著者らは、実験のNMR分光法の部分の間に彼女のサポートのためにリンスペンサーに感謝します。この作品は、保健基金R01 HL059246、R01 HL067970、R01 HL088634（博士天まで）とF32 HL096284（博士Kolwiczまで）の国立研究所からの補助金によって支えられている。

<ol><li>これらの実験では、2つの別々のシステムが同時に利用されている。 31 Pスペクトルの取得については、ブルカー14Tのマグネットは、AvanceのIIIのコンソールとトップスピンV2.1ソフトウェアを装備したコンピュータとのインターフェースです。心機能の評価のために、カスタム構築された心臓の灌流システムは、データ解析のためのLabChartPro 6ソフトウェアを搭載したPowerLab 4月30日データ収集、とのインターフェースです。 </li><li>実験当日、クレープス-ヘンゼライト1リットルのバッファーは、次のように調製する。0.5mmのEDTA、5.3mMのKCl、1.2mmのMgSO 4を 、118mMのNaCl、および25mMのNaHCO 3を 。次いで、混合物を5％CO 2 / 95％前に2mMのCaCl 2を加えて10〜15分間、O 2でバブリングする。最後に、基板は、10mMのグルコース及び0.5mmのピルビン酸の形で、追加されます。 </li><li>実験中の温度調節が重要です。 37.5 ° Cを中心に磁石内にあるとき - 温水循環装置は、37.0との間の温度を維持するために使用されています。温度は、光ファイバ温度プローブを用いた実験の期間が監視されています。 </li><li>灌流圧および左心室圧は、データ収集システムに接続されていると付属のソフトウェアを使用して表示される圧力トランスデューサを介して監視されます。これらは、実験に先立って、標準の血圧計で較正されています。さらに、圧力ラインはすべての気泡を除去するために、適切にフラッシュされます。 </li><li> 150mMのリン酸ナトリウム（KHのバッファーのイオン強度に相当する）の標準サンプルは、前に心臓の挿入にプローブを&quot;校正&quot;するために使用されます。これは、信号を容易にし、心臓がプローブ内に配置されると、取得期間を開始するのに必要な時間が短縮されます。 </li><li>凝固を減らすために、マウスが5分後にヘパリンIPの200単位を注入され、ペントバルビタールナトリウム（175 mg / kg）のIPが与えられます。 </li><li>心は急速に切り出した（そのまま肺および胸腺）と氷冷KHバッファに逮捕されている。 </li><li>氷上に置きながら、肺はすぐに削除されます。胸腺の葉が同定され、静かに大動脈を露出するために戻って剥離されています。胸腺は削除されます。大動脈は、慎重に周囲の組織を除去することによって分離されています。 </li><li>マイクロ縫合鉗子を穏やかに内腔を公開する大動脈の両方の壁を保持するために使用されます。大動脈を慎重に0.965ミリメートルODのポリエチレンチューブ（PE50）から作られたカニューレに配置されます。縫合糸がすぐに大動脈周囲に結び付けられている間に大動脈をミクロ血管クランプで固定されています。クリップが削除され、鉗子は慎重にカニューレを大動脈基部より上であることを確認するために使用されます。追加の関係はその場で心臓を保持するために必要に応じて追加されます。 </li><li>余分な組織は、鉗子とmicroscissorsを使用して削除されます。小切開は、左心耳に行われます。優しく心を保持している間に0.61ミリメートルODのポリエチレンチューブ（PE10）を慎重に頂点を介して左心房、左心室腔、および出力を介して挿入されます。過剰なチューブがトリミングされます。 </li><li>デフレート水で満たされた風船は、LVにアトリウムを介して挿入され、粘着テープや糸を使用して所定位置に保持される。蠕動ポンプの速度は徐々に心臓に十分な流量を提供するために増加しています。心臓は、NMRプローブに場所になるまで、心臓は約2ml /分に相当する一定の流量で灌流され続けます。 LVのバルーンは、LV圧変換器が機能していることを確認するためにマイクロシリンジを用いて、少量で膨らませている。 </li><li>心臓は慎重に10 mmのNMR管に挿入されます。ワイドボア&quot;スピナー&quot;は、プローブ内の適切な位置にチューブを誘導するために使用されます。装置全体は、しっかりと粘着テープで&quot;臍帯&quot;に添付されます。 </li><li>心臓/ NMR管は10mmのNMRプローブのコイルの内側になるまで、臍帯は、徐々に磁石の上部の穴に低下する。 </li><li>心臓は、プローブ内の適切な位置になると、蠕動ポンプの流量は、80mmHgの灌流圧を達成するために調整されます。 （この時点まで心臓が約2ml /分の一定流速で灌流されていることを、覚えておいてください）​​。灌流圧は、ポンプのコントローラ上の&quot;ホールド&quot;のメカニズムを有効にすることで維持されています。心臓は、その後15〜20分の平衡期間を許可されています。その間、LVのバルーンの体積は80〜10 mmHgの拡張末期圧を達成するために調整されます。 </li><li>平衡期間中に、それは可能な限り最高のリン信号を得るために、分光器のパラメーターを最適化する必要がある。これは、リン核が共振する周波数での電波のパルスを設定する（&quot;チューニング&quot;）と（&quot;シム&quot;）磁場を均一にすることによって達成されます。 </li><li>平衡期間の後、複数の31 P NMRスペクトルを得ることができます。各スペクトルの取得周期はtに依存しています彼はフィールドの磁石の強さ、標本の大きさ、および特定の実験に必要な信号対雑音比。