ライブセルブレロビブリオバクテリオボルスイメージングは、これらの捕食細菌の複雑なライフサイクルのために挑戦されています。当社のプロトコルは、完全なライフサイクルの段階をリアルタイムで監視することを可能にします。我々のプロトコルは特定のイコライゼーション株に基づいているが、病原性株を含む様々な細菌株に容易に適応することができる。
B.bacteriovorus培養を設定するには、必要に応じて抗生物質を添加した50ミリリットルのヒッピーバッファーを含む250ミリリットルフラスコで、新鮮な24時間培養細菌の1ミリリットルと一晩の獲物培養の3ミリリットルを組み合わせます。摂氏30度で24時間、毎分200回転でインキュベーションした後、獲物細胞が液体に取り付けられた顔コントラスト顕微鏡によって完全に取り付けられていることを確認してください。多数の多重攻撃段階的B.バクテリオボルス細胞が存在し、大腸菌細胞またはbdelloplastが見えるべきではない。
B.bacteriovorus培養液を0.45マイクロメートルの孔径フィルターを通して50ミリリットルの円錐形チューブにひずみ、遠心分離機で濾液を下に吊り下げる。その後、カルシウムヒッピーのバッファーの3ミリリットルでB.bacteriovorusペレットを約0.2の600ナノメートルで最終的な光学密度に再中断し、30°Cで細菌をインキュベートし、毎分200回転で30分間インキュベートします。宿主細胞を調製するには、目的の宿主株から単一のコロニーを選択し、37°Cで一晩インキュベーションのために必要に応じて抗生物質を添加したYT培地の10ミリリットルの細菌を1分あたり37度および180回転で結節する。
翌朝、一晩培養した2ミリリットルを2ミリリットルの試験管に移し、遠心分離によって細胞をペレット化する。その後、200マイクロリットルのカルシウムヒッピーバッファーにペレットを再中断します。遠心分離後に細胞ペレット全体を完全に再中断し、獲物細胞が単一細胞レベルで分離されていることを確認することが非常に重要です。
蛍光顕微鏡のタイムラプスのために細胞を調製するには、まず、低蛍光分子グレードのアガロース200ミリグラムとヒッピーの20ミリリットルを混合し、電子レンジにアガロースを溶解します。溶かしたアガロースを35ミリメートルのガラス底皿に3ミリリットル注ぎ、アガロースを固める。実験室用のマイクロスパチュラを使用して、パッドの中央のポールを邪魔することなく、皿からアガロースパッドを慎重に取り出し、ペトリ皿カバーの上にパッドの底側を置きます。
濃縮された宿主細胞懸濁液の5マイクロリットルを反転したパッドに置き、接種ループを使用して中央極の細胞を広げます。次に、濃縮されたB.bacteriovorus懸濁液を広げることなく宿主細胞コーティングされた表面に5マイクロリットルを加え、35ミリリットルガラス底皿の上面にゲルを素早く戻します。その後、蓋で皿を覆います。
コカルチャーのタイムラプスフロリセンス顕微鏡の場合は、皿が実験の過程で動かないようにペトリ皿ホルダーに皿を置き、逆顕微鏡の目的に浸漬油を1滴、皿の底に1滴置きます。ホルダーを逆顕微鏡室内の顕微鏡ステージに取り付け、顕微鏡ソフトウェアでは倍率を100Xに、ポリクロームレンズをGFPとMcherryに設定します。ブライトフィールドでiPSを使用して、焦点面を見つけて無意味なマネージャを開きます。
ステージを移動し、マーク ポイント ボタンを使用して、少なくとも 10 の位置の座標を格納します。カメラのバルをiPSからモニタに切り替えます。焦点面を設定し、各ポイントを調整するマネージャに無意味でポイントを置き換えるボタンをクリックします。
実験デザイナーを開き、病気のスタッキング ボックスのマークを解除します。適切な蛍光チャネルと最適な除去設定を選択し、画像の取得と実験の合計時間の間隔を設定します。選択した位置のフォーカスメンテナンスを有効にし、画像ファイルを自動的に保存するデータフォルダを選択します。
顕微鏡ソフトウェアコントロールのすべての設定を再確認し、タイムラプス実験を開始します。実験の最初の1時間後、すべてのステージ位置が依然として焦点を合わせているか確認してください。タイムラプス実験が終了したら、ペトリ皿を取り出し、適切なバイオセーフティプロトコルに従ってアガロースパッドで35ミリメートル皿を捨てます。
タイムラプス画像データの処理のために、フィジーのソフトウェアを搭載したコンピュータに実験データを転送し、フィジーで画像を開きます。バイオフォーマットインポートオプションで、ハイパースタックを使用してビュースタックを選択します。コンポジット カラー モードで、自動スケールを選択します。
画像スタックをスクロールすることで、細胞とbdelloplastsが実験の過程で焦点を当て続けたかどうかを評価します。DNAとmNeon緑色の緑色のスポットが、成長期を通じてB.bacteriovorus細胞内に存在するかどうか、および捕食ライフサイクルのすべての段階を視覚化できるかどうか。特定のB.バクテリオボルス細胞bdelloplastを分析するには、選択ツールを使用して対象セルをマークします。
次に、選択したリージョンを複製します。複製された画像で、プロセスをクリックして滑らかにし、各蛍光チャネルについて、画像、色、チャンネルツールをクリックし、対象のチャンネルを選択します。次に、画像、調整、明るさのコントラストをクリックして、各チャンネルの画像の明るさとコントラストを調整します。
縮尺バーを追加するには、分析、ツール、スケール バーを選択します。画像にタイムスタンプを追加するには、画像、スタック、および時間のスタンパーをクリックします。変更した画像を保存するには、[TIF] を選択します。
データをイメージ シーケンスとして保存するには、AVI を使用してムービーを作成し、現在のフレームのイメージを 1 つ保存する PNG を作成します。このタイムラプス蛍光顕微鏡システムは、個々のB.バクテリオボルス細胞のリアルタイム追跡を可能にし、複雑な捕食ライフサイクルの各段階に関する貴重な情報を提供します。錠剤mCherry融合は、捕食細胞全体を攻撃段階および成長段階の初期段階で標識することを可能にする。
攻撃から複製フェーズへの移行は、ホストのbdelloplast形成だけでなく、replisomeの外観によっても視覚化できます。このレプレッサムは、侵入した細胞極で組み立てられ、再生相が進行するにつれて、成長するB.bacteriovorusフィラメント内で複数の応答体が観察される。染色体のコピーが複数合成された後、複製は終了する。
最後に、多核化フィラメントはセプテレーションを受け、子孫細胞はbdelloplastから放出される。B.bacteriovorus細胞は積極的に獲物を探索するのに十分な材料である必要があり、細胞密度全体が捕食細胞の付着を可能にするのに十分高いはずです。このプラットフォームは、多剤耐性病原体を含む実験に有用であり、ヒトおよび獣医学における生きている抗生物質としてのB.bacteriovorusの遺伝子工学の改善を促進するために有用である可能性がある。
