The authors would like to acknowledge the "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comit&#233; du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Rapha&#235;lle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.

<ol>
	<li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, &. #. 2. 1. 6. ;., Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li><li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+free+C1498+(granulocytic+leukemia)+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice.">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li><li>Tanaka, K. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

以前の研究では、C1498細胞株は、急性顆粒球5、骨髄6またはNKT 7細胞白血病のインデューサーとして記載されました。しかし、文献で実証データが存在しないか、または不完全のいずれかでした。ここに提示プロトコルは、培養されたC1498細胞を特徴付けるために、それらが注入された後にマウスにおいて誘導される白血病の性質を決定するために、フローサイトメトリー、免疫蛍光、MGG染色および細胞化学的アッセイなどの様々な技術を使用します。 我々は免疫染色した後にインビトロで培養C1498細胞の表現型およびフローサイトメトリー分析時に行われたこれらの細胞は、以前に文献6,7に記載されているいくつかの細胞表面造血マーカーを発現しているため、我々はいくつかの制限を観察しました。我々の結果と一致して、ラブレらは 、フローcytometを使用C1498細胞に成熟したTCRの細胞表面発現を観察しませんでしたRY染色。それらはCD3εとTCRVβ8.2のmRNA 7を検出した後、しかし、それらは、NKT細胞株であるためにそれらを検討しました。我々はまた、細胞（&gt; 70％）のほとんどでTCRVβ鎖およびCD3ε分子の細胞内発現を観察したが、Macの-3分子の同時細胞内発現もあったので、それらの造血系統を決定することができませんでした。 ミエロペルオキシダーゼ、MGG染色および細胞化学を用いた機能性エステラーゼを分析するためのアセスメントは、C1498細胞株は骨髄起源を持っていたし、芽球と骨髄芽球から構成されていたことを実証しました。これらの結果は、フローサイトメトリー染色分析で得られたのMac-3 +細胞の割合と一致しました。定量的ではないものの、これらの手順を実行するためのキーの実験を表します。確かに、彼らは、これまでのところ、ないまたはfを表現する造血細胞の系譜と分化ステージを特徴付けるための最良の既存の方法のままEW特定の表現型マーカー。 染色フローサイトメトリーは、C1498細胞を静脈内注射した後にコンジェニックマウスにおける急性白血病の開発を実証するために役に立ちました。末梢血および様々な臓器に浸潤CD45.2 + C1498細胞を単離し、それらの周波数が決定されました。定量化はまた、免疫表現後固有髄質および脾細胞を分析するために行きました。彼らはいくつかの造血マーカーを発現したとして、C1498細胞の表現型は臓器で調べたときの制限事項が発生した（そのうちのほんの数は、B220 +でした）。観察された急性白血病の性質を定義するには、メイグリュンワルドギムザ染色し、単球及び顆粒球エステラーゼの活性の分析は、骨髄を用いて行きました。結果は、C1498細胞は骨髄単球性白血病の発症を明らかにし、彼らの骨髄芽球と単芽の形態および機能を維持したことを示しました。 <p clasS = &quot;jove_content&quot;&gt;細胞化学反応およびMGG染色を行う際のpHのエラーは結果の誤った解釈につながることができますので、このプロトコルに記載の重要なステップのための配慮では、特に注意がpHに与えられるべきです。顆粒球およびリンパ球はまた、より高いpH値で、このテストのために陽性に染色することができますので、例えば、α-ナフチル酪酸エステラーゼ活性は6.0のpHで単球細胞に特異的です。細胞を固定すると、MGG染色を行う前に、推奨、我々はC1498細胞を用いたエステラーゼ細胞化学反応を行う場合にのみCAFの固定は満足な結果を提供したことを示したされていません。フローサイトメトリーによりCD115分子とその検出の発現を維持するために、試料（ 例えば 、血液、骨髄、脾臓細胞）の全ては、手順の間、氷上に維持されるべきです。染色は、フローサイトメトリーおよび/または免疫蛍光実験を、抗体の参照、それらの記憶再において観察されていない場合表彰及びその希釈物をチェックする必要があります。材料/機器テーブルで指定された参考文献は、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光アプリケーションに設定されています。一次/二次抗体またはその共役フルオロフォアは不適当なストレージにそれらの活性を失っている可能性がある（ 例えば 、光または熱への曝露）、不適切な希釈、広範な凍結/解凍または汚染されたバッファを使用。それらが正常に機能していることを確認するために、ポジティブコントロールを実行します。目的のタンパク質を発現することが知られているマウスの骨髄または脾臓由来の細胞を使用します。高いバックグラウンドや非特異的な染色を避けるために、細胞が適切に洗浄し、（免疫蛍光のための）高湿度に保ち、指示通り抗体が希釈されていることをされていることを確認してください。正確に試料中のバックグラウンドレベルを決定するために、アイソタイプコントロール抗体と一次抗体のための同じ濃度および希釈を使用してください。エステラーゼ細胞化学実験のために、試薬は、精製マウス脾臓顆粒球（Ly6G +）および単球（CD115 +）細胞を含む陽性および陰性対照スライドを使用して試験することができます。 この研究で記載された手順は、C1498細胞の注射後のマウスにおいて観察された白血病の特徴の多くは、ヒト急性骨髄単球性白血病11,12と共通の特徴を共有していることを示しました。侵入した白血病細胞（前駆細胞および前駆体）は、成熟および未成熟骨髄造血細胞の減少をもたらしました。単球細胞であるとしてC1498細胞は、末梢血中の高頻度（&gt; 20％）で存在します。肝腫および脾腫は、白血病細胞の浸潤から生じることが観察された、およびBリンパ球および骨髄細胞の大幅な増加も脾腫を伴うことが観察されました。血小板数は、血液分析器を用いて推定したときに血小板減少も観察されました。 それはショーでしたnは、 試験管内実験で使用して、C1498細胞は、可溶性因子13を分泌することにより、通常のマウスの造血を阻害すること。いくつかの腫瘍のマウスモデルにおいて、（単球および顆粒球細胞を含む）、未熟骨髄細胞はまた、抗腫瘍特異的T細胞活性化および増殖14を阻害する脾臓を骨髄から移行することが示されています。このように、骨髄中で観察された造血細胞の減少は、造血および/またはそれらの移民からの欠乏のいずれかから生じた可能性があります。この後者のメカニズムは、末梢血中の単球の存在または脾臓の拡大骨髄性画分の観察を説明することができます。これらの細胞は、改善された脾臓造血由来していることができることも考えられます。実際に、定常状態の条件下で、脾臓B細胞のいくつかのサブセットは、成熟Bリンパ球15の前駆体として同定されました。また、炎症性の条件の下で、のmedullary幹および前駆細胞は、成熟単球16の産生を誘導するために脾臓に移転することが示されています。このプロトコルは、私たちは、白血病の発症に関与しているメカニズムに関する結論を引き出すことはできません。また、付加的な機能だけでなく、分子アッセイは、そうするために採用されるべきです。しかし、これらのデータは、急性骨髄性白血病の臨床的特徴についての詳細な情報が含まれており、研究者が新たな治療薬の効果を評価し、理解するのに役立ちます。

