この作品は中国の国家自然科学基金からの助成金によって支えられた (号 81100159、修習ライ; 81401147、区張)、医療と健康科学プログラムの浙江省 (号 201646246、修習 Lai)、健康科学、杭州市 (第 2013A28 号、丁林) の技術計画。

機関動物のケアと使用実験研究センター、中国医学科学の中国アカデミー、浙江大学委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動物実験を行なった。
 1 ソリューション準備 <ol><li>表 1 で説明したようにすべてのソリューションを準備します。</li></ol>。
 2 分離の左心室 (LV) 心筋 注: 左心室心筋細胞は酵素によって前述 7 Langendroff 灌流システムを使用して分離、、。 8 , 9 , , 10 11.
<ol><li>Langendroff 灌流システムのセットアップ。通常 Tyrode (NT) ソリューションで灌流システムを埋める、36.5 ° C の温度設定、チューブに空気の泡を排除します</li>。
	<li>は、重さし、抱水クロラール (400 mg/kg) の腹腔内注入 (ip) による Sprague-dawley ラットの麻酔。5 分後尻尾や足指のピンチの応答を評価することで麻酔状態を確認</li>
	<li>手術用ハサミで剣状突起下腹腔内を開く、剣状突起を持ち上げ、シザーと胸を開きます。心膜を削除、わずかに持ち上げ心カーブタイプ鉗子で、大動脈弓を識別、心臓から大動脈のルートから鋏による切断します</li>。
	<li>は、60 mm ディッシュに心を転送し、NT ソリューションで洗っています。大動脈を持つ 2 つの微細解剖鉗子と蛍光灌流カニューレにマウントし、しっかりと縛る手術用縫合糸を使用してカニューレに大動脈 。
	注: 熟練したオペレーターが 15 内でこのプロセスを終えることができる s.</li>
	<li>は、冠状動脈の循環を回復する 30 mL NT ソリューションと心臓を灌流します。その後、液を 30 mL Ca 2 + に切り替える-無料の枝 (10 mM タウリン、1 mg/mL BSA) ハートビートを停止します。次に、コラゲナーゼ、分離ソリューション (0.6 mg/mL) 酵素の消化力のために、出納を切り替えます 。
	注: 使用コラゲナーゼは糖尿病ラットやコラゲナーゼ II での実験のための実験の糖尿病ラットなし</li>。
	<li>20-25 分の消化力の後すぐに Ca 2 + を灌流液を変更-無料の消化をさらに停止する枝。中心部を鉗子で保持、カニューレから切って、KB ソリューションを含む 35 mm ディッシュの中心の場所 (テーブル 1 を参照).</li>
	<li>解剖はさみ鉗子と左心室壁です。心房、右心室、房室接合部を切った。残りの組織は LV です。KB ソリューションと新しい 35 mm ディッシュにそれを転送します。LV の組織を細かくミンチします</li>。
	<li>ゆっくりピペットのフィルター処理されたプラスチック スポイト入りと 10 mL KB ソリューションで再停止します</li>。
	<li>は、150 μ m 絞りステンレス フィルター、および 15 mL 遠心管への転送の細胞をフィルター処理します。30 s と破棄上清の 150 x g で遠心分離機します。再 10 mL KB ソリューション、無料で細胞が 6 分のために解決を中断、上澄みを廃棄し、再 10 mL KB ソリューション内のペレットを中断します 。
	注: すべての手順を 100% O 2 毒ガス ソリューションで 36 ° C で行った</li>。
</ol> 3。カルシウム再導入 <ol><li>KB ソリューションで 20 分間定住した後、上澄みを廃棄し、カルシウムの再導入溶液を細胞を再停止 (0.3 mM Ca 2 +、4.5 mL Ca 2 +-無料枝、1.5 mL NT ソリューション)10 分</li>
	<li>カルシウム再導入液と B で上記の手順を繰り返します (0.3 mM Ca 2 +、3 mL Ca 2 +-無料枝、3 mL NT ソリューション).</li>
	<li>は、NT ソリューション (1.2 mM Ca 2 +) で利用可能な細胞を浄化するために上記の手順を繰り返します。このソリューションで孤立した左心室心筋細胞を保存し、研究それらを 4-6,</li>
</ol> 4。設定上の灌流システム <ol><li>NT ソリューション室灌流 ( 図 1 a) の流入管を接続します</li>。
	<li>ターゲット細胞針灌流、多バレルのマニホールド ヒント (例えば、灌流鉛筆、今後鉛筆と呼ばれます) に接続、マニピュレーターで修正、バルブに灌流システムを制御します。NT ソリューションと 10 mM カフェイン ソリューションを鉛筆 ( 図 1 a) の各列に追加します</li>。
	<li>をはずして空気管に空気の泡を避難</li>。
	<li>10 鉛筆数ミクロンの先端から点滴をカウント s、3 ドリップ/10 s のおおよその速度で流れの速度を保つために流量制御を手動で調整</li>
</ol> 5。細胞内 Ca 2 + 過渡的筋節の短縮 7 , 8 , 9 測定 <ol><li>スライドで、ピペット 10 μ L 細胞懸濁液顕微鏡で細胞カウンターで細胞数をカウントし、密度を計算します。おおよそ 50,000 セル/ml 濃度に細胞を希釈します</li>。
