodent cerebellar cortex.</a> Eur J Neurosci. 41 (2), 157-167 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

フリーズフラクチャー電子顕微鏡は、40年以上にわたり超微細構造研究の主要な技術となっています。しかし、膜の分子組成を研究するための有効な手段の欠如は、その使用の大幅な下落をもたらしました。近年、免疫標識1、2、すなわちFRIL技術によって内在性膜タンパク質を明らかにするのに有効な方法の開発にフリーズフラクチャー電子顕微鏡の主要な回復がありました。 FRIL技術は、他の免疫超の方法に比べていくつかの利点を有しています。まず、タンパク質は、高感度化抗体に容易にアクセス可能です。第二に、レプリカの二次元表面上のそのようなシナプス後膜などの細胞膜の特殊化、大部分の露出がセリの面倒で時間のかかる再構成することなく、目的の分子の空間分布と物理的連続の検査を可能にしますアル超薄切片。第三に、原形質膜の両半分の利用可能性は、適切な抗体が入手可能で設け、各個々の構造のために標識することができるタンパク質の数を増加させます。破砕の際、分割膜の疎水性面は、破断面上に残ったタンパク質ドメインをentrenches炭素白金で被覆されています。これは、これらのドメイン内の抗原に対する抗体のアクセスを防止します。レプリカのP面上に、例えば原形質空間に面するだけエピトープが、一方のみの抗体によって結合され得るexoplasmic空間に面するエピトープE面に、抗体によって検出することができる（ 図2参照 ）。 一方、FRIL技術も一定の限界2被ります。骨折がランダムに発生すると、特定の細胞または構造を標的とすることは困難かもしれません。これはまた、FRAの異なる確率を考えると、シナプスコレクションに、例えば 、サンプリングバイアスにつながることができます異なる曲率（シャフト対例えば、棘）を有する構造の膜に沿ってcturing。また、二つの面の一方の膜タンパク質の割り当てが予測不可能です。そのため、特に定量的研究のためのP-顔やE-顔へのタンパク質の分布は、慎重に細胞内および細胞外ドメインに反応する抗体を用いて検討する必要があります。唯一の形態学的特徴に基づいたときに最後に、このようなシナプス前軸索終末のような特定の構造のレプリカで識別は、困難な場合があります。しかし、マーカータンパク質に特異的な抗体の使用またはウイルスベクターを用いてタグ付けされた内在性膜タンパク質またはチャネルの形質導入は、骨折した膜の同定を容易にするために追加のツールを提供します。例えば、この研究では、シナプス後私を明らかにするためにμオピオイド受容体に対する扁桃体や標識におけるそれらの軸索遠心性神経を識別するために、視床ニューロンでのChR2-YFPの導入の利点を取りましたITCニューロンのmbranes。 正常FRIL技術を実行するために、特別な注意が組織固定に関して取られるべきです。強い組織固定（&gt; 2％パラホルムアルデヒド）は、クロス骨折の高い速度と標識感度の低下をもたらすことができます。一方、弱い凝視は、組織の取り扱いと準備（セクションの例えば、切断）困難を作ります。トリミングブロックの厚さは、両面テープの厚さと一致するように制御することも重要です。試験片の厚さは、テープよりも低い場合には、組織の表面は、2つの金属担体の表面に付着していない場合があり、その結果、凍結試料が破断されていません。組織が厚い場合、2つの銅キャリアのサンドイッチが行われたとき、それは避けられない構造の歪みで圧縮されます。 （このプロトコールにおいて、C〜115）試料を破断する温度も重要な役割を果たしていますレプリカの構造に関する。より高い温度は、前又は蒸発の間に組織の表面上の水蒸気の凝縮としてアーチファクトのより高い速度を生成することができます。より低い温度（&lt;-125℃）破壊時の材料から分裂のリスクを高めることができます。