著者は、米国陸軍研究所 (ARL) ポスドク ・ フェローシップ プログラムの博士ジャスティン ・ p. ヤンキーの選任による ARL と契約をオーク リッジ関連の大学によって管理サポートを認めたいと思います。残りの資金は、センサーと ARL で電子デバイス本部によって提供されました。著者も感謝したいドーリィ ティー ラボ UCSB で細菌表示ライブラリと YPet モナ試薬、ARL、博士ジョシュア Kogot 彼の初期の仕事のために YPet モナ試薬をクローンとサポートのブリン アダムス博士のクローン作成のための情報を共有するため、細菌のバイオパニングの訓練表示ライブラリ、エッジウッド化学とプラスミドのエクスプレスし、abrax を浄化するために使用を共有するための生物センターのアリーナで穏やかなおよび rivax タンパク質ブランディ ドーシー PA 結合ペプチド、秦 Guo の隔離のためのテクニカル サポートabrax 結合ペプチドの単離の実験、この原稿についての議論が参考のため博士ジェシカ テレルのテクニカル サポート。

著者がある何も開示するには

バイオパニング細菌の表示ライブラリは親和性試薬の分離に成功したアプローチをされており、ペプチド抗体認識のために有用な代替を提供は、特定の条件が必要な場合、極端な環境での安定性など。これらのライブラリのバイオパニングは、ここで説明されている autoMCS メソッドを使用して簡素化されていて、市販 autoMCS プラットフォームより多くの人にこのテクノロジを拡張します。伝統的な交互 MCS/FACS と比較して細菌の並べ替え方法表示ライブラリ、autoMCS メソッドは、並べ替えとの連結の細胞を分離することができるより高価な FACS 装置への投資が不要で安価ここで使用される流れの cytometer の型ではなくであるのみ分析14のことができます。AutoMCS によって成功したバイオパニングのための重要なステップがあります分離プログラム選択、FACS を使用して、バイオパニングを停止するタイミングを決定するライブラリ濃縮を監視、偽陽性を減らすために潜在的な交差反応に対して並べ替え負と候補者の何百もの面倒なスクリーニングを避けるために候補者プールのスマートな分析。
記載例のプールごとにペプチド配列の違いにより若干異なる分析戦略とが PA と abrax、2 つの独立したターゲットのための選ばれた細菌表示ライブラリの成功バイオパニングを示すバイオパニングの 4 つのラウンド後の候補者。PA の 144 植民地で少なくとも一度繰り返されるペプチド配列から明確な傾向を示すシーケンス分析より簡単なケースだった。今回は単独でコンセンサスを含まれている PA ターゲットのコンセンサス シーケンスを判別するのに十分なそれらのコロニーまたは同様のシーケンス ストレプトアビジン ネガティブ コントロールへのバインドと PA へのバインドの比率の面で最適な候補。しかし、この常になる場合。Abrax ターゲット 5 繰り返しシーケンスにシーケンス 100 コロニーを導いたが、これらのシーケンスで傾向があまりすっきりした芳香族アミノ酸残基とアスパラギン酸やアスパラギンが含まれてする傾向以外。シーケンスされたコロニーのリストに戻って、観察親シーケンスにその正確な一致シーケンスが含まれていませんので、繰り返しシーケンスから予測「コンセンサス」のみが生産・ abrax への親和性のためにテストその他候補者であり、互いに共通のより多くの傾向があった。実際には、2 つのコロニーには、繰り返しだけで、(FWAWF ではなく FWDTWF)、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン残基が異なる間隔で同様の傾向があったから「コンセンサス」同様シーケンスが含まれています。これらのペプチドの 1 つは、繰り返しシーケンス、1 つではなかった。似たような変種を含む 3 番目のシーケンスと共に、これらの 2 つのシーケンス abrax の親和性の観点でテスト トップ 5 のバインダーの中にあった。全体のトップ バインダー AX-A05 によっても同様の傾向が表示されます。Abrax の結果は、シーケンス分析との親和性と特異性の解析間に数回のアプローチを交互に選ばれたターゲットに応じて、必要あることを示します。Abrax ターゲットの結果も非常によく似た蛋白質 (rivax 1,15) に達成することができる特異性のレベルを示します。
私たちの研究に選ばれる autoMCS プログラムされた初期の人口の 5% 未満の低周波を用いたラベル付き標的細胞の正の選択の両方は、Posselds と Posseld。どちらの場合も、セルは 2 つの磁気列を通過します。Posselds プログラムの場合ただし、セル通過よりゆっくりと露出時間41を増加する最初の列。商業 autoMCS デバイスの製造元によって与えられたプログラム説明に加えて (を材料表参照) 41、これらのプログラムは、いくつかの潜在的なプログラムの最初の比較の後選ばれました。陰性対照セルの均質な文化からの偽陽性を抜くようにと正常に興味のターゲットに陰性対照細胞減少とスパイクを含む混合文化から知られているバインダーを分離する各プログラムの能力知られているバインダーの割合を比較しました。ここで説明したアプリケーションから著しく逸脱、同様の比較は新しいアプリケーションのプログラムの選択に役立つと。ただし、以前類似のペプチドの分離に導いたバイオパニングのすべての 4 つのラウンドのためにこれらのプログラムのいずれかを使用することを示した PA のペプチド親和性試薬の隔離のためこれら 2 つのプログラム (Posseld と Posselds) の比較結果を公開アフィニティと PA の特異性と WXCFTC コンセンサスの決意。