The authors thank Ms.Alisha Knudson for the editorial help. They would also like to acknowledge the financial support from the NIH/NCI (3R01CA115483, to K.S.L.), the DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, to K.S.L.), the NIH/NCI (1R01CA199668, to Y.L.), and the NIH/NICHD (1R01HD086195, to Y.L.).

倫理の声明：メス無胸腺ヌードマウス（ニュー/ニュー株）、6〜8週齢は、購入した後、AAALACガイドラインに従って病原体を含まない条件下で飼育し、任意の実験の前に、少なくとも4日間順化させたれました。全ての動物実験は、機関のガイドラインに準拠して行われ、プロトコル番号07から13119と第09から15584によると、カリフォルニア大学デービス校での動物の使用およびケア管理諮問委員会によって承認されました。 TD PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の1の合成<ol><li>丸底フラスコに、無水ジメチルホルムアミド（DMF）、氷上で寒さの10〜20 ml中のMeO-PEG 5K -NH 2（2グラム、0.4ミリモル）を溶解。 </li><li>ガラスビーカー中で、3当量を溶解します。 1-ヒドロキシ-6-クロロ - ベンゾトリアゾール（HOBt）とのエステル、3当量の。 N、N N&#39;-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、および3当量の。無水D中のカルボニル（Fmoc）2のLys-OHMF（10-15 ml）を。磁気撹拌プレート上で15〜20分間攪拌します。 </li><li>氷浴を外し、室温で一晩反応混合物を攪拌のMeO-PEG 5K -NH 2を含む反応フラスコに混合物を追加します。 </li><li>薄層クロマトグラフィー（TLC）16とカイザーテスト17（黄色が遊離NH 2が存在しないことを示している）との反応の完了を確認します。反応フラスコを氷冷エーテル約200 mlで添加することによって、（2のMeO-PEG 5K -Lys（NH-Fmocの）1）ポリマー生成物を沈殿させます。遠心分離（6,000×gで、4℃で6分）を経由して沈殿したポリマーを分離します。 <ol><li> TLCを行うために、シリカゲルでコーティングされたTLCプレート上のサンプルを見つけます。ジクロロメタン/メタノールを使用し（9：1）を移動相として。 TLCプレートを展開した後、UVランプの下でスポットを観察します。 1つはまた、ホットプレート上のアミンスポットを可視化するために染色試薬をニンヒドリン使用することができます。 </li><li>カイのためにSERのテスト、カイザーの試薬を含有するガラス管にサンプルを少し置きます。 5分間、100℃でこれを加熱して（溶液の色が黄色のままであれば、反応が完了した）色の変化を見ます。 </li></ol></li><li>再溶解する（ステップ1.4を参照）の無水DMF中の製品（10〜20 ml）を、沈殿、遠心分離を繰り返します。 </li><li>その後、繰り返しステップ1.5、および氷冷エーテルでポリマー沈殿物を3回洗浄します。 </li><li>クリーンな反応フラスコにポリマー沈殿物1を移し、残留エーテルを除去するために、高真空源にフラスコを接続します。 </li><li> 1中間体をポリマーにDMF中の20％の約20〜30ミリリットル（v / v）の4メチルピペリジンを準備して追加します。完全に溶解するまで撹拌します。 3時間の反応を実行します。 </li><li> completioを確認するためにTLC 16とカイザーのテストを（青色が遊離NH 2の存在を確認）17（ステップ1.4を参照）を実行反応のn個。反応が完了した場合、（1.4〜1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進みます。 </li><li>真空下でポリマー生成物2（のMeO-PEG 5K -Lys（NH 2）2）を乾燥させます。 </li><li> （1.1から1.7ステップ）製品3を生成する中間体2の上にカルボニル（Fmoc）2のLys-OH結合の1以上のラウンドを行う（のMeO-PEG 5K -Lys（リジン（NH-のFmoc）2）2）。脱保護（1.8から1.10ステップ）のFmoc基（4、のMeO-PEG 5K -Lys（リス（NH 2）2）2）と夫婦（1.1から1.7ステップ）カルボニル（Fmoc）のLys（BOC）-OHへ第三世代の樹枝状ポリリジン生成（5、のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 - （カルボニル（Fmoc）のLys（BOC））4）PEG鎖の一方の端部にある4つのBocおよびFmoc基で終端。 </li><li>反応フラスコに得られたポリマー中間体5を転送します。以下のように、ジクロロメタン（DCM）中の1（v / v）のトリフルオロ酢酸（TFA）：eparate反応フラスコに、1を準備します。ポリマー5の中間に1 TFA / DCM（v / v）の混合物：1 15-20 mlを加え。ポリマーが完全に溶解するまで混合物を撹拌しました。さらに3時間撹拌。 </li><li>反応の完了を確認するために（青色が遊離NH 2の存在を確認）17（ステップ1.4を参照）TLC 16とカイザーのテストを実行します。反応が完了した場合、粘性溶液が得られるまで、空気とポリマー型TFA / DCM混合物を蒸発させます。 （1.4から1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進んでください。真空下で- （（（のFmoc）のLys（NH 2））4 -Lys-Lysの2のMeO-PEG 5K）ポリマー生成物6を乾燥させます。 </li><li>反応フラスコに6中間転写ポリマー。 8当量を含む無水DMFの約40ミリリットルを使用してください。 Nの、N個の -diisopropylethylamiNE（DIEA）は、ポリマー中間体6を溶解しました。ガラスビーカー中で、12当量を溶解します。 HOBt、12当量。 DIC、および12当量の。無水DMF 20〜25ミリリットル中にカルボニル（Fmoc）のCys（Trtの）-OHの。 10〜15分間振盪し、次いで6を含む反応フラスコに反応混合物に加えます。一晩反応を実行します。 </li><li> TLC 16とカイザーのテストとの反応の完了を確認し（ステップ1.4を参照してください。黄色は遊離NH 2が存在しないことを示している）17。 （カルボニル（Fmoc）のLys - - （カルボニル（Fmoc）のCys反応が完了した場合、（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2生成物7を単離するために、生成物1（ステップ1.4〜1.6）で述べたように、エーテル沈殿に進み（Trtの）））4。 </li><li>ステップ1.8で概説したように、7上のFmoc脱保護を行い、生成物8を得るために、（PEG 5K -Lys-Lysの2 - （Lysの（NH 2） - （Cysを（NH 2）（Trtの）））4）。カップルカルボニル（Fmoc）-PEG 2 -Suc-OH（「EBES「リンカー、24当量）ポリマー中間体上の中間9（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4得るためのHOBt / DIC媒介カップリングのために上に概説した手順を使用して- （システイン（Trtのを） ）4（EBES（NH-のFmoc））8）。 </li><li> Fmocの脱保護の1以上のラウンドを実行します（1.6から1.8ステップ）中間体10を取得する（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4 - （システイン（Trtの））4（EBES（NH 2））8）。 </li><li>反応フラスコにポリマー中間体10を転送し、それを溶解させ、無水DMF（30〜40 ml）を追加します。別の反応フラスコに、24当量を溶解します。無水DMF中の（以前に公開された手順に従って調製）CAOSu（20〜ml）を18。 48当量を追加します。 N、N-ジイソプロピルエチルアミンの、それは10〜15分間攪拌しましょう。 10を含有する反応フラスコに内容物を移し、反応はO実行してみましょうvernight。 </li><li> TLC 16とカイザーのテストとの反応の完了を確認し（ステップ1.4を参照してください。黄色は遊離NH 2が存在しないことを示している）17。 （のCys（Trtの））4 -Ebes -反応が完了した場合、製品11（のMeO-PEG 5K -Lys-Lysの2 -Lys 4を分離するために（1.4から1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進みます8 -CA 8）。脱イオン水の中に透析し、白色粉末を得た試料を凍結乾燥。 </li><li>反応フラスコに中間体ポリマー11を配置します 。準備し、ポリマー溶液にTFA / 1,2-エタンジチオール（EDT）/トリエチルシラン（TIS）の20ミリリットル/ H 2 O（94 / 2.5 / 1 / 2.5、v / v）の混合物を追加します。完全に溶解するまで混合物を攪拌します。 4時間の反応を実行します。 TLC 16により反応の完了を確認してください。 </li><li>ヒュームフードの下では、ポリマー-TFA / EDT / TIS / H 2に空気を吹き込みますOの混合溶液が粘性になるまで。