	<li>2 μ M に最終濃度をもたらす細胞の懸濁液 1 mL に追加 Fura 2 アセトキシメチルセファロスポリン (午前) 株式 (カルシウム敏感な染料) を室温で 20 分間暗闇の中で保持します</li>。
	<li>150 g で 30 s、および再中断 2 時間を NT ソリューションと心筋細胞間遠心します</li>。
	<li>ターン、光と暗闇の中で細胞を維持します。15 分用灌流チェンバに筋紡錘を配置します。その後 NT ソリューション室灌流 (1.5 mL/分) を開始します。5 分刺激 (波期間 4.0 ms パルス振幅 8.0 V) を使用して 1 Hz 刺激と筋紡錘のペース</li>
	<li>形のよい細胞を選択 (棒状、鋭いエッジ、およびクロス縞をオフに)、顕微鏡の対物レンズ × 10 の下で安定した刺激収縮 (自発収縮なし)。次に、顕微鏡の倍率を 40 倍に変更し、水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転します</li>。
	<li>フレーム単一心筋細胞フレーミング アダプターを調整することによって。バック グラウンドが明確であることを確認します</li>。
	<li>340 または 380 nm 波長励起フィルターとキセノン ランプが発する光を細胞を公開し、40 × 対物を介して細胞をイメージします。510 で蛍光シグナルを検出 nm。一方で、心筋の筋節長変化に注意してくださいし、同時に柔らかい端モジュールを使用して記録します</li>。
	光電子増倍管の二重励起蛍光測定システムによる <li>レコード蛍光。カルシウム イメージング システムの録音プログラムを実行をクリックして &#34; ファイル/新しいファイル &#34; 新しい記録ファイルを作成し、クリックする、&#34; 開始 &#34; 蛍光および筋節の長さを同期的に記録します</li>。
</ol> 6。SR Ca 2 + リザーブと拡張期の Ca 2 + 除去機能 7 , 8 , 9 評価 <ol><li>Interlink、&#34; Aux アウト &#34; ポート刺激、&#34; アナログの &#34; バルブ制御システムのポート (例えば バルブの司令官、材料表 を参照) (TTL 信号を同期) に BNC ケーブルで</li>。
	<li>プリセット前述 8 , 9; として自動的に灌流バルブの切り替えのためのプログラム操作の詳細な手順については、次として表示されます。
	<ol><li>プリセット 表 2 に従って、ソフトウェアを制御し、バルブ内のパラメーター、&#34; ダウンロード &#34; プログラムにロード シーケンスをダウンロード] ボタンをクリックします。クリックして、&#34; ・ トリッグ小胞体 &#34; トリガー関数を有効にする] ボタンをクリックします 。
		注: バルブ制御システム TTL 信号を受信した後のシーケンスを実行することができます</li>。
		<li>シーケンス モードに刺激をプリセットし、表 3 に従ってパラメーターを設定します</li>。
	</ol></li> <li>で刺激を設定 &#34; S1 ステップ &#34; LV のペースを細胞 1 Hz では NT ソリューションを 1.5 mL/min の速度で針灌流を開始。 。
	注意: 針ストリームの速度は灌流チャンバーよりも速く、針のストリームの光の屈折が灌流チャンバーの光の屈折とは異なる。光の屈折の違いは、ターゲット細胞をとりまく効果的な針灌流の範囲を示します</li>。
	<li>選択 (上流に下流のシーケンス) の低消費電力ミクロな視点の下でターゲット細胞と確認されるによって到達できる鉛筆のマイクロ チップ。顕微鏡の倍率を 400 倍に変更します。水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転させます。筋紡錘を格納する適切なウィンドウにセル フレーミング アダプターの下の長方形の開口部を調整します。最小限の背景があることを確認します。他の細胞またはこのウィンドウで死んだ細胞の残骸を認めていない</li>。
	<li>鉛筆、マイクロマニピュレーターの固定の位置を調整し、顕微鏡倍率 x 400 未満ターゲット細胞に視界の半径の距離でマイクロ チップを慎重に配置します</li>。
	<li>主ターゲット細胞をカバーし、心筋が針流れによって一掃できないことを確認してください針ストリームの範囲を調整します</li>。
	<li>後 60 s の基本的なペーシング、カーソルを刺激する、&#34; D2 ステップ &#34;. 
	注: プロトコルの残りの部分は、刺激とバルブ コントロール システムによって自動的に実行されます。上記の設定に基づき、プロトコルが自動的に実行される 図 2 a、1 Hz 基本 60 NT ソリューションとペーシングのように s。ペーシングと 2 の遅延、一時停止 s、15 の 10 mM カフェイン灌流に急速に切り替える (機能的、SR 内の Ca 2 + ストレージをリリース) を s、NT ソリューションに切り替えてと</li>。
