この研究はマックス・プランク・ソサエティによって支持された。

1.エレクトロコンピテントV.腸炎ビブリオ菌細胞の調製およびスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション注記：プロトコルの次のセクションでは、エレクトロコンピテント細胞の調製とその後のスイマー細胞へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションが可能です。蛍光タンパク質がプラスミドから異所的に発現される場合、この工程は重要である。 <ol><li> 100μg/ mLのアンピシリンを含有する新鮮なLB寒天プレート上に-80℃のグリセロールストックからのV.parahaemolyticus細胞をストリークし、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、200mLのLB培地にV.parahaemolyticusの単一コロニーを接種し、振盪条件下でOD 600が1.0に達するまで37℃でインキュベートする。それは、細胞培養物が所望の光学濃度に達するために通常5〜6時間のインキュベーションを要する。 </li><li>直ちに細胞を氷上に移し、perf氷上で4℃の予冷した遠心分離機でさらにすべてのステップを行う。 </li><li>細胞を4℃で10分間2,000 x gで収穫する。 </li><li>デカンテーションにより上清を捨て、25mLの氷冷273mMスクロース溶液（pH7.4、KOHで緩衝化した）に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li> 4℃で10分間、2000×gで細胞を再度採取する。さらに2回繰り返します。 </li><li>洗浄した細胞ペレットを400μLの氷冷273mMスクロース溶液に再懸濁する。続いてグリセロールを15％vol / volの最終濃度に添加する。細胞はエレクトロポレーションの準備が完了していますが、後で使用するために-80℃で70μLのアリコートで凍結することもできます。 </li><li>エレクトロポレーションのために、エレクトロコンピテント細胞の70μLアリコートを100〜1,000ngのプラスミドDNAと混合し、混合物を氷冷エレクトロポレーションキュベット（0.2cmの電極ギャップ）に移す。 25μF、2400 V、200Ωの設定でエレクトロポレーションを行います。 </li><li>中断する細胞をLBブロス600μL中のエレクトロポレーションキュベットに入れ、2mLチューブに移し、37℃で3時間振とうしながらインキュベートする。 </li><li>細胞を2,000 xgで5分間遠心し、100μlのLBブロスにペレットを再懸濁する。必要な抗生物質を含む選択的LB寒天プレートに細胞懸濁液を広げ、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、コロニー形成についてプレートをチェックする。増殖するコロニーはプラスミド上にコードされた正しい抗生物質耐性遺伝子を保有し、さらなる実験に使用することができる。 </li></ol>スワマー細胞分化誘導注：以下のステップは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞のライフサイクルへの分化を誘導する方法、および固体表面上の増殖を刺激する方法を記載する。 <ol><li>スワンミングプレートを調製するために、4mLのハートインフュージョン（HI）寒天を100mLのddH 2 O中に懸濁する。 </li><li>HI寒天溶液を電子レンジで注意深く沸騰させ、粉末が溶解するまで瓶を随時振とうする。 121℃で20分間オートクレーブ処理する。 </li><li>オートクレーブ後、HI寒天を60〜65℃に冷却する。最終濃度50μM（100％エタノール中50mMのストック溶液）に2,2&#39;-ビピリジルを添加する。 4mMの最終濃度（ddH 2 O中の4Mのストック溶液）にCaCl 2を添加する。