高速流動度より迅速にソートのその Posseld でされ、バインディング ターゲットへの親和性が高かったしたがってバイオパニングの唯一の 2 つのラウンドの後バイオパニングの 4 つのラウンドの後のより多くのユニークなシーケンスにつながった Posselds を使用している間の主な違い14. これから学習、戦略を若干変更したとき両方の利点を組み込む abrax 結合ペプチドのバイオパニング: Posselds は、ラウンド 1 の多様性が、その後最高、この重要なステップの間に露出時間が使用された、プログラムはラウンド 2-4 1,15中最高の親和性バインダーの高速分離のため Posseld しました。特に以来、nMFI とパーセントのバインドされたともに abrax 並べ替え並べ替えいずれかのプログラムでラウンド 4 PA と比べてラウンド 4、abrax に最適なように (図 2 、図 3と Sarkesら201514) が同じターゲットに対して他の対 1 つの戦略を使用して直接比較がより決定的な比較に必要となります。個々 のターゲット、使用されている並べ替えライブラリとは、ここで説明した条件の変更で実現ペプチド発現のレベルに依存可能性がありますプログラムが特定のアプリケーションに最適です。
説明しませんここでは非生物的材料とバイオパニングからの潜在的な結果が、一括アルミ2に対してバイオパニングの同じ細菌表示ライブラリを用いても。本研究では、autoMCS を使用しては実行されませんでしたが、同様の研究は、材料は、可能性があります上にコーティングまたは、磁気ビードに共役 autoMCS を使用して行うことができます。一括アルミニウム研究では個々 のアミノ酸分析と二次構造モデリングだった分離ペプチドの結合親和性を運転していたもの、コンセンサス配列決定2はなかったので理解する上で役に立つ。生物学的目標ともこれは何が運転して"eCPX_Sequencing"マクロから生成されたスプレッドシートに個々 の残留周波数分析のタブが含まれています理由はいくつかのターゲットのための結合親和性を理解する必要があります。しかし、合意の欠如に加えて、繰り返しシーケンスは表示されない残留周波数パターンを示さない場合、他の種類の分析は要求されるかもしれない。また、さらなる並べ替えラウンド ダウン選択目的のターゲットに十分な親和性とのそれらのための候補者のはるかに大きい数をスクリーニングを避けるために必要かもしれません。
次世代シークエンシングの増加する供給、アフィニティのテスト前に最も有望な候補者を確認してバイオパニングの各ラウンド後の濃縮の程度を調べるためより徹底的な調査を実行でした。しかし、彼らは簡単にルーチン コロニー ゲノ ム配列数十または何百ものコロニーの分離に十分に高い周波数ではない場合シーケンス結合分析手順に進むは複製、再作成する必要があります。この技術の進歩より安価なより日常的になるとコロニーの分離のために、特にそれが可能性が高いバイオパニング データを分析する最もよい方法であります。それは個々 のシーケンス、およびライブラリ全体の解明につながる可能性があります、進化。高速の成長率やノザン ゲノム蛋白質の表示の足場およびペプチドの式がなくても素材をバインドできない細菌のセルに向かって並べ替えバイアスが時間をかけて並べ替えライブラリで細菌が変異はさらに、インスタンス。そのため、一度有望な候補が出てくるだプラスミド DNA を分離する、新鮮なエシェリヒア属大腸菌を retransforming、FACS によるペプチド結合を確認する価値があります。セルなしの形式で、ペプチドを使用する場合、アフィニティは、無料ペプチドも評価されなければなりません。たとえば、ターゲット SEB の細菌のディスプレイを介して発見されたペプチド親和性試薬総合的作り出されたセルをオフと immunosorbant の酵素抗体法 (ELISA) と (FACS) 経由でセルとセル オフなどのより伝統的な方法によって分析(ELISA) 経由で、親和性は Kds 7は両方の方法で決定を用いて比較した.
ストレプトアビジン-ビオチンの相互作用の強さはターゲット蛋白質とペプチド結合の捕獲のための理想的な戦略になって、この手順は他のキャプチャの方法で変更できます。エポキシやカルボン酸ビーズなどの磁性ビーズにタンパク質の直接結合は成功しているし、バインド ステップを削除します。ただし、直接添付ファイルは添付ファイル戦略によって、特定または不特定の方法で潜在的な結合部位を妨げます。ストレプトアビジン ビーズを使用する付加的な利点は安定したタンパク質少ない目標たて 30 分でビオチン化をすることができますまたは保存凍結、彼ら自身ビーズ架橋用蛋白質と長い潜伏を要求する傾向がある一方、必要な場合一般的に 2-8 ° C で保存ビオチン化タンパク質の提案された開始濃度目標ここでは、600 nM は複数のターゲットに成功しているが、この濃度は減る場合と高親和性ペプチド キャプチャ試薬を分離することが可能かもしれません。さらに、このメソッドを拡張するおよび他細菌表示ライブラリおよび他の有機体の変更できます。たとえば、用嫌気性菌、酸素がない場合または一意のプロパティを持つペプチドを分離する極限環境で使用するための他の環境では、これらの手順を実行することができます。ペプチドおよび/または興味の特定のターゲットは潜在的にすることができますを決定するコンセンサスは、生体材料、又は総合的作り出されたセルをセル上を使用しました。さらに高い親和性とより堅牢なタンパク質触媒をキャプチャ (PCC) エージェント用センサー、または抗体は、バインディングに使用される、通常他のアプリケーションの開発で総合的作り出されたペプチドがさらに熟成させますか認識38,55。図 5 1に掲げる abrax 結合ペプチドとコンセンサスの最近行われたように、ペプチドは、ターゲットの場所をバインディングを決定するために、分子モデリングを使用もできます。全体的に、ペプチドのアフィニ ティーの試薬のためのバイオパニング細菌表示ライブラリは認識のための抗体の生産と蛋白質ターゲットの検出とこの半自動バイオパニングに高速、簡単、かつ強力な代替アプローチ広範囲にわたるアプリケーションに信頼性の高い結果を生産しています。