急性骨髄性白血病（AML）は、成熟の異なる段階でブロックされた造血骨髄細胞の制御されない増殖を特徴とします。この調節不全は、顆粒球、単球、赤血球またはmegaryocytic分化経路1に影響を与えることができます。 AML細胞は、血小板減少、リンパ球減少症および貧血になる造血障害につながる、骨髄に蓄積します。白血病細胞は、血液および非リンパ系器官に侵入します。 C1498マウスモデルは、文献には、血液中に侵入を記述するがん細胞が1941年に白血病10ヶ月齢のC57BL / 6（H-2 b）の雌性マウスから単離されたので、急性白血病のためのモデルとして何十年も使用されてきました増殖性の高いC1498細胞による、造血器官（ 例えば 、脾臓およびリンパ節）および非造血器官（ 例えば 、肝臓、肺、卵巣、及び腎臓）それらが中を経由して注入した後に感受性マウス2-4にtravenous、皮下または腹腔内経路。しかし、このマウスモデルは、2,5顆粒球または骨髄のいずれか6白血病を誘発することが報告されました。より最近では、2002年に発表された研究は、マウスNKT細胞白血病7などの癌のこのタイプを記載しました。このように、文献はこのC1498細胞株の性質と、それは、マウスにおいて誘導関連白血病に関する異なります。 70年代 - これらの矛盾は、詳細の欠如および細胞に関する更新公開されている情報と多くの研究は、1950年に行われたため、一般的には白血病疾患が主な原因です。 ここでは、C1498細胞を特徴付けるし、マウスにそれらの静脈内注射によって誘発される白血病疾患の性質を分析する方法を説明するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルの最初のセクションは、 インビトロで培養されたC1498細胞の説明に捧げられています。蛍光抗表面および細胞内の造血マーカーに対して指向体は、フローサイトメトリーを用いてそれらの表現型を決定するために使用しました。ミエロペルオキシダーゼの存在は、免疫蛍光顕微鏡を用いて評価し、その造血系及び分化段階はエステラーゼの活性を評価するために細胞化学を用いて評価し、メイグリュンワルドギムザ染色を行いました。 C1498細胞は、その後マウスに注射し、そして誘導された急性白血病の疾患は、この原稿の第二の部分に記載されています。同様の技術は、周波数および骨髄中の白血病および固有細胞、末梢血、脾臓および非造血器官（肝臓、肺）の表現型を決定するために使用しました。 このプロトコルは、非常に再現性があり、ここで提示されたデータは、研究者が新たな治療戦略の効果を評価するのに役立ちます。この白血病のマウスモデルは、すでに免疫療法に近づく試験するために使用されていますND異なる癌化学療法薬8,9。それらの有効性は、腫瘍負荷と生存率の変化を決定することによって評価しました。このプロトコルは、治療中の白血病および他の造血細胞集団の分布と生存についての追加情報を提供するために使用することができます。