	<li>記録の最後に、個々 の細胞のバック グラウンド蛍光を検出します。クリックして、&#34; 一時停止 &#34; ミクロな視点を近く空白エリアに移動記録、ファイルを一時停止するボタンです。クリックして、&#34; レコード &#34; 秒の記録を再開するボタンをクリックし、バック グラウンド補正の数値 340 と 380 nm の強度値を記録します</li>。
	<li>オープン、&#34; 操作/定数 &#34; ダイアログ ボックスでに値を入力し、&#34; 背景 &#34;、それぞれを形成; ソフトウェアは、バック グラウンドを引いて Fura 2 比率値を修正できます</li>。
</ol> 7。データ分析 9 <ol><li>カルシウム トランジェントおよび基本的なペーシングの段階で短縮筋の測定、収縮パルスの平均値、カルシウム濃度、時定数などの動的パラメーターを分析します。カルシウム一時的な崩壊 (タウ 1 Hz)、自動的にソフトウェアを使用しています 。
	注: ソフトウェアの decay セグメントがうまく適合しない場合は、手動のモノラル指数曲線のあてはめの減少トレースをエクスポートします</li>。
	<li>カフェイン誘発性カルシウム パルス カルシウム除去機能の解析のための急な波とパルスのみを選択します。信号障害、異常パルスまたはそれらの距離の中間を流れていたセルを除外します</li>。
	<li>カフェイン誘発性カルシウム パルス (Ca-カフェイン、方式 2 + 予備のインデックス) の振幅を測定します</li>。
	<li>モノラル指数曲線あてはめ (10 時間) 手動でソフトウェア ( 図 2) からカフェイン誘発性カルシウム パルス (タウ カフェイン) の減衰時定数を取得します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca+(2+)-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat.">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80 (2015).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+decay+of+Ca2++homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy.">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes.">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy.">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li><li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility.">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li><li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects.">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+inhibition+in+heart+failure,+beneficial,+harmful,+or+both.">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+inhibitor,+fasudil,+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling.">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII&#948;+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes.">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKII&#948; Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII{delta}+knockout+mice.">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li><li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+in+cardiomyocytes:+Role+of+adenine+nucleotide+translocase.">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li><li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2++release+channel+(RyR2)+and+Ca2++homeostasis+in+rat+heart.">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart.">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li></ol>