この材料は、試料の表面上に落下またはそれへの接続を維持することができます。材料のこれらのフレークは、画像上のダークスポットを生成するコーティングし、対比されます。より低い温度で破砕することも、特に、樹状突起棘のような小さな微細構造のためクロス骨折の頻度に影響を与えることができます。レプリカの製造における更なる重要なステップは、界面活性剤の消化です。消化が不完全である場合は、未消化の組織は、TEMでの構造の分析を混乱させる、レプリカ上のような暗いパッチを表示されます。また、未消化の組織は、バックグラウンド標識を大きくする、非特異的にトラップまたは結合する抗体をすることができます。一方、使用洗剤の組織消化のためのsが、その二次および三次構造を変えるレプリカに関連する分子を変性させることができます。したがって、特定の抗原のためにそれは徐々に追加の洗浄工程でSDSの濃度を希釈する必要があるかもしれません。 免疫標識のために、二次抗体と結合金粒子の異なるサイズの利用可能性はあっても、そのようなシナプス後特化などの原形質膜の特定のマイクロドメインに、同時に検出することができますが、定性的にのみ、複数のタンパク質。しかし、立体障害のために、定量的な研究は、一般的にただ一つの分子の検出に限定されています。金粒子のサイズはまた、標識効率に影響を与えることができます。 FRILでのラベリングの解釈については、それが原因で柔軟性のある複雑な形にイムノゴールド粒子は抗原20から25ナノメートルの半径を有する半球内のどこにでも配置することができることを心に留めておくべきです一次および二次抗体26によって編。 FRILと関連技術の理論と実践の詳細については、我々は他の方法論の記事27、28にも読者を参照してください。 FRIL技術は最近30、多様なシナプス集団29におけるグルタミン酸受容体の局在化の高解像度の定量分析のために使用されている。また、AMPA-RのためのFRIL法の検出感度は、一つの機能AMPAごとに免疫粒子として高いと推定されました-Rチャンネル29。したがって、このアプローチは、定量化し、中央のシナプスにおけるAMPA-RやNMDA-Rのシナプス後発現パターンを分析するために全体的に非常に便利です。ここで、我々は、PIN / MGN-ITCのシナプスで最も可能性の高い重要な恐怖条件付けの間に米国の情報を中継するためのサイトをその適用性を実証しました。 AMPA受容体サブユニットのGluの高度に保存された細胞外アミノ酸残基に対する抗体を用いてA1-GluA4は、我々は、シナプス後膜の特殊化に対応したIMPクラスタ内の金粒子の均一な分布を発見しました。 ITCの棘におけるAMPA-Rの密度は、PIN / MGN視床求心性神経が標的とシャフトのシナプスに比べて有意に高かったです。両方の背骨とシャフトシナプスで、AMPA-Rのための標識及びシナプス後領域との間に正の相関が、他のグルタミン酸作動性シナプス25に共通の特徴を検出しました。 PIN / MGN-ITCのシナプスにおけるAMPA-Rの密度の低い分散は、皮質のシナプス25から視床遠心性神経7によって形成された他のシナプスに似てますが、別の均一な分布を示しています。逆に、NMDA-Rの密度は、より多くの変数であり、AMPA-Rのとは異なる規制を示唆している背骨とシャフトのシナプス間で差がなかったです。将来的には、FRIL技術の高い再現性が中枢シナプスの基礎分子組成を評価することを可能にするだけでなく、Cの検出を容易にすることができます恐怖学習後のイオンチャネル型グルタミン酸受容体の数とシナプス下分布のhanges、これらの入力の前と後シナプス特性のex vivoでの録音を補完します。 結論として、このアプローチは、入力起点をほぐしている他の多くの神経回路における入力特異的興奮性シナプスの構造 - 機能関係への洞察を得るために他の研究者によって使用することができ、シナプス後要素の性質及び組成は重要しかし問題があります。