スペクトルは、60度のフリップ角と2.0秒の遅延で20μsの256無線周波数パルスから得られる信号を平均で14 Telsaの磁石を使用して取得されます。この実験では約10分が必要になります。 </li></ol>代表的な結果データ集録ハードウェアとLabChartソフトウェアから、心機能のいくつかのパラメータは、実験プロトコルを通して測定することができます。心機能の代表的な指標は、左心室に開発圧力（LVDevP）は、収縮期血圧（図1）から拡張末期圧（EDP）を差し引くことにより得られる。この措置は、マウスの系統および心臓の状態（すなわち、圧力の過負荷）によって異なる場合があります。しかし、通常のC57BL6マウスの心臓でLVDevPは8-10 mmHgの固定拡張終期圧で100から110 mmHgの間に典型的です。さらに、LabChartのプログラムは、LVの圧力波の周期測定値に基づいて、心拍数の測定が可能になります。再び、この措置は変わることができますが、心は本質的な速度で打つために許可されているときに典型的な値は、350〜400 BPMです。しかし、心臓は、心拍数は420 BPMに保たれているペーシングシステムを使用して標準化することができる。さらに、収縮性（+ DP / DT）とリラクゼーション（-dP/dt）の措置がLVの圧力波の一次導関数を用いて推定することができます。実験プロトコール中には、圧力 - 体積の関係を組み込むことにより、スターリングのメカニズムを評価するのは簡単です。これは、LVのバルーンのボリュームが徐々に増加することとLVDevPだけでなく、EDPに注目することによって実現されます。これらの値は、図2に示すようにプロットすることができます。スターリング曲線が適しているが、80〜10 mmHgのEDPを達成するために必要なボリュームを指摘するLV室の寸法の間接的なアイデアを与えることができます。これは、拡張した心臓はコントロールに比べてより大きな音量を必要としながら肥大した心臓は通常、小さなバルーンのボリュームが必要になるからバンディング大動脈のモデルで使用することができます。表1は、灌流プロトコル中に取得された代表的な心機能のデータが表示されます。 31 P NMR分光計は、クレアチンリン酸の信号（PCR）とATP（γ- ATP、α- ATP、およびβ- ATP）と同様に、図2に示すように、無機リン酸塩（Pi）から三リン酸を提供します。これらのピークの各々の分析は、曲線下面積の値を提供します。 ATPの量は、γ- ATPとβ- ATPの領域を平均化することで推定される。 （NAD分子は全体の信号の未知の部分に寄与するので、α- ATPが使用されていない）。心の精力的な状況は、PCRおよびATPの分野の商（：ATP比PCR）によって決定されます。 1.7主な基質としてグルコースに付属のマウスの心臓で - この値は通常1.5です。 31 P NMRは、ATPまたはPCRの直接的な対策を提供していませんが、ピークの面積は、サンプル中の化合物を含有するリンの量に比例する。これらの信号の値は、他の方法を用いて推定することができます。例えば、心のコホートにおける高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によるATPの直接的な対策は、平均的な濃度を得ることができる。この値は、スペクトルで観測された平均的なATPエリアを校正するために使用することができます。 PCRの濃度は、ATPの領域に相対的なPCR領域に基づいて計算することができます。それは、PCRの信号に無機リン酸塩（Pi）信号の相対的な化学シフトを分析することによってpHを推定することも可能です。1は、異なる無線パルスシーケンスを使用して、クレアチンキナーゼの反応速度やATP合成の反応速度も測定することができる2。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069tab1.jpg" alt="表1" /> 表1。孤立した灌流心臓からベースラインの心機能。 LVDevP：左心室開発圧力、LVEDP：左室拡張末期圧、HR：心拍数、RPP：速度圧製品; + DP / DT：一次導関数LV圧正、-dP/dt：一次導関数LV圧負、PP ：灌流圧、CF：冠血流。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig1.jpg" alt="図1" /> LabChart Proソフトウェアから図1。代表LVの圧力波。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig2.jpg" alt="図2" /> 図2制御（実線）と大動脈バンド（点線）マウスからの代表スターリング曲線。 A）などの増加LVのボリュームにLVDevPで表される収縮機能は、LVのバルーンの体積によって決まります。 B）拡張機能をのようなLVのバルーンの体積によって決定された左室容積を増やす以上のEDPで表される。 LVDevP：左心室開発した圧力（収縮期マイナス拡張期Pressure）、EDP：拡張末期圧。 <img src="/files/ftp_upload/2069/2069fig3.jpg" alt="図3" /> 孤立した灌流マウス心臓の図3。代表31 P NMRスペクトル。比較的小さなパイのピークに注目してください。グルコースに加えて、ピルビン酸や脂肪酸に付属の好気的に灌流心臓においては、このピークは必要最小限にとどめます。虚血の期間中、このピークが増加するPCRのピークは減少する。 α- ATPピークの右側の肩に注目してください。これはNAD分子の寄与である。 π：無機リン酸塩、PCR：クレアチンリン酸、ATP：アデノシン三リン酸。