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SR からリリースされたカルシウム変化は心臓の収縮の Ca2 +の主要な源です。程度、SR Ca2 +コンテンツの振幅および小数部の Ca2 + SR からリリース心筋収縮のため利用できる SR Ca2 +予備を反映します。その一方で、SR の Ca2 +予備は拡張期12,13,14の間に SR で SR Ca2 +再取り込み、Ca<...

細胞内カルシウム ([Ca2 +]私) リサイクル1心筋細胞の収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ご存知のように、カルシウム誘発性 Ca2 +放出は収縮する電気信号に変換するカップリング、興奮収縮を開始します。膜の脱分極は、細胞膜の L 型 Ca2 +チャネル、Ca2 +を引き起こすはリアノジン受容体 2 (RyR2) を介した細胞質に SR からの解放をアクティブにします。一時的な上昇細胞質 Ca2 +筋原線維の収縮を開始します。期には, 細胞質 Ca2 +は SR Ca2 +による SR に reuptaken-atp アーゼ 2 (SERCA2) と、Na+-Ca2 +交換 (NCX)2を介して心筋のポンプ。このプロセスはリサイクル、心筋収縮緩和に します。
心臓の SR は収縮機械を囲む細胞内膜ネットワークです。それは収縮の Ca2 +貯水池として機能、それがリラクゼーションの中に細胞内 Ca2 + reabsorbs。ビートを利用できる SR Ca2 +予備は心収縮力の確定です。一方、心臓の拡張期の細胞内 Ca2 +の除去が欠かせません。いくつかの病態生理学的条件下で糖尿病、心不全、障害 Ca2 +クリアランス、落ち込んで SR Ca2 +など心筋に店が関与している心機能低下2,3 ,4。
SR Ca2 +放出と拡張期心筋細胞 Ca2 +除去を測定するために、広く使用されている方法の 2 種類があります: パッチ ・ クランプ5,6、およびカフェイン誘発性 Ca に基づいて NCX 電流の整合性2 + Ca2 +蛍光イメージング7,8,9に基づくパルス。前者のアプローチは、Ca2 + SR から解放主ポンプでくまれるセルから NCX によって事実に依存します。ただし、このアプローチは、高度な設備・熟練作業の条件によって制限されます。本研究では Ca2 +パルスのカフェイン誘発性の Ca2 +蛍光イメージング システムに基づく測定による SR Ca2 +リザーブと心筋細胞の Ca2 +除去を評価するための便利な方法をについて説明します。簡単に言えば、細胞内 Ca2 +蛍光はフラ 2 で示されます。連動した刺激システムと灌流システム、によって灌流の切り替えとシステムを自動的にペーシングのためのプログラムを提案します。10 mM カフェインを用いて急速に SR で総 Ca2 +放出を誘発します。カルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス指数関数的減衰時定数 (タウ) は、それに応じて拡張期の Ca2 +除去 SERCA と NCX の貢献を反映するモノ指数曲線の当てはめから得られました。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>E31K43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>I02T070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>G22u018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPEs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBM 7880V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10189341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10154048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10144B17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>F21S033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>C31U038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10149849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J5407a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBM6826V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>45k16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>735094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langendorff system</td>
			<td>Beijing Syutime Technology Co</td>
			<td>PlexiThermo-S-LANGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Marchauser</td>
			<td>MM33 links</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>FHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td>
			<td>ALA</td>
			<td>VC 3-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve commander software</td>
			<td>ALA</td>
			<td>VC 3 1.0.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision flow regulator</td>
			<td>Delta Med</td>
			<td>3204315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>04-08-[360]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron Removable Tip</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>360um i.d.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>Hyperswitch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording software</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>IonWizard 6.2.59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MyoPacer EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-dawley rats</td>
			<td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td>
			<td>SCXK 2016-01-007436</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。心筋の筋小胞体 (SR) は、reuptakes 細胞内 Ca2 +安静時の収縮の Ca2 +貯水池として機能します。ビートを利用できる SR Ca2 +予備は心筋収縮性の予測、細胞内 Ca2 +の除去は、心臓の拡張機能のために重大。糖尿病、心不全など、いくつかの病態生理学的条件下で障害カルシウム クリアランスと心筋細胞の Ca2 +ストアは、心機能低下の進行状況に関与する可能性があります。ここでは、方式2 +リザーブと拡張期の Ca2 +除去を評価するプロトコルについて述べる。簡単に言えば、単一心筋細胞が酵素によって分離され、フラ 2 で示された細胞内の Ca2 +蛍光カルシウム イメージング システムによって記録されました。合計 SR Ca2 +放出を誘発するためにカフェインを採用するには、連動した刺激システムと灌流システムによって自動灌流スイッチ プログラムをプリセットします。その後、モノラル指数曲線のあてはめカルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス減衰時定数を分析に用いる。したがって、SR の Ca2 +の貢献-ATPase (SERCA) と Na+-Ca2 +交換 (NCX) 拡張期のカルシウムの除去を行った。