ナノメートルスケールでの生体膜の機能アーキテクチャの定義は、透過型電子顕微鏡に適した免疫標識技術の多数の開発によって近年で挑戦されています。しかしながら、これらの技術は、 例えば、前後埋め込 ​​み免疫抗原の不十分な検出および/ ​​または膜結合タンパク質の制限された定量的評価を含む重要な制約の数を持っています。これらの制限は、細胞の多様性とシナプスの異質性の高いことを特徴としている神経系の微細構造の調査では特に重要になります。そのような受容体、トランスポーター、およびエフェクター分子として前およびシナプス後要素によって、および示差的発現、濃縮、またはシグナル伝達タンパク質の相互作用によって決定される構造的および機能的多様性の両方からのこの不均一性が生じます。 直接immunolabeのための新しいアプローチ界面活性剤で可溶化フリーズフラクチャーレプリカ（FRIL）の積分または架橋膜タンパク質の玲はもともと20年前に1藤本によって導入されました。このオリジナルの方法は、脳のような複雑な組織で個別にマッピングされた細胞を用いて標識された分子の意味のある相関を妨げレプリカのしかし、いくつかの制限、 すなわち、重度の断片化を、持っていました。約10年前、Shigemotoと深沢は次第に技術2を改善しました 。これは、かなりギャップジャンクション3の研究のために、特に、技術を向上させコロラド州立大学のボールダー研究所の科学者の他のグループからの努力、と並行ました。 凍結破砕プロトコルや機械の改善、ならびに（高圧下で）凍結クイックの導入は、今研究者は比較的大きなサイズの標本の切れ目のないレプリカを生成することができますし、ハイテク制限および強力な化学凝視によって生成されるアーティファクトのない最も細胞成分のGH品質の画像。 FRIL技術は、組織学的にマッピングされ、前とシナプス後の平面図の追加の利点を持つ脳のような複雑な組織内細胞学的に同定された細胞、中に1つまたは複数のタンパク質（同時に）の定量性の高いその場での識別の大きな利点を提供しています単一のレプリカ内の要素。したがって、FRIL技術は、その多くの技術的なハードルにもかかわらず、特に個々のシナプスの構造的および機能的特性の相関のために、非常に重要な科学的ブレークスルーの数のための約束を保持しています。過去数十年の間に、大量の情報は構造、分子メイクアップ、およびシナプスの生理機能に得られています。まだシナプスは前とシナプス後PAに応じて、形態学的および分子的に非常に多様です家賃ニューロン4。唯一のシナプスタイプの一握りのための構造-機能研究は、これまでの5-7達成しました。これは主に前とシナプス後要素の性質の正確な同定を防ぐ技術的な制約によるものでした。 超微細構造解析は、シナプス伝達の強度と可塑性に大きな影響を持っている神経伝達物質受容体6における明確なシナプスの接点間の両方シナプスのサイズと内容の点ではシナプス後膜の特殊化の変動性、に重要な洞察を提供してきました。また、研究の大きな体は、シナプスの異なる種類で発現イオンチャネル型グルタミン酸受容体の数がafferent-とターゲット依存的7-10に調節されていることを示しています。 ここでは、メソッドが定義とシナプス後膜の特殊化の構造と受容体組成の分析を可能に概説されていますDシナプス前要素と機能。このアプローチは、α - アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4- isoxazolepropionicのシナプス後の発現のパターンを分析するために、このようなchannelrhodopsin2（にChR2）として最近開発された感光性藻類タンパク質のシナプス前の発現、及びFRIL技術を利用します酸（AMPA-RS）と、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA-RS）グルタミン酸受容体。これは、扁桃体（ITC）のインターカレートされた細胞塊のニューロンに後部視床内側膝状核（PIN / MGN）由来の軸索により形成されたシナプスで実証されています。 ITCニューロンは基底扁桃複合体（BLA）11,12を囲むクラスタに編成小さなとげのGABA作動性細胞である。ITCニューロンがBLA主要ニューロンの興奮性入力を受信し、（CEA）の中心核を標的とすることが知られており、このような阻害ゲートとして機能しますBLAとCEA 12-15との間の情報の流れのために。 最近、我々はITことを実証しましたBLAとCEAとの間に内外背側クラスターに位置するCニューロンはまた、恐怖はパブロフの聴覚恐怖条件16時の学習の際に変更された感覚視床および時間的な皮質領域から直接収束興奮入力を受け取ります。恐怖条件付けは、脳のメカニズムの面で連合学習の最もよく理解形態の一つです。恐怖条件付けでは、最初に中性の条件刺激（CS、 例えば、トーン）は、CS-US協会とコンディショニング恐怖反応17、18が得られ嫌悪無条件刺激（米国、 例えば、穏やかな足ショック）と対になっている。興奮CSと米国を表す情報を運ぶ視床および新皮質領域の両方からの入力は、それぞれ、扁桃体（LA）の外側核の錐体ニューロンに収束すると可塑19を受けることが知られていました。私たちの前の仕事は、感覚入力情報も並行してITCニューロンに中継されることが明らかになりました<s&gt; 16アップ。 ITCニューロンへの個々の感覚入力シナプスのメカニズムの分子解析に向けた最初のステップとして、我々は黄色蛍光タンパク質（YFP）でタグ付けにChR2を発現するためにアデノ随伴ウイルス（AAV）を使用しました。 AAVは、PIN / MGNに注入し、軸索末端を、にChR2-YFPの発現によって同定しました。私たちは、PIN / MGNの軸索末端によりITCニューロンが形成されたシナプスにおけるシナプス後AMPA-RやNMDA-Rの密度を評価するために、FRIL技術によって生成された両面を使用しました。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Surgery&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>can be replaced by other stereotactic frame for mice</td></tr><tr><td>Stereotactic frame mouse adaptor</td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Gas anesthesia mask for mice</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>no longer available, replaced by item no. 51609M</td></tr><tr><td>Pressure injection device, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used</td></tr><tr><td>Kwik Fill glass capillaries</td><td>World Precision Instruments, Germany</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia machine, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germany</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>DC Temperature Controler and heating pad</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Micropipette Puller Model P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75</td><td>Melag, Germany</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>fast green</td><td>Roth, Germany</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1 ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antiseptic, Betadine (providone-iodine)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>can be replaced by other disinfectants</td></tr><tr><td>Analgesic, Metacam Solution (5 mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germany</td><td></td><td>can be replaced by other analgesics</td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Germany</td><td>0191</td><td>can be replaced by other eye ointments</td></tr><tr><td>Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681)</td><td>Nouvag, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Suture Needle</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Braided Silk Suture</td><td>Fine Science Tools, Germany</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde EM grade</td><td>Agar Scientific Ltd., United Kingdom</td><td>AGR1018</td><td></td></tr><tr><td>Saturated picric acid solution</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1063451000</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>4N NaOH</td><td>Carl Roth, Germany</td><td>T198.1</td><td></td></tr><tr><td>Thiopental</td><td>Sandoz, Austria</td><td>5,133</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>GenPure ultrapure water system</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>50131235</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Germany</td><td>ISM 930C</td><td></td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>MACHEREY-NAGEL, Germany</td><td>MN 615 