バイオパニング親和性試薬発見のため実績のある手法、細菌を表示ライブラリ ペプチド親和性試薬1,2,3,4,の5、便利なソース 6,7,8,9,10、11,12,13,14、 15,16,17,18,19,20,21,22,23、 24。同様にバクテリオファージ表示25,26酵母表示27,28ペプチドは細胞表面にさらされている、これらの相互作用がある、生物的・非生物的ターゲットをバインドできます。ペプチッド バックボーンとアミノ酸側鎖29のユニークな特性によって駆動。バクテリオファージの表示と対照をなして、菌自体は自己複製、バインドされたバクテリオファージの溶出と細胞の再感染なし表示に必要なすべての遺伝物質を含んでいます。酵母ディスプレイと対照をなして細菌表示は快速 (約 20 分30)エシェリヒア属大腸菌のダブルタイムのため高速です。結果として得られるペプチド親和性試薬を作り出すことができる様々 なプラットフォーム16,17,26をセンシング用セルをオフ、生活材料表示セル2使用の可能性があります。,31,32. と比較して、特定のターゲットの認識のためのモノクローナル抗体、ペプチドは、はるかに小さくより柔軟なペプチドの表示ライブラリは特定のアミノ酸、システイン33 などを避けるために DNA レベルで簡単に操作できます。.ペプチドがますます治療34,35,36と他の抗体は、検出、再現性のある合成 (セルを容易にするため利用すると通常のアプリケーションの利用) 生産・冷凍37,38せず長期保存や高温にさらされた後でも機能性試薬を提供する他の極限環境でのパフォーマンスの優れたメンテナンス。試薬の保管のためのコールド チェーンを克服する機能は、極端な環境で動作する必要があります特定の関心は、国防省、例えばのです。熱安定性は、従ってこの原稿の例として与えられる選ばれたターゲットを認識し親和性試薬の望ましい機能だった。
最近では、バイオパニング細菌表示ライブラリも簡単で並べ替え (MAC または MCS) メソッド9,14,39半自動磁気活性化細胞を用いて信頼性の高いになりました。これらのメソッドは、磁気活性化細胞 (autoMACS または autoMCS) の楽器を並べ替えを自動市販などのさまざまな利点を持つプラットフォームを並べ替えいくつかの類似を使用して生物学的ターゲットの実証されている (表を参照してください。材料) 1,14,15と使い捨てカートリッジ7,9またはチップ39、貴重な仕様でサンプルを囲むより専門的なデバイスを使用し生物やバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) またはより高い7毒素。これらの半自動化されたメソッドは、ペプチド材料磁気や磁気ビーズにし (嫌気性菌) などの異なる生物を使用するコーティングもする能力を持っている場合、非生物材料にバインドすることができるの並べ替えに拡張すること、並べ替え成長条件が変更されます。細菌表示ライブラリを並べ替えるだけでなくここで使用される商業 autoMCS 楽器も使用されています一部それ以上の分離に続いて、酵母の表面に表示される人間の単鎖抗体フラグメントの発見の初期の手順について蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) 40を使用しています。並べ替えの時間と労力より堅牢かつ再現可能な除去磁気ビーズから非連結の細胞の洗浄手順、偽陽性の削減につながる、少数の必要な並べ替えラウンド中になり、半自動化する主な利点は減少します。複雑なダウン ストリーム分析9,14。商業 autoMCS 楽器の場合は、別のアプリケーションに最適、負事前並べ替え (枯渇) など純度の優先順位付け、最後のサンプル ボリュームを最小限に抑え、増加される複数のプリロード プログラムまたは希少な細胞41の隔離のための感度を減少しています。
この作品の焦点は、市販の autoMCS 装置を用いて細菌表示ライブラリ バイオパニングの方法論を実証して分析し、候補者の結果として得られるプールを最小限に適用される思考プロセスを詳しく説明するには他のアプリケーションへの拡張を容易にするため。ここで使用される表示ライブラリ (材料の表参照) 12,13を含む約 109- 1011ユニークな 15 mer ペプチド細菌外膜タンパク質 OmpX の修正版を介して表示で、できれば無料のペプチドは溶液中の代表が期待されている細胞表面で制約のない性質は合成的に生産。この蛋白質の足場には、C 末端 YPet Mona にバインディングによって式を監視するための肯定的な制御 P2X ペプチドさらに含まれています。ただし、適切な多様性と必要な特定のアプリケーションに必要なその他の特性購入または新規ライブラリでは、このバイオパニング手順をいくつかのマイナーな変更が必要になることがありますは同様に動作をする必要があります。このバイオパニング プロトコルの概略図を図 1に示します。さらに、プロトコルに合わせることができる他の自動磁気並べ替えプラットフォームおよびその他の並べ替えの戦略。正常に、実証されているために必要なより複雑な時間のかかるストリーム分析増加偽陽性14、とはいえベンチトップ磁石手動磁気並べ替えとそれにもかかわらずに代わりのオプションを提供します、autoMCS 手順なしの自動磁気細胞選別装置、使用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