ストレプトゾトシン (STZ) - 誘発糖尿病ラット (DM) と年齢をマッチさせたスプレイグ - を示すここで、ドーリー (SD) ラットの例。8 週齢雄 SD ラット (200 ± 20 g) は、管理グループのための DM グループまたはクエン酸バッファーの STZ (70 mg/kg, ip) の単一腹腔内注射を受けた。STZ 投与後 1 週間ラット血糖値と &#62; 16.7 ミリ モル/L が糖尿病と考えられていた。8 週間後左心室心...

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Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2 +リザーブと心筋拡張期のカルシウム除去機能を評価するためのプロトコルについて述べる。

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

assessment-sarcoplasmic-reticulum-calcium-reserve-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K ビュー.  Zhejiang University School of Medicine. 細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2 +リザーブと心筋拡張期のカルシウム除去機能を評価するためのプロトコルについて述べる。

ビデオ: Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of cardiovascular disease. Although molecular biology is necessary in identifying key changes in the signaling pathway, it is not a surrogate for functional significance. While physiology can provide answers to the question of function, combining physiology with biochemical assessment of metabolites in the intact, beating heart allows for a complete picture of cardiac function and energetics. For years, our laboratory has utilized isolated heart perfusions combined with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to accomplish this task. Left ventricular function is assessed by Langendorff-mode isolated heart perfusions while cardiac energetics is measured by performing 31P magnetic resonance spectroscopy of the perfused hearts. With these techniques, indices of cardiac function in combination with levels of phosphocreatine and ATP can be measured simultaneously in beating hearts. Furthermore, these parameters can be monitored while physiologic or pathologic stressors are instituted. For example, ischemia/reperfusion or high workload challenge protocols can be adopted. The use of aortic banding or other models of cardiac pathology are apt as well. Regardless of the variants within the protocol, the functional and energetic significance of molecular modifications of transgenic mouse models can be adequately described, leading to new insights into the associated enzymatic and metabolic pathways. Therefore, 31P NMR spectroscopy in the isolated perfused heart is a valuable research technique in animal models of cardiovascular disease.

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Langendorff-mode isolated heart perfusion, in conjunction with 31P NMR spectroscopy, combines the fields of biochemistry and physiology into one experiment. The protocol allows for the dynamic measurement of high energy phosphate content and turnover in the heart while concurrently monitoring physiologic function. When performed correctly, this is a valuable technique in the assessment of cardiac energetics.