<ol>
	<li>Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+for+increased+glycolysis+in+the+hypertrophied+rat+heart.">Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart.</a> Hypertension. 44, 662-667 (2004).</li><li>Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+creatine+kinase+enzyme+kinetics+in+diabetic+cardiomyopathy.+A(31)P+NMR+magnetization+transfer+study+of+the+intact+beating+rat+heart.">Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).</li><li>Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorus+nuclear+magnetic+resonance+spectroscopy+of+cardiac+and+skeletal+muscles.">Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles.</a> Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).</li><li>Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W., Hoit, B. D., Walsh, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=31P+NMR+spectroscopy+of+the+mouse+heart.">31P NMR spectroscopy of the mouse heart.</a> Cardiovascular physiology in the genetically engineered. , 151-163 (2002).</li><li>Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+contractile+and+metabolic+reserve+in+peroxisome+proliferator-activated+receptor-alpha-null+hearts+can+be+rescued+by+increasing+glucose+transport+and+utilization.">Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization.</a> Circulation. 112, 2339-2346 (2005).</li><li>Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+glucose+uptake+and+oxidation+in+mouse+hearts+prevent+high+fatty+acid+oxidation+but+cause+cardiac+dysfunction+in+diet-induced+obesity.">Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity.</a> Circulation. 119, 2818-2828 (2009).</li><li>Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+activation+of+AMP-activated+protein+kinase+remodels+metabolic+network+in+favor+of+cardiac+glycogen+storage.">Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage.</a> J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).</li><li>Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+metabolism+and+energy+homeostasis+in+mouse+hearts+overexpressing+dominant+negative+alpha2+subunit+of+AMP-activated+protein+kinase.">Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase.</a> J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).</li><li>Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+effects+of+increased+glucose+entry+on+mouse+hearts+during+normal+aging+and+ischemic+stress.">Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress.</a> Circulation. 116, 901-909 (2007).</li><li>Tian, R., Abel, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+GLUT4-deficient+hearts+to+ischemia+underscore+the+importance+of+glycolysis.">Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis.</a> Circulation. 103, 2961-2966 (2001).</li><li>Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-specific+overexpression+of+GLUT1+prevents+the+development+of+heart+failure+attributable+to+pressure+overload+in+mice.">Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice.</a> Circulation. 106, 2125-2131 (2002).</li><li>Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activity+in+rat+hearts+with+pressure-overload+hypertrophy.">Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy.</a> Circulation. 104, 1664-1669 (2001).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ランゲンドルフ灌流絶縁マウスの心臓の31 P NMR分光法は、信頼性と再現性のあるデータを提供します。3、4はしかし、それはLVのバルーンの大動脈と挿入のカニュレーションが安定した心機能を可能にするために適切にそのように行われていることが不可欠であるNMR内側間チューブ。さらに、温度​​調節は適切なベースラインの機能を達成するために重要です。良い、分析可能なNMRスペクトルを得る重要な要因の1つは、信号対雑音比を増加している。これは、最適な&quot;チューニング&quot;とサンプルの&quot;シミング&quot;を確保することによって達成することができます。プロトコルのテキストで述べたように、前に心臓の挿入に標準サンプルの使用は、これを容易にすることができます。適切なサイズの&quot;サンプル&quot;を持つことも役立ちます。取得時間の増加が良好なリンのスペクトルを得るために必要となるので、100未満mgを秤量ハーツは、通常より低いPCRおよびATPの信号を提供します。 心機能とエネルギー論に関する追加情報を集めるために、既存のプロトコルを変更するには、いくつかの方法があります。当研究室では、我々は脂肪酸のさまざまな組み合わせが存在する（低および高濃度で）、乳酸、ケトン、およびインスリンを含むことができる混合基質を緩衝液で灌流心を持っている。潅流液（すなわち、13 C標識基質）の安定同位体を使用することで、我々はTCAサイクルへの標識アセチルCoAの相対的な寄与によって基板の使用率を予測する能力を持っている。このアプリケーションでは5-7、我々は、アイソトポマーを実行する13 C3 -および13 C NMR分光法と13 C4 -グルタミン酸の分析。これは血流プロトコルの終わりに心を凍結クランプと凍結組織の抽出を行う必要があります。これは、分析は別のセットアップパラメータを持つ別のプローブを使用する必要があるとして、追加の実験になります。 31 P NMR分光法を用いて心臓の2 -デオキシグルコースリン酸塩の時間依存の蓄積を監視しながら、他のアプリケーションは、バッファ内のデオキシグルコースとグルコースの置換が含まれています。このメソッドは、心筋のグルコース取り込みを測定することができます。加えて7、8、私たちの研究室では、虚血/再灌流およびワークロードの高い課題から構成される灌流プロトコルにおける心機能およびエネルギー論を分析している6、8-10 要約すると、分離されたマウスの心の中で31 P NMR分光法は、高度な機器の使用を要求する技術的に困難な手順です。しかし、それが得られること、データは、遺伝子組み換えマウスモデルの機能とエネルギー論を分析することを望む研究者に貴重なものです。当研究室では、これらの技術は心臓機能、エネルギー論、および代謝上のストレッサーの様々な影響についての我々の理解に不可欠れている1、11、12