最終製品、12（PEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8）を単離するために、（1.4〜1.6ステップ）製品1で述べたように、エーテル沈殿に進んでください。アセトニトリル中に溶解し、白色粉末を得、それを凍結乾燥。 </li></ol> PTX装填ミセルの調製<ol><li>標準的な蒸着法を用いて、PTX-ロードPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8ミセルを準備します。 <ol><li>クロロホルムの1ミリリットル（のCHCl 3）でPTXの異なる量（1-9 mg）を用いてTD 20mgを溶解させます。均質、乾燥ポリマーフィルムを得るために、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去します。薬物負荷ミセルの形成を可能にするために、必要に応じて、40 kHzで30分間超音波処理に続いて、ボルテックスによってリン酸緩衝食塩水（PBS）1mlでフィルムを再構成します。 </li><li> 3％の6μlの（w / w）のH 2 O 2（1当量を追加します。FRにTD上のチオール基を酸化する）チオール基をEE。エルマン試験19で示すように、遊離チオール基のレベルは、一定の低い値のままで一度、さらなる特徴付けのためのミセル溶液を使用してください。 </li><li>サンプルを滅菌するために0.22μmのフィルターでソリューションをフィルタリングします。 9回のアセトニトリルを添加し、超音波処理の10分を実行することによって、ミセルからの薬物を解放した後、HPLC 20システムにミセルに装填された薬物の量を分析します。移動相としてアセトニトリル/水を用いてHPLC用C18カラムを使用してください。 </li><li> HPLC面積値と11の標準的な薬剤の濃度の間の検量線による薬物負荷を計算します。 注：充填効率が初期薬物含量のミセルに装填薬の比として定義されます。 </li></ol></li></ol>ミセルの3キャラクタリゼーション<ol><li>メートルのサイズとサイズ分布を測定動的光散乱（DLS）測定器29でicelles。室温で測定を行い、1mg / mlのでミセル濃度を保ちます。 注：粒度分析を行うブランクとしてPBSを使用し、実際のサンプルについて粒子サイズを記録します。サンプルのための三連で測定値を取り、その後、測定値を平均します。 </li><li>以前に13,21説明したように、疎水性蛍光プローブとしてピレンとの架橋の前と後のPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8の臨界ミセル濃度（CMC）を測定する蛍光スペクトルを使用してください。 注：一般的に、ミセル濃度は、5×10 -7〜5×10 -4 Mの範囲であります</li></ol> 4. SDS中のミセルの安定性を持つか、エージェントを低下させることなく、 <ol><li> PBS中のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液（7.5 mg / mlで）およびジスルフィド架橋ミセル（1.5 mg / mlで）のストック溶液を調製します。次に、U最終SDS濃度がである、混合溶液を作り、原液を歌う2.5ミリリットルミリグラム/及びミセル濃度が1.0 mg / mlでです。 </li><li> 10mMのグルタチオン（GSH）の存在の有無にかかわらず、所定の時間間隔でミセル溶液の（段階3.1で述べたように）サイズおよびサイズ分布を測定します。 </li></ol> 5.溶血アッセイ<ol><li> PTX-ロードされ、非架橋ミセル（PTX-NCMS）の溶血可能性を評価する以前に公開された手順11に従って製造から収集ヌードマウスから新鮮なクエン酸処理血液を用いて、PTX-ロード架橋されたミセル（PTX-のDCM）テールベール。 <ol><li> 2％の最終濃度まで、10分間1000×gで血液試料（1.0 ml）を、遠心分離によって赤血球を収集するPBSでそれらを3回洗浄し、次いでPBSで再懸濁細胞ペレット。 </li></ol></li><li>異なる濃度（0.2および1.0で赤血球懸濁液200μlを混ぜますそれぞれPTX-NCMSとPTX-のDCMのmg / mlで）、およびインキュベーターシェーカー中で37℃で4時間インキュベートします。 </li><li> 5分間、3000×gでミセル - 赤血球混合物を遠心します。 96ウェルプレートに、すべてのサンプルの上清100μlを移します。マイクロプレートリーダーを用いて540nmで上清中の遊離ヘモグロビンの吸光度を測定します。 注：トリトン-100（2％）とPBSとインキュベートしたRBCを、それぞれ、陽性対照および陰性対照として使用されます。 - /（OD ポジティブコントロール - OD ネガティブコントロール ）×100％RBC溶血=（OD ネガティブコントロール OD サンプル ）：RBCの溶血パーセントは以下の式で計算されます。 </li></ol>