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Vibroslicer, VT1000S</td><td>Leica Microsystems, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ophthalmic scalpel</td><td>Alcon Laboratories, USA</td><td></td><td>can be replaced by other ophthalmic scalpels</td></tr><tr><td>Perfusion cannula</td><td>Vieweg, Germany</td><td>F560088-1</td><td>can be replaced by similar items from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;High-pressure&amp;nbsp; Freezing&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copper carriers</td><td>Engineering Office M. Wohlwend, CH</td><td>528</td><td></td></tr><tr><td>Sidol Polish</td><td>Henkel, Germany</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Chamois skin</td><td>Household supply store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole punch, 1,5mm</td><td>Stubai, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Denatured ethanol</td><td>Donauchem, Austria</td><td></td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Roth, Germany</td><td>9372.5</td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>High Pressure Freezing Machine HPM 010</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>HPM010</td><td>not produced any more, substituted by LeicaEM HPM100</td></tr><tr><td>Stereo-microscope</td><td>Olympus, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>CAUTION!</td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Roth, Germany</td><td>E309.1</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoCane</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5015-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>CryoSleeve</td><td>Nalge Nunc International,USA</td><td>5016-0001</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen storage vessel</td><td>Cryopal, France</td><td>GT38</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Non-ionic detergent (Lavocid)</td><td>Werner &amp;amp; Mertz Professional, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Freeze-fracture and Replication&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandblaster, Mikromat 200-1</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>SANDURET 2-K</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Siliciumcarbid SIC 360, grain size 25 - 21&amp;micro;</td><td>JOKE Joisten &amp;amp; Kettenbaum, Germany</td><td>955932</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Fracture System BAF 060</td><td>BalTec, CH; now Leica Microsystems</td><td>BAF060</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic 12 well plate</td><td>Gr&amp;ouml;pel, Austria</td><td>14511</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>SIGMA, USA</td><td>T1503</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>SIGMA, USA</td><td>T3253</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck, Germany</td><td>1,064,041,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>SDS, Sodium lauryl sulfate</td><td>Roth, Germany</td><td>5136.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Merck, Germany</td><td>1,076,871,000</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Roth, Germany</td><td>5429.3</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Universal Hybridization Oven</td><td>Binder, Germany</td><td>7001-0050</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Immunolabelling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA, USA</td><td>A9647</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibody</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-pan-AMPAR Antibody</td><td>Frontier Institute, Japan</td><td>pan AMPAR-GP-Af580-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NMDAR1 Antibody, clone 54.1</td><td>Merck Millipore, Germany</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>Opioid Receptor-Mu (MOR) Antibody</td><td>ImmunoStar, USA</td><td>24216</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-guinea pig, 5 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAG5</td><td></td></tr><tr><td>EM goat anti-rabbit, 15 nm; secondary antibody</td><td>BBInternational, UK</td><td>EM.GAR15</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit, 10nm, secondary antibody</td><td>AURION, Netherlands</td><td>DAR 10nm</td><td></td></tr><tr><td>Copper grids, 100 Parallel Bar</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>G2012C</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Major Science, USA</td><td>MO-RC</td><td>can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>Pioloform Powder</td><td>&amp;nbsp;Agar scientific, UK</td><td>R1275</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Roth, Germany</td><td>3313.1</td><td>CAUTION! ;&amp;nbsp; can be replaced by same item from other companies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EM analysis&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Philips CM120 TEM</td><td>Philips/FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Morada CCD camera</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTEM Ver. 5.2, imaging software</td><td>Soft Imaging Systems, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combined optogenetic and freeze-fracture replica immunolabeling to examine input-specific arrangement of glutamate receptors in the mouse amygdala