必要に応じて、抗生物質を溶液に加えてプラスミドを維持する。 注：誘導性プラスミドを使用する場合は、最終濃度に誘導剤を加えてください。 注意：2,2&#39;-ビピリジル：急性毒性（経口、経皮、吸入）。この化学物質を取り扱う際には、手袋および安全ゴーグルを使用する。 </li><li>最後のHI寒天溶液30〜35mLを丸150mmペトリ皿に注ぎ、寒天を凝固させる。 </li><li>細胞培養物をスポッティングする直前に、寒天プレートを37℃で少なくとも10分間乾燥させます（または液体残渣にdisappeared、しかしもはや）右上に開いた蓋があります。 注：乾燥時間は、使用したインキュベーターに大きく依存し、重度に乾燥したプレートは、 腸炎ビブリオの蔓延を許さない 。 （このステップは非常に重要です！）プレートは新しく使用する必要があり、2〜3時間以上経過してはいけません。古いプレートはあまりにも乾燥して群れを刺激することはありません。 </li><li>単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。 OD 600 = 0.8に達するまで37℃で振とう培養物をインキュベートする。通常、約2〜3時間かかる。その後、細胞はHIスウィング寒天プレート上にスポットされる準備が整う。 </li><li> HI寒天プレート（ 図1A ）の中央に細胞培養液1μLをスポットする。 </li><li>スポットを乾燥させる（ 図1B ）。 </li><li>透明なプラスチックテープでプレートを密封し、しっかりと取り付けてください。そうでなければ、一晩のインキュベーション中に取り外す可能性があります（ 図1C ）。 注：これはシールが完璧であることが非常に重要です。適用時にテープに気泡や折れ曲がりが発生しないように注意してください。 </li><li> 24℃で一晩インキュベートする。これにより、鞭毛コロニー（ 図2 ）の周辺部から伸びる群発虫が発生した腸炎ビブリオの群集が形成される。 </li></ol> 3.蛍光顕微鏡用のV.parahaemolyticus Swarmer細胞の調製注：以下のプロトコールは、顕微鏡検査のための単一のスマーマー細胞を得るために、顕微鏡アガローススライドを調製する方法およびアガロースパッド上に猛烈なフレアの続くインプリンティングを記載する。 <ol><li>顕微鏡用アガローススライドを調製するには、20％vol / vol PBSおよび10％vol / vol LBブロス溶液100 mLに1 gのアガロースを加えます。注意深く電子レンジで溶液を沸騰させてアガロースを溶解させ、マグネチックスターラーで混合しながら65〜70℃に冷却します。 </li><li>交流する場所リーン顕微鏡は作業台の完全な水平部分にスライドします。スライドの両端を汎用ラボ用ラベリングテープの2つの層で覆い、スライドを作業台に固定します。 2枚のテープの間隔は3cm程度にしてください。 注：テープの2つの層は、アガロースパッドの高さを決定する非常に小さな標高を作成します。細胞が顕微鏡分析のために同じ平面内にあることを確認するために作業空間が水平であることが重要です。 </li><li>先に調製したアガロース溶液250μLを非被覆ガラス表面上にピペットで入れる。 </li><li> 2番目の顕微鏡スライドを底に1つの上と同じ向きに置き、少し残して残ったアガロースが側面に流れ出るようにします。 </li><li>アガロースを1〜2分間固化させ、次に水平方向の動きで上部ガラススライドを底部ガラススライドからゆっくりと引っ張ります。 </li><li>メスを使用し、メスに付着している残りのアガロースをすべて切り取ってください。顕微鏡スライドの両側をゆっくりとスライドさせ、顕微鏡スライドの端部からテープをゆっくりはずします。 注：アガローススライドはすぐに準備ができており、ゆっくりと乾燥が始まるので、できるだけ早く使用する必要があります。 </li><li>スマーマー細胞で顕微鏡検査を行うには、群集のコロニーの最も外側の端から3mm×10mmのスウォーミング寒天片を切り取ってください（ 図1D ）。スイマーセルを顕微鏡スライドに移す直前まで、スウォームプレートのテープシールを壊さないことは非常に重要です。テープを剥がすと、 鞭毛鞭毛虫細胞はスイマー細胞への分化を開始する。 注：群集の端から外へのカットをコロニーの内側に向けるようにしてください（ 図1D ）。この方法で、群れのコロニーの端に「水泳者の汚染」を防ぐことができます。 </li><li>細胞がアガロースpaに面している顕微鏡アガローススライド上に群れの寒天片を転送d（ 図1E ）。これは、群れの細胞をアガロースパッド上にインプリントする。 </li><li>約30秒待ってから、アガロースパッドから寒天片を注意深く取り除いてください（ 図1F ）。 </li><li>細胞がインプリントされたアガロースパッド上にガラスカバースリップを置く。細胞は顕微鏡検査の準備ができています。 注：スマーマー細胞はゆっくりとスイマー状態への分化を開始するので、スマーマー細胞を直ちにイメージングすることが重要です。 </li></ol> 4.蛍光顕微鏡検査のためのV.parahaemolyticusスイマー細胞培養物の調製注：プロトコールのこのセクションでは、スイマー細胞型で蛍光顕微鏡検査を行うためにV.parahaemolyticusの培養液を調製する方法について説明します。 <ol><li>単一コロニーの端から少量の細胞を5mLのLBブロスに接種する。培養物を37℃で1時間、またはわずかな細胞増殖が見えるようになるまで振とうする。 </li><li>でこの段階は、必要であれば、目的のタンパク質の発現のための誘導剤を添加する。この実施例では、YFP-CheW9の発現を誘導するために、L-アラビノースを0.2％（w / vol）の最終濃度まで添加した。 </li><li>培養物を37℃でさらに2時間振とうさせる。 </li><li>顕微鏡のアガローススライドを準備するために、3.1-3.7のステップに従ってください。 </li><li>アガロースパッドの中央に細胞培養液1μLをスポットし、乾燥するまでインキュベートします。 </li><li>ガラスカバースリップを細胞が見つかったアガロースパッド上に置く。細胞は、蛍光顕微鏡下で画像化する準備が整っている。 </li></ol> 5.画像解析このプロトコルの部分では、画像分析のワークフロー、特に、人口統計解析のための単一細胞の蛍光データの抽出方法について説明します。 <ol><li>画像解析を開始する前に、すべての顕微鏡画像が16ビットTIF形式で保存されていることを確認してください。 </li><li> DIC（または位相コントラスト）および対応する蛍光チャネル画像をソフトウェアにロードします。 </li><li> 「表示/オーバーレイ画像」を選択して、両方のチャンネルのオーバーレイ画像を生成します。画像の数（「＃Images：」）を2に設定し、第1チャンネルのDIC画像と第2チャンネルの蛍光画像を選択します。 </li><li>ツールバーから「マルチライン」ツールを選択し、セルの中央から一方のポールから他方のポールにセルをマーキングします。生成されたすべての線（線オブジェクト）のリストを取得するには、「Measure / Region Measurements」を開きます。領域のラベル、距離、および平均強度のみを表示するように、領域の測定値を設定します。 </li><li> 「測定/キャリブレーション距離」のピクセルサイズを、顕微鏡セットアップに特有のピクセルサイズに較正し、「すべての開いている画像に適用」をクリックします。 </li><li>すべての領域（線オブジェクト）を蛍光チャネル画像に転送します。 「地域/トランスフソース画像（オーバーレイ画像）とデスティネーション画像（蛍光灯画像）を選択し、「すべての領域」を選択して「OK」を押します。 注記：後で正確な線（線オブジェクト、領域、ROI）を再生成するには、「領域/領域の保存」を開いて領域を保存します。 </li><li> &quot;Measure / Region Measurements&quot;を開いて &quot;Open Log&quot;を押して、すべての領域測定値をスプレッドシートにエクスポートします。データを開いてエクスポートすることを確認します。スプレッドシートをバックグラウンドで開くと、最後に &quot;F9：Log Data&quot;を押してデータをエクスポートします。 </li><li> セルに沿って蛍光焦点の位置を決定するには、 &quot;Measure / Linescan&quot;を開きます。セルの全幅が、以前に作成した領域で覆われるように、「線の幅」を値に設定します。ラインスキャングラフを右クリックし、「グラフデータを表示」を選択します。マウスを左クリックしてドラッグすると、ラインスキャンに沿って「Graph Data」ウィンドウには、2点間の対応するピクセル/距離が表示されます。青色の強調表示された行を選択し、内容をコピーします。 注：ラインスキャン強度プロファイル全体は、「ラインスキャン」ウィンドウで「ログデータ」を押すことでスプレッドシートに記録できます。抽出されたデータは、グラフやその他の統計分析での視覚化に使用できます。細胞周期にわたる局在化パターンは、細胞体に沿った細胞長および蛍光強度の人口統計学的表現で容易に視覚化することができる。これらの表現は、前に選択した同じROIを使用して取得できます。以下のステップは、 図3Cおよび4Cに示されるものと同様の人口統計を生成する方法の例を与える。 <ol><li> &quot;Metamorph nd＆ROI files importer&quot;を使用して、ソフトウェアで以前に作成されたフィジー/ ImageJのロード領域マーキング（.rgn）（ステップ5.6）;あるいは、分析される細胞の関心領域（ROI）は、組み込み「セグメント化された線」ツールを使用して、Fiji / ImageJで直接作成することができる。 </li><li> 「Analyze / Tools / ROI manager」を開き、すべてのアクティブなリスト項目をマークします。 </li><li>その後、 &quot;More / Multi Plot&quot;をクリックし、新しい &quot;Multi Plot&quot;ウィンドウで &quot;List&quot;を選択します。テーブルエントリをクリックして、「すべてコピー」を選択します。その後、新しいスプレッドシートに貼り付けます。 注：最も長いセル（対応する2つのXとYの列が最も多くの行を持つ）のデータがスプレッドシートの最後のものであることを確認してください。 </li><li>スプレッドシートを「CSV（カンマ区切り）（* .csv）」として保存します。 </li><li> Rスクリプトはここからダウンロードしてください。 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10.スクリプトは長さ別に細胞を分類し、各細胞の蛍光強度の平均としてすべての細胞の蛍光強度プロファイルを正規化しますe。 </li><li> R [バージョン3.0.1のスクリプト &quot;cell profiles function.R&quot;全体を実行します。 11 ]。 </li><li> 30行目の &quot;example plots.R&quot;スクリプトを編集して、ファイルパスが以前に生成された.csvファイルが保存されているフォルダを参照するようにします。さらに、31行目のファイル名 &quot;profile.csv&quot;を、手順5.9.4で生成した.csvファイル用に選択したファイル名に変更します。その後、 &quot;example plots.R&quot;を実行し、 &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot;のドキュメントとスクリプトファイルのコメントに従って、人口統計解析を生成します。 </li></ol></li></ol>