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Y. Li and K.S.L. are the inventors of a pending patent on reversibly crosslinked micelle systems (US patent application 61/485,774). K.S.L. is the founding scientist of LamnoTherapeutics Inc., which plans to develop the nanotherapeutics described in the manuscript. The remaining authors declare no competing financial interests.

いくつかのナノ粒子は、薬物送達におけるそれらの潜在的使用のために検討されています。リポソームドキソルビシンおよびパクリタキセル（PTX）は、ヒト血清アルブミンナノ凝集物は、癌治療のためにFDAによって承認さnanotherapeutics間にある-loaded。臨床的に有効なものの、これらnanotherapeuticsの両方のサイズが比較的「大」であり、それらは肝臓および肺に蓄積する傾向があります。比較的?...

ナノテクノロジーは、生物医学分野1の数を恩恵を受けている高速新興分野です。ナノ粒子は、従来の治療法の他の種類と実現不可能な特性を設計およびチューニングのための機会を提供しています。ナノキャリアは、生分解に対する薬物の安定性を向上させる、薬物の循環時間を延長、薬物の溶解度の問題を克服し、および標的薬物送達のために、1,2-同時送達造影剤のために微調整することができます。ナノ粒子ベースの送達システムは、癌の画像化および治療に有望です。腫瘍血管系は、巨大分子への漏出性であり、強化された透過性および保持（EPR）効果3を介して腫瘍部位でのナノ粒子の循環の優先的な蓄積につながることができます。積極的に抗がん剤の担体として追求されているいくつかのナノキャリア（ 例えば、リポソーム、ヒドロゲル、および高分子ミセル）の中でも、高分子ミセルは、番目の上に広い人気を得ています電子十年間4,5。 高分子ミセルは、静脈内投与には、潜在的にユニマーにそれらの解離をもたらす、臨界ミセル濃度（CMC）以下に希釈することができる、熱力学的システムです。架橋戦略はユニマーにミセル解離を最小化するために使用されてきました。しかし、過度に安定化されたミセルは、それによって全体的な治療効果を低下させる、標的部位での放出の薬物を防止することができます。いくつかの化学的アプローチが作るために検討されている架橋酸化還元に応答して、または、そのような還元可能なジスルフィド結合6,7およびpH-切断可能な8または加水分解可能なエステル結合の9,10などの外部刺激に分解可能。 我々は以前11-15 telodendrimers（TD）と呼ばれる樹状コール酸（CA）ブロック、直鎖ポリエチレングリコール（PEG）コポリマーからなるミセル、ナノ粒子の設計および合成が報告されています</SUP&gt;。これらのTDは、PEG NK -CAyとして表現されている（キロダルトンではn =分子量（K）、yはコール酸（CA）単位の数を=）。それらは、疎水性コア中のパクリタキセル（PTX）およびドキソルビシン（DOX）などのカプセル化薬剤におけるそれらの小さなサイズ、長い貯蔵寿命、及び高い効率によって特徴付けられます。例えばPEG、リジン、およびCAなどTDのビルディングブロックは、生体適合性であり、そしてPEGコロナの存在は、細網内皮系によってミセル化ナノ粒子の非特異的な取り込みを防止する、「ステルス」ナノ粒子特性を付与することができます。 チオール化線形樹枝状ポリマーは、簡単に私たちの標準のTDの樹状オリゴリジン骨格にシステインを導入することによって生成することができます。この記事では、のTDの疎水性コア（ 図1）にジスルフィド架橋を導入することによって、可逆的に架橋されたミセル薬物送達システムを製造するための容易なプロトコルを提示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="795">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">MeO-PEG5K-NH2</td>
			<td style="width:105px;">Rapp Polymere</td>
			<td style="width:119px;">125000-2</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">AFK107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;">AS-20132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>Aapptec</td>
			<td>AAC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethylformamide</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl ether</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E134-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6508</td>
			<td>Corrosive, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-methyl piperidine</td>
			<td style="width:105px;">Alfa-Aesar</td>
			<td style="width:119px;">L-02709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ebes linker</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td>AS-61924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">02390</td>
			<td>Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">233781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform (anhydrous)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrogen peroxide solution 30%</td>
			<td style="width:105px;">Aaron Industries</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HoBt-Cl</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">CXZ096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6&#8211;8 weeks age</td>
			<td colspan="2">Harlan (Livermore, CA)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facile and efficient approach for the production of reversible disulfide cross-linked micelles