<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
</tr>
<tr>
<td>Magnesium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>M7506</td>
</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>E1644</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P4505</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium bicarbonate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S6297</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>S7653</td>
</tr>
<tr>
<td>Calcium chloride dihydrate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>C5080</td>
</tr><tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>G7528</td>
</tr><tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P2256</td>
</tr><tr>
<td>Bruker Ultrashield 600WB Plus</td>
<td>Equipment</td>
<td>Bruker</td>
<td>&nbsp;</td>
</tr><tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">PowerLab 4/30</a></td>
<td>Equipment</td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a></td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank">ML866/P</a></td>
</tr><tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">LabChart 6 Pro</a></td>
<td>Equipment</td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a></td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/software/research/LabChart-Software/" target="_blank">MLS260/6</a></td>
</tr><tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank">Quad Bridge Amp</a></td>
<td>Equipment</td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a></td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/FE224/" target="_blank">ML224</a></td>
</tr><tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank">STH Pump Controller</a></td>
<td>Equipment</td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a></td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/research/product/ML175/" target="_blank">ML175</a></td>
</tr><tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank">Minipuls 3 Peristaltic Pump</a></td>
<td>Equipment</td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a></td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML172/" target="_blank">ML172</a></td>
</tr><tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank">Disposable BP Transducer</a></td>
<td>Equipment</td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a></td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT0699/" target="_blank">MLT0699</a></td>
</tr><tr>
<td>10mm NMR Sample Tube</td>
<td>Equipment</td>
<td>Wilmad LabGlass</td>
<td>513-7PP-7</td>
</tr><tr>
<td>Polyethylene tubing PE10</td>
<td>Equipment</td>
<td>Becton-Dickinson</td>
<td>427401</td>
</tr><tr>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank">Physiological Pressure Transducer</a></td>
<td>Equipment</td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank">ADInstruments</a></td>
<td><a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/MLT844/" target="_blank">MLT844</a></td>
</tr><tr>
<td>Polyethylene tubing PE50</td>
<td>Equipment</td>
<td>Becton-Dickinson</td>
<td>427411</td>
</tr><tr>
<td>Micrometer syringe</td>
<td>Equipment</td>
<td>Gilmont Instruments</td>
<td>GS-1101</td>
</tr><tr>
<td>McPherson Forceps</td>
<td>Equipment</td>
<td>Miltex Inc.</td>
<td>18-949</td>
</tr><tr>
<td>Castraviejo microscissors</td>
<td>Equipment</td>
<td>Roboz Surgical Instruments</td>
<td>RS-5650</td>
</tr><tr>
<td>Neoptix Signal Conditioner</td>
<td>Equipment</td>
<td>Neoptix, Inc.</td>
<td>Reflex - 1</td>
</tr>	
</tbody>
</table>

assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31p nmr spectroscopy

遺伝子組み換えマウスモデルでは、心血管疾患の分子変化とモデル間の因果関係を決定する際に強力な研究ツールとなっている。分子生物学は、シグナル伝達経路の主要な変更点を特定するのに必要ですが、それは機能的な意義の代用ではありません。生理学はそのままで代謝の生化学的評価と生理学を組み合わせた、機能の質問に対する答えを提供できる一方で、心臓を拍動する心臓の機能とエネルギー論の全体像を可能にする。長年にわたり、私たちの研究室では、このタスクを達成するために核磁気共鳴（NMR）分光法と組み合わせて単離心臓のperfusionsを活用している。心臓のエネルギー論を実行することによって測定される間、左心室機能は、ランゲンドルフモード単離心臓のperfusionsによって評価される<sup&gt; 31</sup&gt; P灌流心臓の磁気共鳴分光法。これらの技術により、ホスホクレアチンとATPのレベルとの組み合わせで心機能の指標は、心を打つで同時に測定することができます。生理学的または病理学的ストレッサーが提起されている間また、これらのパラメータをモニターすることができます。例えば、虚血/再灌流またはワークロードの高いチャレンジプロトコルを採用することができます。バンディング大動脈や心臓の病理学の他のモデルの使用は、同様にがちである。プロトコルに関係なく内の亜種の、トランスジェニックマウスモデルの分子修飾の機能的でエネルギッシュな意義は十分に関連する酵素や代謝経路に新たな知見につながる、説明することができます。そのため、<sup&gt; 31</sup孤立した灌流心臓の&gt; P NMR分光法は、心血管疾患の動物モデルでの貴重な研究手法です。

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Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

と一緒にランゲンドルフモード単離心臓の灌流、<sup&gt; 31</sup&gt; P NMR分光法、一つの実験に生化学や生理学の分野を組み合わせたもの。同時に生理的な機能を監視しながら、プロトコルは、心臓の高エネルギーリン酸含有量と売上高の動的な測定が可能になります。正しく実行する場合、これは心臓のエネルギー論の評価に貴重な技術です。

使用する絶縁マウスハーツの心機能およびエネルギー論の評価 31 P NMR分光法

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

assessment-cardiac-function-energetics-isolated-mouse-hearts-using

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

26.0K ビュー.  University of Washington School of Medicine. と一緒にランゲンドルフモード単離心臓の灌流、 31 P NMR分光法、一つの実験に生化学や生理学の分野を組み合わせたもの。同時に生理的な機能を監視しながら、プロトコルは、心臓の高エネルギーリン酸含有量と売上高の動的な測定が可能になります。正しく実行する場合、これは心臓のエネルギー論の評価に貴重な技術です。