a detailed protocol for characterizing the murine c1498 cell line and its associated leukemia mouse model

1941これらの注射は、急性白血病の発症をもたらすので、同系またはジェニックマウスへのC1498細胞の静脈内注射が行われています。しかし、この病気の性質は、文献に十分に文書化されていません。ここでは、 インビトロでの C1498細胞を特徴付けるためのin vivoで誘導される白血病の性質を決定するための技術的なプロトコルを提供します。この手順の最初の部分は、造血系および培養C1498細胞の分化段階を決定することに焦点を当てています。これを達成するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリー染色は、造血細胞マーカーを検出するために使用されます。免疫蛍光顕微鏡法、細胞化学およびメイグリュンワルドギムザ染色は、その後、それぞれ、ミエロペルオキシダーゼの発現、エステラーゼおよび細胞形態の活性を評価するために行われます。このプロトコルの第2の部分は、 内に誘導される白血病疾患を記述するに専用されています生体内。後者は、血液中の白血病および内在細胞の頻度を決定することによって達成造血器官（ 例えば 、骨髄および脾臓）および非リンパ組織（ 例えば 、肝臓および肺）特異的染色を使用してフローサイトメトリー分析を流すことができます。白血病の性質は、その後、骨髄中の特定のエステラーゼのためのメイ・グリュンワルドギムザ染色および染色を用いて確認されます。ここでは、年齢をマッチさせたC1498-とPBSを注射したマウスでは、このプロトコルを用いて得られた結果を示します。