ナノメディシンは、生物医学アプリケーションのスケールでナノメートルの粒子の独特の特性を活かした治療の新たな形です。治療結果を最大にするために、薬剤に関連する副作用を軽減するための薬物送達を向上させる現代のナノ医療の基礎の一部です。特に、ナノ粒子は、癌治療に広く応用されています。デザイン、アプリケーション、および腫瘍の微小環境に基づいて、生産の高度な柔軟性を提供するナノ粒子は、臨床診療への迅速な翻訳をより効果的であることが予測されています。高分子ミセル、ナノキャリアは、薬物送達用途のために人気があります。 この記事では、我々は明確に定義された両親媒性の線状の樹状共重合体（telodendrimer、TD）の自己組織化に基づく薬物負荷、ジスルフィド架橋されたミセルを合成するためのシンプルで効果的なプロトコルを記述します。 TDは、ポリエチレンGLから構成されています親水性セグメントおよび溶液ベースのペプチド化学を用いて、アミン末端PEGに段階的に取り付けられたコア用疎水性部分としてチオール化コール酸クラスタとしてycol（PEG）。例えば、パクリタキセル（PTX）のような化学療法剤は、標準的な溶媒蒸発法を使用してロードすることができます。 O 2媒介性酸化は、以前のTD上の遊離チオール基からイントラミセルジスルフィド架橋を形成するために利用されました。しかし、反応が遅く、大量生産のために実行可能ではなかったです。最近、H 2 O 2媒介酸化法は、より実現可能かつ効率的な方法として調査し、それが以前に報告された方法よりも96倍高速でした。このアプローチを用いて、PTX装填、ジスルフィド架橋されたナノ粒子50gを正常に狭い粒度分布および高い薬物負荷効率で製造されています。得られたミセル溶液の安定性は、共培養Wなどの破壊条件を用いて分析します還元剤を伴うまたは伴わない洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム、第i。その非架橋対応物と比較した場合、薬物負荷、ジスルフィド架橋されたミセルは、以下の溶血活性を示しました。

薬物ロードされ、ジスルフィド架橋ミセルの調製とキャラクタリゼーション 両親媒性ポリマーPEG 5K -Cys 4 -Ebes 8 -CA 8は、癌薬物送達のためのジスルフィド架橋ミセル系を形成することができる樹枝状ポリマーです。構造的には、分枝状ポリ（リジン - システインEBES）バックボーンを介して線状PEG分子?...

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A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

リバーシブルジスルフィド架橋ミセルの生産のための簡便かつ効率的なアプローチ

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.8K ビュー.  University of California, Davis. To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

生化学

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is not completely understood. All proteasomes contain a structurally conserved core particle (CP), or 20S proteasome, containing two heptameric&#160;&#946; subunit rings sandwiched between two heptameric&#160;&#945; subunit rings. Archaeal 20S proteasomes are compositionally simpler compared to their eukaryotic counterparts, yet they both share a common assembly mechanism. Consequently, archaeal 20S proteasomes continue to be important models for eukaryotic proteasome assembly. Specifically, recombinant expression of archaeal 20S proteasomes coupled with nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) has yielded many important insights into proteasome biogenesis. Here, we discuss a means to improve upon the usual strategy of coexpression of archaeal proteasome &#945; and &#946; subunits prior to nondenaturing PAGE. We demonstrate that although rapid and efficient, a coexpression approach alone can miss key assembly intermediates. In the case of the proteasome, coexpression may not allow detection of the half-proteasome, an intermediate containing one complete &#945;-ring and one complete &#946;-ring. However, this intermediate is readily detected via lysate mixing. We suggest that combining coexpression with lysate mixing yields an approach that is more thorough in analyzing assembly, yet remains labor nonintensive. This approach may be useful for the study of other recombinant multiprotein complexes.

This protocol uses both subunit coexpression and postlysis subunit mixing for a more thorough examination of recombinant proteasome assembly.

組換え古細菌プロテアソームおよび非変性PAGEでプロテアソームアセンブリを調べる：複合的アプローチのためのケースを

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

定量的トランスクリプトーム解析に使用するための種子から高度に精製されたRNAの単離のための効率的な方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

酵素的に活性G4 Resolvase1の精製のためのG-四重鎖DNA親和性のアプローチ

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

アフィニティクロマトグラフィー樹脂の急速な発達のための活性化架橋アガロース - ケーススタディとしての抗体捕捉

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...