フリーズフラクチャー電子顕微鏡は、40年以上にわたり超微細構造研究の主要な技術となっています。しかし、膜の分子組成を研究するための有効な手段の欠如は、その使用の大幅な下落をもたらしました。最近、免疫金標識によって内在性膜タンパク質を明らかにするために効果的な方法の開発にフリーズフラクチャー電子顕微鏡のおかげで主要な復活がありました。これらの方法の一つは、界面活性剤で可溶化フリーズフラクチャーレプリカ免疫標識（FRIL）として知られています。 光遺伝学とFRIL技術の組み合わせは、中枢シナプスの構造的および機能的特性の相関分析を行うことができます。このアプローチを使用することは、タグ付けされたチャネルロドプシン、特定の分子マーカーのそれぞれの発現の両方によって前およびシナプス後ニューロンを同定し、特徴付けることが可能です。 glutamatのシナプス後膜の特殊化の独特の外観ERGICシナプスはさらに、これらの受容体のintrasynaptic分布を定量化し、分析するために、イオンチャネル型グルタミン酸受容体の標識化の際に、ことができます。ここでは、ペアの複製とどのようにそれらを免疫標識する準備に必要な手順をステップバイステップの説明を与えます。我々はまた、潜在的なサンプリングバイアスに関連する特定のものをFRIL技術の注意事項と制限事項について説明します。光遺伝学と組み合わせたFRIL技術、高い再現性と汎用性は、脳内の特定された神経細胞の微細回路におけるシナプス伝達の異なる局面の特徴付けのための非常に強力なアプローチを提供しています。 ここでは、このアプローチは、マウスの扁桃体のインターカレートされた細胞塊のニューロンに興奮性シナプスの構造と機能の関係への洞察を得るために使用された方法の例を提供します。特に、我々は、識別された入力でイオンチャネル型グルタミン酸受容体の発現を調査していますか視床後部髄板内と内側膝状核からiginated。これらのシナプスは、恐怖の学習に関連する感覚情報を中継すると恐怖条件付けの際にプラスチック製の変化を受けることが示されました。