C1498マウスモデルを特徴づけるために、我々は、2つの主要な手順で進めました。まず、C1498細胞は、 インビトロでの造血系および成熟段階（ 図1）を決定するために特徴づけました。これらの細胞は、その後、コンジェニックマウスに注射し、および誘導白血病疾患の性質は、異なる特徴を決定するために評価した。白血病細胞浸潤、それらの表現型は、骨髄中の造血細胞（成熟及び前駆細胞/前駆体）の定量化、周波数C1498細胞や血液や臓器の腫脹（脾臓、肝臓、および肺）と細胞組成の評価で成熟造血細胞の。 インビトロでの C1498細胞の表現型を特徴づけるために、細胞は、造血前駆体および成熟細胞（ 表1）で表される分子に対する抗体で標識し、その結果を流れcytometを用いて分析しました。RY。 C1498細胞は、Mac-1（CD11bの/ CD18）（約7％）、B220（&gt; 25％）の細胞表面発現について陽性であり、それらはCD3ε、T細胞受容体（TCR）のVβ鎖およびMacの細胞内発現を示し-3（ 図2AおよびB）。細胞は、細胞表面マーカーLy6G、Ly6C、CD115、CD21 / CD35、CD19、CD3、CD4、CD8、NK1.1、および汎NK分子についてとCD4とCD8の細胞内発現について陰性であった（データは示していません） 。次いで、それらを、造血幹細胞および前駆細胞（ 表1）のマーカーを調べました。彼らはまた、CD117、CD34、SCA-1、CD150およびCD16 / 32の細胞表面発現について陰性であった（データは示さず）。これらの白血病細胞は、その後、接着、抗原の提示および共刺激分子の発現を決定するために試験しました。細胞は、表面マーカーLFA-1（のCD11a / CD18）、CD44、CD31（PECAM-1）、及びH-2D bは発現され、CD80、CD86およびCD274（データは示していない）、MHCクラスII陰性でした。 C1498細胞トンherefore骨髄（マック-1、Macの-3）およびリンパ系マーカー（B220、CD3、TCR）の両方を発現していました。 より自分の造血系統を特徴づけるために、ミエロペルオキシダーゼの発現は、免疫蛍光顕微鏡を用いて評価しました。細胞のすべてが彼らの骨髄起源（ 図3A）を検証ミエロペルオキシダーゼ、陽性でした。細胞の大部分はまた、αナフチル酪酸エステラーゼ（ 図3B、左パネル ）について陽性染色され、そのうちのいくつかは、ナフトールAS-Dクロロ酢酸エステラーゼ（黒矢印）（ 図3B、右パネル ）について染色しました。結果は、細胞が単球および顆粒細胞の混合物を含有していることを示しています。メイグリュンワルドギムザ染色を行った後、C1498細胞は、核内で3〜5核小体、核周囲ハロ、多数の空胞及び好塩基性細胞質（ 図3C、高い核-細胞質比でブラスト様形態を表示することが観察されました）。目私たちは、C1498細胞株は、単芽球と骨髄芽球で構成されています。 C1498細胞（CD45.2 +）を、静脈内でCD45.1 +マウスに注射しました。マウスは、細胞を注入した17〜19日後に死亡しました。彼らは病気で死亡前に白血病のタイプを分析することができるように、これらのマウスを屠殺しました。 PBSを注射した対照マウスは、比較のために同一の時点で分析しました。 C1498細胞を注射したマウスは、メイグリュンワルドギムザ染色が（ 図4A）を実施した後の細胞の爆発のような外観によって示されるように、彼らの骨髄にC1498細胞の大量の浸潤を示しました。彼らはまた、急性骨髄性白血病の特徴である単芽球と骨髄芽細胞の蓄積を実証し、その単球及び顆粒球の表現型（ 図4BおよびC）を保存しました。 Dに骨髄造血細胞の数は、白血病細胞の浸潤、CD45.2 + C1498細胞、Bリンパ球、単球及び（前駆細胞、前駆体および成熟した細胞を含む）、顆粒球集団以下低かった免疫蛍光染色およびサイトメトリー分析マルチパラメトリックフローを用いて定量したかどうかをetermine。白血病細胞は、造血細胞（データは示していない）の16〜36％を占めました。他の細胞型は、全ての平均で顆粒球細胞および3倍の平均の4倍、B細胞サブセットの平均で5倍（PBSを注射したマウスよりもC1498を注射したマウスにおいて有意に低い数字に存在しましたCへの単球サブセットのために）（ 図5A）。 白血病と対照マウスの血液試料中の単核細胞の頻度の調査は、それらがリンパ球（ 図6A）の匹敵する割合が、単球の高い周波数を含むことを示しましたそして白血病細胞。これらの特性は、急性骨髄性白血病11（ 図6B）の代表です。 急性骨髄単球性白血病12の他の機能の中に、C1498-注射したマウスは、腫れ肝臓（肝腫）、肺および脾臓（脾腫）（ 図7A）を提示します。 CD45.2 + C1498細胞の様々な周波数は、免疫蛍光染色を使用して、これらの器官において検出され、解析（ 図7B）フローサイトメトリーました。脾腫浸潤した単球の高い数に起因することができ、我々はまた、脾臓集団の割合を推定しました。 