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NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited for studies of cardiac metabolism, which require the heart to perform work within the context of physiologic preload and afterload pressures. Neely introduced modifications to the Langendorff technique to establish appropriate left ventricular (LV) preload and afterload pressures3. The model is known as the isolated LV working heart model and has been used extensively to study LV performance and metabolism4-6. This model, however, does not provide a properly loaded right ventricle (RV). Demmy et al. first reported a biventricular model as a modification of the LV working heart model7, 8. They found that stroke volume, cardiac output, and pressure development improved in hearts converted from working LV mode to biventricular working mode8. A properly loaded RV also diminishes abnormal pressure gradients across the septum to improve septal function. Biventricular working hearts have been shown to maintain aortic output, pulmonary flow, mean aortic pressure, heart rate, and myocardial ATP levels for up to 3 hours8.
When studying the metabolic effects of myocardial injury, such as ischemia, it is often necessary to identify the location of the affected tissue. This can be done by imaging the fluorescence of NADH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)9-11, a coenzyme found in large quantities in the mitochondria. NADH fluorescence (fNADH) displays a near linearly inverse relationship with local oxygen concentration12 and provides a measure of mitochondrial redox state13. fNADH imaging during hypoxic and ischemic conditions has been used as a dye-free method to identify hypoxic regions14, 15 and to monitor the progression of hypoxic conditions over time10.
The objective of the method is to monitor the mitochondrial redox state of biventricular working hearts during protocols that alter the rate of myocyte metabolism or induce hypoxia or create a combination of the two. Hearts from New Zealand white rabbits were connected to a biventricular working heart system (Hugo Sachs Elektronik) and perfused with modified Krebs-Henseleit solution16 at 37 &deg;C. Aortic, LV, pulmonary artery, and left &amp; right atrial pressures were recorded. Electrical activity was measured using a monophasic action potential electrode. To image fNADH, light from a mercury lamp was filtered (350&plusmn;25 nm) and used to illuminate the epicardium. Emitted light was filtered (460&plusmn;20 nm) and imaged using a CCD camera. Changes in the epicardial fNADH of biventricular working hearts during different pacing rates are presented. The combination of the heart model and fNADH imaging provides a new and valuable experimental tool for studying acute cardiac pathologies within the context of realistic physiological conditions.

The objective is to monitor the mitochondrial redox state of isolated hearts within the context of physiologic preload and afterload pressures. A biventricular working rabbit heart model is presented. High spatiotemporal resolution fluorescence imaging of NADH is used to monitor the mitochondrial redox state of epicardial tissue.

隔離された両心室ワーキングウサギ心臓のNADH蛍光イメージング

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited ...

医学

Reduction in Left Ventricular Wall Stress and Improvement in Function in Failing Hearts using Algisyl-LVR

Injection of Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently used for the first time in patients who had symptomatic heart failure. In all patients, cardiac function of the left ventricle (LV) improved significantly, as manifested by consistent reduction of the LV volume and wall stress. Here we describe this novel treatment procedure and the methods used to quantify its effects on LV wall stress and function.
Algisyl-LVR is a biopolymer gel consisting of Na+-Alginate and Ca2+-Alginate. The treatment procedure was carried out by mixing these two components and then combining them into one syringe for intramyocardial injections. This mixture was injected at 10 to 19 locations mid-way between the base and apex of the LV free wall in patients.
Magnetic resonance imaging (MRI), together with mathematical modeling, was used to quantify the effects of this treatment in patients before treatment and at various time points during recovery. The epicardial and endocardial surfaces were first digitized from the MR images to reconstruct the LV geometry at end-systole and at end-diastole. Left ventricular cavity volumes were then measured from these reconstructed surfaces.
Mathematical models of the LV were created from these MRI-reconstructed surfaces to calculate regional myofiber stress. Each LV model was constructed so that 1) it deforms according to a previously validated stress-strain relationship of the myocardium, and 2) the predicted LV cavity volume from these models matches the corresponding MRI-measured volume at end-diastole and end-systole. Diastolic filling was simulated by loading the LV endocardial surface with a prescribed end-diastolic pressure. Systolic contraction was simulated by concurrently loading the endocardial surface with a prescribed end-systolic pressure and adding active contraction in the myofiber direction. Regional myofiber stress at end-diastole and end-systole was computed from the deformed LV based on the stress-strain relationship.

This article describes procedures for implanting a novel hydrogel in failing hearts and quantifying its effect on left ventricular wall stress and function. These procedures have been successfully applied in dogs and humans.