使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 P NMR分光法

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

医学

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

経胸壁心エコー検査による肺動脈狭窄のマウスモデルにおける右室の構造と機能の評価

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow reserve (CFR) in humans. Reduced CFR is accompanied by marked intramyocardial and pericoronary fibrosis and is used as an indication of the severity of dysfunction. This study explores, step-by-step, the real-time changes measured in the coronary flow velocity, CFR and systolic to diastolic peak velocity (S/D) ratio in the setting of an aortic banding model in mice. By using a Doppler transthoracic imaging technique that yields reproducible and reliable data, the method assesses changes in flow in the septal coronary artery (SCA), for a period of over two weeks in mice, that previously either underwent aortic banding or thoracotomy. 
During imaging, hyperemia in all mice was induced by isoflurane, an anesthetic that increased coronary flow velocity when compared with resting flow. All images were acquired by a single imager. Two ratios, (1) CFR, the ratio between hyperemic and baseline flow velocities, and (2) systolic (S) to diastolic (D) flow were determined, using a proprietary software and by two independent observers. Importantly, the observed changes in coronary flow preceded LV dysfunction as evidenced by normal LV mass and fractional shortening (FS). 
The method was benchmarked against the current gold standard of coronary assessment, histopathology. The latter technique showed clear pathologic changes in the coronary artery in the form of peri-coronary fibrosis that correlated to the flow changes as assessed by echocardiography. 
The study underscores the value of using a non-invasive technique to monitor coronary circulation in mouse hearts. The method minimizes redundant use of research animals and demonstrates that advanced ultrasound-based indices, such as CFR and S/D ratios, can serve as viable diagnostic tools in a variety of investigational protocols including drug studies and the study of genetically modified strains.

Coronary flow reserve (CFR) is useful for assessment of myocardial oxygen demand and evaluation of cardiovascular risk. This study establishes a step-by-step transthoracic Doppler echocardiographic (TTDE) method for longitudinal monitoring of the changes in CFR, as measured from coronary artery in mice, under the experimental pressure overload of aortic banding.

マウスの圧負荷モデルを用いた冠動脈の流れと冠血流準備の超音波ベースのアセスメント

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. Pulmonary Hypertension (PH) was induced in 3-week-old piglets by a progressive obstruction of the pulmonary vascular bed. A ligation of the left Pulmonary Artery (PA) was performed first through a mini-thoracotomy. Second, weekly embolizations of the right lower pulmonary lobe were done under fluoroscopic guidance with n-butyl-2-cyanoacrylate during 5 weeks. Mean Pulmonary Arterial Pressure (mPAP) measured by ritght heart catheterism, increased progressively, as well as Right Atrial pressure and Pulmonary Vascular Resistances (PVR) after 5 weeks compared to sham animals. Right Ventricular (RV) structural and functional remodeling were assessed by transthoracic echocardiography (RV diameters, RV wall thickness, RV systolic function). RV elastance and RV-pulmonary coupling were assessed by Pressure-Volume Loops (PVL) analysis with conductance method. Histologic study of the lung and the right ventricle were also performed. Molecular analyses on RV fresh tissues could be performed through repeated transcutaneous endomyocardial biopsies. Pulmonary microvascular disease in obstructed and unobstructed territories was studied from lung biopsies using molecular analyses and pathology. Furthermore, the reliability and the reproducibility was associated with a range of PH severity in animals. Most aspects of the human CTEPH disease were reproduced in this model, which allows new perspectives for the understanding of the underlying mechanisms (mitochondria, inflammation) and new therapeutic approaches (targeted, cellular or gene therapies) of the overloaded right ventricle but also pulmonary microvascular disease.

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) and Right Ventricular (RV) dysfunction were induced in piglets by progressive obstruction of the pulmonary arteries. Consequences were remarkably similar to those observed in CTEPH patients. This animal model would be a very useful tool for pathophysiology and therapeutic experiments on CTEPH and RV failure.