FRIL技術は、微生物起源21、 すなわち、原形質膜に統合し、効果的に軸索に沿って順行性輸送チャネルの光遺伝学アクチュエータの発現と組み合わせたときに、定義されたサブグループで定量的にAMPA-RやNMDA-Rのシナプス後の発現を調べることができますシナプスの。これは、扁桃体におけるITCニューロン上に（ 例えば、PIN / MGN）の別個の視床核由来の軸索のためにここに表示されます。このアプローチは、ITCニューロン、これまで詳細な解剖学的および分子特性に不応性であったセルのグループへの個々の感覚入力のシナプスの分子分析を可能にします。 PIN / MGNへのrAAV-のChR2-YFPの定位注射後4週間、にChR2-YFP陽性の軸索は密に私はLA、amygdalostriatal遷移領域（アストリア）と内側paracapsularを神経支配します<html>扁桃体におけるTCクラスタ、以前のトレースの研究16、22と完全に一致したパターン。我々はまたのrAAV-にChR2-YFP-から凍結破砕レプリカに軸索と端末のP-面上にChR2-YFPのための免疫標識強烈な金を検出注射したマウス（ 図5A）ではなく、非注射したマウスからのレプリカインチレプリカでのグルタミン酸作動性シナプスのシナプス後膜の特殊化は、原形質膜2、23のE-面上の膜内粒子（インプレッション）のクラスタとして観察することができ、多くの場合、そのシナプス前血漿膜7のP-顔を伴っています（ 図5B、C）。これらの機能は、PIN / MGNの軸索末端（ 図5及び6）によって形成されたグルタミン酸作動性シナプスのシナプス後特化を同定することを可能にしました。我々は、NMDA-Rは必須のNR1サブユニットに対する抗体を用いて検出したのに対し、すべての4つのサブユニット（GluA1-4）を認識する抗体でAMPA-Rの標識。 「FO：キープtogether.within-ページを= &quot;ntent 1&quot;&gt;は、これらのシナプスは樹状突起棘またはITCニューロンのシャフトで作られたかどうか、同じレプリカで検出するためのツールの不足のため、我々はμのために、対応するレプリカ顔をラベル付けITCニューロンは、これらの受容体24のシナプス後部を高レベルで発現するようなオピオイド受容体は、これは、ランドマークを用いた戦略を使用して2つの複製（ 図5C-F及び図6A-D）と同じシナプス後のプロファイルの識別を必要とした （ 図4E） 。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig5.jpg" /> 図5.イムノゴールド粒子によるレプリカ上にChR2-YFPおよびイオンチャネル型グルタミン酸受容体の検出。（A）クロス破砕軸索末端（水色）とにChR2-YFPを検出する15 nmの金粒子で標識され、そのP-顔の小さな部分。端末内、膜OF多数のシナプス小胞を観察することができる（SV）。形質膜に限定され、大部分の免疫標識の特異性を注意してください。 ChR2のためのラベリングは、PIN / MGNから発信などの端末を識別します。端末は、背骨と非対称シナプスを形成しています。 E-顔にシナプス後膜の特殊化（PSD）は、膜内粒子の特性クラスタを示し、AMPA-Rのを明らかに5 nmの金粒子で標識されています。 （B）（15 nmの金粒子で標識された）にChR2を発現する軸索のP-面は2樹状突起、NMDA-Rのを明らかに5 nmの金粒子で標識された2のPSDを有するそれらのいずれかに隣接示されています。 （CD）PIN / MGN-ITCのシナプスの前およびシナプス後膜の両面。 （C）末端のP-faceがにChR2を発現し（15 nmの金粒子で標識された）と2つの樹状突起のシャフト、AMPA-ルピー（5 nmの金粒子）のために標識2のPSDを含むそれらのいずれかのE-顔の上に延びています。 （ <stronグラム&gt; D）2樹状突起の対応するP-faceがμオピオイド受容体（10 nmの金粒子）のために標識されます。 （EF）破線で概説された領域の拡大図。