Bリンパ球、単球内の細胞および顆粒細胞画分の数は2倍の平均値で、有意に大きかった、2.5倍と3倍、それぞれ、制御脾臓（ 図7C）に比べて白血病脾臓インチ薄ページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> 図1. 体外培養C1498細胞株および急性白血病のin vivoでの説明に特徴付けるためのプロトコルのセットアップの概略図。造血系および組織培養C1498細胞の分化段階を最初に決定しました。 C1498細胞は、その後、急性白血病の発達を誘導するためにコンジェニックマウスに注射しました。骨髄、末梢血、脾臓、肝臓および肺組織の単離は、C1498細胞浸潤後の周波数、表現型および形態学的変化を決定しました。 IV：静脈内MGG：メイグリュンワルドギムザ<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html>広告/ 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; in vitroで培養。ドットプロットおよび細胞表面（A）および細胞内（B）のヒストグラム代表的なフローサイトメトリー後のC1498細胞の図2.表現型分析は、造血成熟細胞分化に関連した分子が示されているC1498-表明しました。 C1498細胞は、細胞表面のCD11b、CD18およびB220マーカーまたはそのアイソタイプコントロールに特異的であった蛍光抗体を用いて、培養物から回収し、洗浄し、標識しました。細胞内染色のために、細胞を固定し、透過およびMac-3に対する抗体、CD3ε、およびTCR（T細胞受容体）のVβ鎖またはそのアイソタイプコントロールの共通のエピトープを用いて標識しました。分析は、生きた細胞でゲーティングを使用して実施した。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> ntent「FO：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> 図3.機能および培養C1498細胞の形態学的特徴付け 。 C1498細胞を培養物から採取し、顕微鏡用スライド上に遠心分離した。（A）ミエロペルオキシダーゼの発現のために染色が免疫蛍光を用いて行った。（B）細胞化学反応は、αナフチル酪酸エステラーゼ（NBE）およびナフトールAS-Dクロロアセテートエステラーゼを分析するために使用しました。 （CAE）C1498細胞における活性。細胞は茶色と赤紫色、大型の細胞質顆粒は、それぞれ、観察された各ラベルについて陽性であると考えられた。C1498細胞の（C）、メイグリュンワルドギムザ（MGG）染色。各染色実験では、顕微鏡対物倍率が示されています。各画像は、3つの別々の実験の代表です。large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> 図4.骨髄、PBS中のモルフォロジーおよびC1498-注射したマウス。骨髄細胞を、PBSおよびC1498細胞を注射したマウスから単離し、顕微鏡用スライド上に遠心分離した。（A）メイグリュンワルドギムザ（MGG）染色。（B ）α-ナフチル酪酸エステラーゼ（NBE）および（C）ナフトールAS-Dクロロエステラーゼ（CAE）関数は、細胞化学を用いて評価しました。パネルAでは、バンド（未成熟）またはセグメント（成熟した）好中球は、PBSを注射したマウスよりもC1498-注射したマウスの骨髄中の見えにくいです。パネルBおよびCは、制御骨髄において観察された数字と比較すると、白血病、骨髄中の単球や顆粒球細胞の蓄積があったことを示しています。すべて顕微鏡分析は、100X倍率の対物レンズを用いて行った。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> 髄様、PBS中の集団とC1498-注射したマウスの図5.定量分析。骨髄細胞を、PBSおよびC1498細胞を注射したマウスから単離し、細胞計数を行った後に推定しました。異なる細胞集団の頻度は、免疫染色及びサイトメトリー分析生細胞ゲーティング流れ後に測定した。（A）B細胞サブセットは、中のBリンパ球（B）、顆粒球細胞を成熟プロB細胞の段階でCD19 + B220 +細胞を含まCD3 -前駆体Aを含めてのCD11b + Ly6G +系統、ND未熟および成熟顆粒（C）単球サブセットはCD3のように定義された- 。CD115 +および単球ステージを成熟させる前駆内のセルが含まれていました。 n = 7匹のマウス/群、およびデータは、平均±SEMを示すヒストグラムとして提示されています。 ***はp &lt;0.0001 **、P &lt;0.01、PBS処置およびC1498-注射したマウスを比較した対応のないスチューデントt検定。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> PBS処置およびC1498-注射したマウスにおける単核細胞サブセットの図6.