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利害の衝突は宣言されていない。

本稿では、 V. parahaemolyticus swarmer細胞の顕微鏡画像化方法とそれに続く下流分析を用いて、細胞内局在および研究された蛍光標識タンパク質の他の特徴を解明および定量する方法を報告する。顕微鏡検査画像処理および分析のためのいくつかのツールが存在するが、V.parahaemolyticusスウォーム細胞の分析は、大部分が高密度細胞集団内に通常存在し、細胞長の変動が大きいために依然とし...

細菌は、常に外部環境の変化を経験し、それに応じて行動を変化させ適応させるためのいくつかの技術を開発してきた。そのような機構の1つは、変化した環境をよりよく補う別個の細胞型への分化を含む。分化は、しばしば、細胞周期の調節、細胞形態学、および細胞の時空間組織化における主要な変化を伴う。分化を受けることができる1つの生物は、腸炎ビブリオである 。 V.parahaemolyticusはVibrionaceaeに属し、これは通常新鮮なまたは塩水に棲むプロテオバクテリアのファミリーである。 Vibrionaceaeは環境に広く分布しており、Vibrio cholerae.Vを含むヒトに腸管感染を引き起こすいくつかの種を含む。腸炎菌は二形性生物であり、その変化に対応するための応答として2つの異なる細胞型に分化することができる外部環境。水性環境では、それは古い棒状のスイマー細胞として存在し、単一の極性鞭毛が古い細胞極に位置する。表面が接触すると、スマーマーセルへの分化が引き起こされる。スワマー細胞の分化には、2つの大きな変化が含まれる：細胞分裂の阻害によるスワマー細胞の形態形成、および第2の鞭毛系の誘導。この結果、蠕虫状の非常に細長い棒状のスマーマー細胞が形成され、スマーマーライフスタイルを続けることができ、分裂イベントは後代のスマーマー細胞を生じるか、または代わりにスイマー細胞に分化する。 スウォーマーの分化を誘導または影響するいくつかの因子が報告されている。一次刺激は、 V.腸炎菌が表面接触時の回転の阻害を検出する触覚センサとして極性鞭毛を使用するメカノセンシングによって駆動されると思われるが、他のいくつかの要因がウェル1 。実験室では、フェナミルを添加することにより、極性鞭毛の回転を人為的に阻害することができます。フェナミルは、ナトリウムチャネル駆動の鞭毛回転を阻止し、それによりスワマー分化を誘発します2 。さらに、初期の研究では、細胞を透明なプラスチックテープでシールしたペトリ皿中で増殖培地上で増殖させると、 ビブリオ・アルギノリチカスは固体培地上に集まるように誘導された。アルカリ性の濾紙は、これらの条件下での群れを防ぎ、したがって、1つまたは複数の揮発性酸が群れ誘導に関与している可能性があることを示唆している。従って、プラスチックテープでペトリ皿を密封することは、プレートのヘッドスペース内で、細胞代謝の副生成物として形成される揮発性酸の蓄積を可能にする可能性が高い。培地成分を加水分解することによって人工的に揮発性酸を生成するために、シールされていないペトリ皿中で増殖培地にH 2 O 2を添加した場合にも同じ効果が達成された<supclass = &quot;xref&quot;&gt; 3、4、5。それにもかかわらず、このような揮発性酸のアイデンティティは未知のままである。さらに、カルシウム6および鉄制限7の過剰な利用は、固体表面上のスマーマー分化および増殖を促進することが示されている。化合物2,2&#39;-ビピリジルをスウォーマー分化に影響することが示されている増殖培地に添加することにより、細胞を鉄で飢えさせることができる8 。分化を調節することが知られている因子は、スワマー細胞への腸炎ビブリオ寄生虫の分化および固体寒天表面上でのそれらの増殖を再現可能に誘導するプロトコールの設計において現在実施されている。 V.腸炎ビブリオの分化は、細胞分裂、細胞形態の調節、および鞭毛のような巨大分子機械の配置における主要な変化を伴うaおよび走化性装置 - 細胞周期に従ってタンパク質の特異的局在を必要とするプロセス。従って、このようなタンパク質の細胞内局在を研究する能力は、前述の細胞プロセスの理解に必須である。そのような研究を行うためには、単一細胞に対する蛍光顕微鏡法が必要である。これは、スマーマー細胞の場合のように、高密度細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。顕微鏡検査のために単一細胞を潜在的に生成する可能性がある液体培地中のスマーマー分化を誘導する試みがなされている。そして、転写レベルでは、これらの細胞は部分的にスワマー分化プログラムを誘導したが、固体培地上で増殖させた完全に分化したスマーマー細胞と同じ形態変化を受けなかった8 。この論文は、スワーマーを誘発する方法の堅牢で再現性のあるプロトコルを提供する寒天表面での分化。プロトコールは、単一細胞顕微鏡法およびその後の分析のために容易に入手可能な容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生する。さらに、このプロトコールは、スイマー細胞およびスワマー細胞型（セクション1,2,3,4）の両方において蛍光標識タンパク質の局在化研究を可能にする。さらに、このプロトコルは、細菌顕微鏡の人口統計的分析を可能にする蛍光顕微鏡検査（セクション5）から生成されたデータを処理および分析する方法に関する後続のワークフローを記述する。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulated</td><td>BD</td><td>214510</td><td>For preparation of LB agar with LB medium</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Agarose NEEO, ultra quality</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>For preparation of microscopy agarose pads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>Used to induce pBAD derivatives</td></tr><tr><td>2,2`-Bipyridyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>-</td><td>-</td><td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>D(+) Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hardware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 mm x 20 mm with cams</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td><td>Heraeus</td><td>-</td><td>Used for drying HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>Used for microscopy image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>Used for microscopy data analsis</td></tr></tbody></table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