スケールバー：500 nmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig5large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> PIN / MGN-ITCのシナプスにおけるAMPA-RのためのImmunoparticlesは、シナプス後特化（ 図5E）内の均一な分布を示唆している、すべてのIMPクラスタ上で発見されました。 AMPA-Rラベルの有意に高い（対応のないt検定のp &lt;0.018）の密度は、PIN / MGNで観察されたシナプスに比べITCの棘（715±38金粒子/μm2であり、n = 32）にシナプスITCの樹状突起上に（590 ±44金粒子/μm2であり、n = 32）。全体的に、PIN / MGN-ITCシナプスにおけるAMPA-Rの濃度が比較的低いを示しました分散（変動係数、CV = 0.37）均一な分布と一致しました。 PIN / MGN-ITCシナプスにおけるNMDA-RのためのImmunoparticlesは、多くの場合、不均一シナプス後IMPクラスター（ 図5B）内に分布が観察されました。 NMDA-Rラベルの密度は（不対t検定p = 0.39）PIN / MGNは、ITCの棘上にシナプス間で同様であった（1070±153金粒子/μm2であり、n = 8）およびITCの樹状突起（812±183金粒子/ μm2であり、n = 9）。 AMPA-Rのために観察されたものとは異なり、PI​​N / MGN-ITCシナプスにおけるNMDA-Rの密度は（= 0.54 CV）非常に変動しました。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53853/53853fig6.jpg" /> 図6. AMPA-Rや特定されたPIN / MGN-ITCシナプスにおけるNMDA-Rの免疫標識。 （AB）PIN / MGN-ITCの前およびシナプス後膜の両面シナプスは、端末のP-顔がにChR2（15 nmの金粒子で標識された）を発現し、樹状突起棘上にPSDは、AMPA-ルピー（5 nmの金粒子）のために標識された樹状突起棘の上に作られました。 （CD）破線で概説された領域の拡大図。これらの領域は、PSDのより良いビューを可能にするために、約45°反時計回りに回転させてきました。 （E）ITCの棘と樹状突起におけるシナプス面積に対するAMPA-R粒子の数の散布図。両方の構造では、正の相関が観察されています。 （F）ITCの棘と樹状突起におけるシナプス面積に対するNMDA-R粒子の数の散布図。有意な正の相関が唯一の樹状突起棘で検出されました。スケールバー：500 nmで<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53853/53853fig6large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> なぜなら面積0.032 平方 μm、範囲を意味する：多くの場合、部分的にシナプス後IMPクラスタを重ねシナプス前細胞膜のP-顔は、我々はシナプス（棘の30％のみのシナプス面積を推定できた0.063 平方 μmに0.007を、N = 8;樹状突起：0.047μm2で、範囲：0.166μmの2から0.024、N = 11）。以前に分析終脳グルタミン酸が25をシナプスこれらは、同様の範囲内でした。 両方の棘と樹状突起では、個々のシナプスにおけるAMPA-Rのためのゴールドimmunoparticlesの数が積極シナプス面積と相関していた（スピアマン、棘：R = 0.88、樹状突起：R = 0.60、P &lt;0.0001）（ 図6E）。逆に、NMDA-Rのためのゴールドimmunoparticlesの数はスパインにおけるシナプス面積と相関することが見出された（スピアマン、棘：R = 0.90、P &lt;0.002）ではなく、樹状突起（R = 0.21、P = 0.29）（ 図6F ）。