血液分析 。それぞれ、PBSおよびC1498の中でCD3 +およびB220 +細胞と定義した（A）TおよびBリンパ球の割合、のドットプロット代表的なフローサイトメトリー細胞を注射しました。及びCD115 + Ly6C high細胞-マウス（B）C1498の白血病とコントロールにおける単球細胞の頻度は、（PBS）マウスは、CD115 + Ly6Cを分析することによって決定しました。分析は、生細胞をゲーティングすることによって行いました。白血病マウスおよび対照マウスを比較するために、CD45.2 + C1498細胞が除外された。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> 白血病およびコントロールマウスにおける脾臓集団の図7.推定。 （A）は、肝臓、肺および脾臓の代表的な写真は、対照マウスと比較して、白血病マウスの腫脹。脾臓を採取し、秤量し、脾細胞を組織破壊、次のカウントしたした。デフにおける白血病細胞の頻度を表す（B）ヒストグラムを免疫染色は、CD45.2 +細胞について実施し、結果は、フローサイトメトリーを用いて分析した。（C）脾臓Bの試算、顆粒球及び単球細胞数免疫染色した後、分析ゲートフローサイトメトリー後erent器官、生CD19 + B220 +を同定しました、CD3 -のCD11b + Ly6G +、CD3 -のCD11b + Ly6C -およびCD3 -のCD11b + Ly6C high細胞。肺、脾臓および肝臓のために示されたスケールバーは1cmに示しています。 n = 5から8マウス/群、およびデータは、平均±SEMとしてヒストグラムで表現されている*はp &lt;0.05; PBS処置およびC1498-注射したマウスを比較**は p = 0.0033、対応のないスチューデントのt検定。。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbodY&gt; <tr><td> 細胞型 </td><td> 膜または細胞内分子 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 前駆体および成熟した細胞 </td><td></td></tr><tr><td> NK細胞</td><td> NK1.1 +、パンのNK + </td></tr><tr><td> NKT細胞</td><td> NK1.1 +、汎NK +、TCR Vbeta +（8.2）、CD3 + </td></tr><tr><td> Tリンパ球</td><td> TCR Vbeta +、CD3 +、CD4 +、CD8 + </td></tr><tr><td> B細胞前駆体およびBリンパ球</td><td> B220 +、CD19 +、CD21 / 35 + </td></tr><tr><td>顆粒球前駆体および顆粒球</td><td> Ly6G +、Macの-1 +、CD11bの+ </td></tr><tr><td>単球前駆体及び単球/マクロファージ</td><td> CD11b +、Macの-1 +、Macの-3 +、CD21 / 35 +、CD115 +、Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 前駆細胞 </td><td></td></tr><tr><td>多能性前駆細胞</td><td> CD117 +のSca-1+ CD34 +（LIN-CD150-） </td></tr><tr><td>リンパプライミング多能前駆細胞</td><td> CD117hi SCA-1hi CD127 +（LIN-） </td></tr><tr><td>リンパ球系共通前駆細胞</td><td> CD117lo SCA-1LO CD127 +（LIN-） </td></tr><tr><td>骨髄系共通前駆細胞</td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int（LIN-SCA-1-） </td></tr><tr><td>顆粒球 - マクロファージ前駆細胞</td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi（LIN-SCA-1-） </td></tr><tr><td>巨核球、赤血球前駆細胞</td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo（LIN-SCA-1-） </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> 造血幹細胞 </td><td> CD117 + SCA-1 + CD150 +（LIN-CD34-） </td></tr></tbody></table> 表造血細胞系統および分化の1マーカー。 CD：CD分類。林：成熟細胞のマーカー; LO：低発現;こんにちは：高発現; int型：中間式。 NK：ナチュラルキラー細胞; TCR：T細胞受容体。