タンパク質の細胞内局在を研究する能力は、多くの細胞プロセスの理解に不可欠です。これは、蛍光顕微鏡検査のための単一細胞を得る能力を必要とし、細菌集団内に存在する細胞を画像化する場合に特に困難であり得る。例えば、ヒト病原体Vibrio parahaemolyticusは、表面接触時に固体表面上での増殖に特化した非常に細長いスマーマー細胞の亜集団に分化する液体状態の短い棒状のスイマー細胞として存在する。本稿では、 V.parahaemolyticusの 2つの異なる状態における単一細胞蛍光顕微鏡分析を行う方法を提示する。このプロトコールは、V.parahaemolyticusのスワマー細胞ライフサイクルへの分化を非常に再現性よく誘導し、固体表面上でのそれらの増殖を促進する。この方法は、tから伸びる分化したスマーマー細胞のフレアを生成する群れコロニーの縁である。注目すべきは、群れのフレアの先端では、スワマー細胞が細胞の単一層内に存在し、顕微鏡スライドおよびその後の単一細胞の蛍光顕微鏡画像化への容易な移行が可能になることである。さらに、細菌学の人口学的表現のための画像分析のワークフローが提示されている。原理の証明として、V.parahaemolyticusのスイマーおよびスマーマー細胞における走化性シグナル伝達アレイの細胞内局在の分析が記載されている。

集団コロニーの分化誘導 図1は、 V.parahaemolyticus （ 図1A〜C）の 鞭打ちコロニーを産生することに関与する重要なステップのスキーマを提供する。スイマー培養物を群寒天にスポットし、24℃でインキュベートし、固体寒天表面上のスマーマー分化および増殖を誘導した。群れたコロニー...

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Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。

細胞分化および単細胞イメージングの誘導<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;スイマーとスマーマー細胞

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K ビュー.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology. このプロトコールは、差異的に異なる腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）スイマーおよびスマーマー細胞の単一細胞顕微鏡検査を可能にする。この方法は、単細胞分析のために容易に入手可能なスマーマー細胞の集団を産生し、細胞培養の調製、スマーマー分化の誘導、試料調製および画像分析を包含する。 

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Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

遺伝学

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

生化学

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

生物工学

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

免疫・感染学

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

生物学

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. Therefore, it is considered a living antibiotic. To apply B. bacteriovorus as a living antibiotic, it is first necessary to understand the major stages of its complex life cycle, particularly its proliferation inside prey. So far, it has been challenging to monitor successive stages of the predatory life cycle in real-time. Presented here is a comprehensive protocol for real-time imaging of the complete life cycle of B. bacteriovorus, especially during its growth inside the host. For this purpose, a system consisting of an agarose pad is used in combination with cell-imaging dishes, in which the predatory cells can move freely beneath the agarose pad while immobilized prey cells are able to form bdelloplasts. The application of a strain producing a fluorescently tagged &#946;-subunit of DNA polymerase III further allows chromosome replication to be monitored during the reproduction phase of the B. bacteriovorus life cycle.

Live-Cell Imaging of the Life Cycle of Bacterial Predator Bdellovibrio bacteriovorus using Time-Lapse Fluorescence Microscopy

Presented here is a protocol that describes monitoring of the complete life cycle of predatory bacterium Bdellovibrio bacteriovorus using time-lapse fluorescence microscopy in combination with an agarose pad and cell-imaging dishes.

タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた細菌プレデター ブレロビトリオバクテリオボルス のライフサイクルの生細胞イメージング

Bdellovibrio bacteriovorus is a small gram-negative, obligate predatory bacterium that kills other gram-negative bacteria, including harmful pathogens. ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

細胞分化および単細胞イメージングの誘導

要約

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微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

ImageJを用いたサルモネラ菌の細胞内表現型自動解析

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた細菌プレデターブレロビトリオバクテリオボルスのライフサイクルの生細胞イメージング

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査

細胞分化および単細胞イメージングの誘導

要約

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微生物集団に定着表面に空間的分離の監視

インデューサーグラジエントプレート上の細菌表面群動運動性の定量化

カエノラブディティス・エレガンスの長期増殖とイメージングのためのシンプルなマイクロ流体チップ

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化

定量的イメージング技術を用いたヘテロ細胞集団の識別と特徴付け

枯草菌の単一細胞マイクロ流体解析

タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた細菌プレデター ブレロビトリオバクテリオボルス のライフサイクルの生細胞イメージング

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより 、大腸菌 におけるフラゲラ駆動運動性の調査

ImageJを用いたサルモネラ菌の細胞内表現型自動解析

タイムラプス蛍光顕微鏡を用いた細菌プレデターブレロビトリオバクテリオボルスのライフサイクルの生細胞イメージング

シリーズで3つの確立された技術を適用することにより、大腸菌におけるフラゲラ駆動運動性の調査