Watch this Scientific Journal Video about Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala at JoVE.com

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K ビュー.  Medical University of Innsbruck. This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

ビデオ: Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

行動学

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

神経科学

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this purpose, an in vivo imaging technique that detects calcium transients in neurons using genetically encoded calcium indicators (GECIs), a miniaturized fluorescence microscope, and a gradient refractive index (GRIN) lens has been developed and successfully applied to many brain structures1,2,3,4,5,6. This imaging technique is particularly powerful because it enables chronic simultaneous imaging of genetically defined cell populations for a long-term period up to several weeks. Although useful, this imaging technique has not been easily applied to brain structures that locate deep within the brain such as amygdala, an essential brain structure for emotional processing and associative fear memory7. There are several factors that make it difficult to apply the imaging technique to the amygdala. For instance, motion artifacts usually occur more frequently during the imaging conducted in the deeper brain regions because a head-mount microscope implanted deep in the brain is relatively unstable. Another problem is that the lateral ventricle is positioned close to the implanted GRIN lens and its movement during respiration may cause highly irregular motion artifacts that cannot be easily corrected, which makes it difficult to form a stable imaging view. Furthermore, because cells in the amygdala are usually quiet at a resting or anesthetized state, it is hard to find and focus the target cells expressing GECI in the amygdala during baseplating procedure for later imaging. This protocol provides a helpful guideline for how to efficiently target cells expressing GECI in the amygdala with head-mount miniaturized microscope for successful in vivo calcium imaging in such a deeper brain region. It is noted that this protocol is based on a particular system (e.g., Inscopix) but not restricted to it.

In vivo microendoscopic calcium imaging is an invaluable tool that enables real-time monitoring of neuronal activities in freely behaving animals. However, applying this technique to the amygdala has been difficult. This protocol aims to provide a useful guideline for successfully targeting amygdala cells with a miniaturized microscope in mice.

自由に振る舞うマウスの扁桃体の頭部小型顕微鏡による生体内カルシウムイメージングに成功

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

Immunolabeling of Neuronal Membrane Proteins in a Freeze-fractured Specimen of Mouse Brain Tissue

<a href='https://app.jove.com/v/53853/combined-optogenetic-freeze-fracture-replica-immunolabeling-to'>Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala. J. Vis. Exp. (2016)</a>This video demonstrates the immunolabelling of freeze-fractured replicas of mouse brain tissue for electron microscopy. The fractured and coated replicas are digested to expose receptors. Primary and gold-tagged secondary antibodies are added to label specific neuronal membrane receptors. The replica is mounted on a grid and visualized under an electron microscope.

Source: Sch&#246;nherr, S., et. al. Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a procedure for analyzing synaptic connectivity between medial prefrontal cortex (mPFC) and amygdala neurons using acute amygdala brain slices from mice. The mPFC neurons in these mice express channelrhodopsin fused to a fluorescent protein. The channelrhodopsins facilitate ion influx and action potential generation in the mPFC neurons upon light activation. Consequently, mPFC neurons release neurotransmitters that bind to postsynaptic amygdala neurons, triggering postsynaptic currents that are recorded to visualize mPFC-amygdala connectivity.

扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Visualization and ...

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Generation of Tilted Amygdala Slices from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The video demonstrates the generation of tilted amygdala slices from a mouse brain. The brain is positioned at an angle on the vibratome specimen stage to obtain slices containing the amygdala and axons from the medial prefrontal cortex that form synaptic connections with the amygdala. The brain slices are maintained at the physiological temperature to preserve the tissue for further experiments.

マウス脳からの傾斜扁桃体スライスの生成

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Acute Slices

	...

神経細胞培養技術

一次神経細胞培養

Generating a Coronal Brain Slice Exposing the Amygdala Regions from a Mouse Brain

Source: Bosch, D., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53628">Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the preparation of thin coronal brain slices from a murine brain, exposing the amygdala regions rich in synaptic connections from the medial prefrontal cortex. The slices are then recovered in oxygenated artificial cerebrospinal fluid to maintain neuronal viability.

マウス脳から扁桃体領域を露出させる冠状脳スライスの生成

1. Preparation of Acute Slices

	Prepare ACSF, cutting solution, tools (scissors, scalpel, forceps, spatula, Pasteur pipette), and agar blocks.
	NOTE: 1 L ...