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A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

この原稿は、in vitroおよびその注射後にマウスにおいて誘導される急性白血病に C1498細胞培養物を特徴付けるために使用することができる技術的手順を提供します。表現型および機能的分析は、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、細胞化学およびメイグリュンワルドギムザ染色を使用して実行されます。

マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

19.8K ビュー.  INSERM, UMR-S-1172, Centre de Recherche Jean-Pierre Aubert (JPARC). この原稿は、in vitroおよびその注射後にマウスにおいて誘導される急性白血病に C1498細胞培養物を特徴付けるために使用することができる技術的手順を提供します。表現型および機能的分析は、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、細胞化学およびメイグリュンワルドギムザ染色を使用して実行されます。 

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The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

がん研究

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em&gt;デ・ノヴォ</em&gt;乳がん転移

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

周辺照射による疲労のマウスモデル

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

サンプルおよび測定可能な残存病変と急性骨髄性白血病の白血病幹細胞を測定するプロセス骨髄に対する包括的なプロトコル

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

アデノ関連ウイルス-Cas9システムを用いた遺伝子操作マウス頭頸部癌細胞株のインビトロ確立

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role of CAFs in the tumor microenvironment can be helpful for understanding the functional importance of fibroblasts, fibroblasts from different tissues, and specific genetic factors in fibroblasts. Mouse models are essential for understanding the contributors to tumor growth and progression in an in vivo context. Here, a protocol in which cancer cells are mixed with fibroblasts and introduced into mice to develop tumors is provided. Tumor sizes over time and final tumor weights are determined and compared among groups. The protocol described can provide more insight into the functional role of CAFs in tumor growth and progression.

A protocol to co-inject cancer cells and fibroblasts and monitor tumor growth over time is provided. This protocol can be used to understand the molecular basis for the role of fibroblasts as regulators of tumor growth.

腫瘍増殖における癌関連線維芽細胞の役割を調べるためのマウスモデル

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, particularly CAR-NK cell, is one of the most promising 'off-the-shelf' development without severe life-threatening toxicity. However, the bottleneck for developing a successful CAR-NK therapy is achieving sufficient numbers of non-exhaustive, long-lived, 'off-the-shelf' CAR-NK cells from a third party. Here, we developed a new CAR-NK expansion method using an Epstein-Barr virus- (EBV) transformed B cell line expressing a genetically modified membrane form of interleukin-21 (IL-21). In this protocol, step-by-step procedures are provided to expand NK and CAR-NK cells from cord blood and peripheral blood, as well as solid organ tissues. This work will significantly enhance the clinical development of CAR-NK immunotherapy.

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Here, we present a method to expand peripheral blood natural killer (PBNK), NK cells from liver tissues, and chimeric antigen receptor (CAR)-NK cells derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or cord blood (CB). This protocol demonstrates the expansion of NK and CAR-NK cells using 221-mIL-21 feeder cells in addition to the optimized purity of expanded NK cells.

膜結合型IL-21修飾B細胞株を用いたナチュラルキラー(NK)およびCAR-NK細胞増殖法

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...