Algisyl-LVRを使っハーツ失敗関数内で左心室壁応力と改善の削減

Injection of  Algisyl-LVR, a treatment under clinical development, is intended to treat  patients with dilated cardiomyopathy. This treatment was recently ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Small animal magnetic resonance imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial tissue. The high heart rates of small animals (200 to 600 beats/min) have previously limited the role of CMR imaging. Small animal Look-Locker inversion recovery (SALLI) is a T1 mapping sequence for small animals to overcome this problem 1. T1 maps provide quantitative information about tissue alterations and contrast agent kinetics. It is also possible to detect diffuse myocardial processes such as interstitial fibrosis or edema 1-6. Furthermore, from a single set of image data, it is possible to examine heart function and myocardial scarring by generating cine and inversion recovery-prepared late gadolinium enhancement-type MR images 1.
	The presented video shows step-by-step the procedures to perform small animal CMR imaging. Here it is presented with a healthy Sprague-Dawley rat, however naturally it can be extended to different cardiac small animal models.

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Contrast enhanced cardiac magnetic resonance (CMR) imaging allows comprehensive in vivo assessment of the heart in small animal models of cardiovascular disease. Here we detail the procedures to perform CMR imaging, reconstruction and analysis using Small Animal Lock-Locker Inversion Recovery (SALLI) in rats.

小動物ルックロッカー反転回復（サリー）ラットにおけるMRIを用いた心機能と心筋形態の評価

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

経胸壁心エコー検査による肺動脈狭窄のマウスモデルにおける右室の構造と機能の評価

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

顕微鏡を用いたひと脂肪組織血管機能評価

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation time and increases the risk of adverse post-transplantation outcomes. Moreover, the static nature of CS does not allow for organ evaluation or intervention during the preservation interval. Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP) is a novel method for preservation of the donated heart that minimizes cold ischemia by providing oxygenated, nutrient-rich perfusate to the heart. ESHP has been shown to be non-inferior to CS in the preservation of standard-criteria donor hearts and has also facilitated the clinical transplantation of the hearts donated after the circulatory determination of death. Currently, the only available clinical ESHP device perfuses the heart in an unloaded, non-working state, limiting assessments of myocardial performance. Conversely, ESHP in working mode provides the opportunity for comprehensive evaluation of cardiac performance by assessment of functional and metabolic parameters under physiologic conditions. Moreover, earlier experimental studies have suggested that ESHP in working mode may result in improved functional preservation. Here, we describe the protocol for ex situ perfusion of the heart in a large mammal (porcine) model, which is reproducible for different animal models and heart sizes. The software program in this ESHP apparatus allows for real-time and automated control of the pump speed to maintain desired aortic and left atrial pressure and evaluates a variety of functional and electrophysiological parameters with minimal need for supervision/manipulation.

Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP), preserves the heart in a beating, semi-physiologic state. When performed in a working mode, ESHP provides the opportunity to perform sophisticated assessments of donor heart function and organ viability. Here, we describe our method for myocardial performance evaluation during ESHP.

常温動作モードの場心の灌流 Ex: 心機能と代謝の評価

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

Echocardiographic Assessment of Cardiac Anatomy and Function in Adult Rats

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional imaging to study the cardiac anatomy of the left ventricle and M-mode echo to assess its dimensions. However, this could limit a comprehensive study. Herein, we describe a protocol that allows an assessment of the heart chamber size, left ventricular function (systolic and diastolic) and valvular function. A conventional medical ultrasound machine was used in this protocol and different echo views were obtained through left parasternal, apical and suprasternal windows. In the left parasternal window, the long and short axis were acquired to analyze left chamber dimensions, right ventricle and pulmonary artery dimensions, and mitral, pulmonary and aortic valve function. The apical window allows the measurement of heart chamber dimensions and evaluation of systolic and diastolic parameters. It also allows Doppler assessment with detection and quantification of heart valve disturbances (regurgitation or stenosis). Different segments and walls of the left ventricle are visualized throughout all views. Finally, the ascending aorta, aortic arch, and descending aorta can be imaged through the suprasternal window. A combination of ultrasound imaging, Doppler flow and tissue Doppler assessment have been obtained to study cardiac morphology and function. This represents an important contribution to improve the assessment of cardiac function in adult rats with impact for research using these animal models.

A non-invasive protocol for transthoracic echocardiography assessment of cardiac anatomy and function for adult rats is presented in the current study. The heart valves, all four cardiac chambers and the ascending aorta, aortic arch and descending aorta are studied in detail.

成人ラットにおける心臓解剖学と機能の心エコー評価

The use of experimental animal models has become crucial in cardiovascular science. Most studies using rodent models are focused on two-dimensional ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...