慢性血栓塞栓性肺高血圧症とピグレットにおける右室機能の評価

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Transthoracic Speckle Tracking Echocardiography for the Quantitative Assessment of Left Ventricular Myocardial Deformation

The value of conventional echocardiography is limited by differences in inter-individual image interpretation and therefore largely dependent on the examiners&#39; expertise. Speckle tracking Echocardiography (STE) is a promising but technically challenging method that can be used to quantitatively assess regional and global systolic and diastolic myocardial performance. Myocardial strain and strain rate can be measured in all three dimensions&#160;&#8212; radial, circumferential, longitudinal &#8212; of myocardial deformation. Standard cross-sectional two-dimensional B-mode images are recorded and subsequently postprocessed by automated continuous frame-by-frame tracking and motion analysis of speckles within the myocardium. Images are recorded as digital loops and synchronized to a 3-lead EKG for timing purposes. Longitudinal deformation is assessed in the apical 4-, 3-, and 2-chamber views. Circumferential and radial deformation are measured in the parasternal short axis plane.
Optimal image quality and accurate tissue tracking are paramount for the correct determination of myocardial performance parameters. Utilizing transthoracic STE in a healthy volunteer, the present article is a detailed outline of the essential steps and potential pitfalls of quantitative echocardiographic myocardial deformation analysis.

Speckle tracking echocardiography is an emerging diagnostic imaging technique for the quantitative assessment of global and regional myocardial performance. Standard view echocardiographic motion images are recorded and deformation parameters are subsequently measured by automated continuous frame-by-frame tracking and motion analysis of speckles within the B-mode images of the myocardium.

左心室心筋変形の定量的評価のための経胸壁スペックル追跡心エコー検査

The value of conventional echocardiography is limited by differences in inter-individual image interpretation and therefore largely dependent on the ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

マウスにおける右心室拡張期パラメータの心エコー測定

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. However, the evaluation of right ventricular pressure (RVP) and pulmonary artery pressure (PAP) remains technically challenging in mice. RVP and PAP are more difficult to measure than left ventricular pressure because of the anatomical differences between the left and right heart systems. In this paper, we describe a stable right heart hemodynamic measurement method and its validation using healthy and PAH mice. This method is based on open-chest surgery and mechanical ventilation support. It is a complicated procedure compared to closed chest procedures. While a well-trained surgeon is required for this surgery, the advantage of this procedure is that it can generate both RVP and PAP parameters at the same time, so it is a preferable procedure for the evaluation of PAH models.

Here, we present a protocol to perform an invasive hemodynamic assessment of the right ventricle and pulmonary artery in mice using an open-chest surgery approach.

マウスにおける右心室系と低酸素誘発性肺動脈高血圧に対する侵襲的血行力学的評価

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) handling and signaling pathways as well as high-throughput drug screening and toxicity assays. Herein, we provide a detailed description of the methodologies used to generate high-quality iPSC-CMs that can consistently reproduce molecular and functional characteristics across different cell lines. Additionally, a method is described to reliably assess their functional characterization through the evaluation of Ca2+ handling properties. Low oxygen (O2) conditions, lactate selection, and prolonged time in culture produce high-purity and high-quality ventricular-like cardiomyocytes. Similar to isolated adult rat cardiomyocytes (ARCMs), 3-month-old iPSC-CMs exhibit higher Ca2+ amplitude, faster rate of Ca2+ reuptake (decay-tau), and a positive lusitropic response to &#946;-adrenergic stimulation compared to day 30 iPSC-CMs. The strategy is technically simple, cost-effective, and reproducible. It provides a robust platform to model cardiac disease and for the large-scale drug screening to target Ca2+ handling proteins.

Here we describe and validate a method to consistently generate robust human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and characterize their function. These techniques may help in developing mechanistic insight into signaling pathways, provide a platform for large-scale drug screening, and reliably model cardiac diseases.

カルシウム処理特性評価のための心室様HiPSC由来心筋細胞と高品質細胞製剤の生成

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...