バイオパニング細菌表示ライブラリは、生物的・非生物的ターゲットの認識ペプチドの親和性試薬発見のため実績のある手法です。ペプチド親和性試薬は抗体検出と治療法などを含む、類似したアプリケーションの使用できますより堅牢なより多くの極端な環境で実行することができます。興味の蛋白質ターゲットにペプチド捕獲のエージェントの特定の濃縮は、結合を改良し、洗浄ステップ、したがって偽のポジティブなバインダーの発生を減少させる半自動の並べ替え方法を使用して強化されています。半自動並べ替えメソッドは、制約のない細菌ディスプレイ表現ランダム 15 mer ペプチド ライブラリの並べ替えと選別装置商業自動磁気活性化の細胞の使用のためにここに記載されているです。わずかな変更を加えると、これらのメソッドは他に拡張可能なデバイス、その他の並べ替えのライブラリ、および他の生物を自動化します。この作品の主な目的は、包括的な方法論を提供し、分析し、候補者の結果として得られるプールを最小限に適用される思考プロセスを解説です。これらの技術は、個々 の候補者の比較、並べ替え中に親和性と特異性を評価するために蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用してセルにバインドの解析と傾向を特定するシーケンスのペプチドの解析とコンセンサス シーケンスの理解と潜在的興味のターゲット特異性と親和性を改善します。

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

semi-automated-biopanning-bacterial-display-libraries-for-peptide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K ビュー.  US Army Research Laboratory. バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。

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Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

生化学

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in the cytoplasm. Commonly used methods for the display and screening of recombinant antibody libraries do not incorporate intracellular protein folding quality control, and, thus, the antigen-binding capability and cytoplasmic folding and solubility of antibodies engineered using these methods often must be engineered separately. Here, we describe a protocol to screen a recombinant library of single-chain variable fragment (scFv) antibodies for antigen-binding and proper cytoplasmic folding simultaneously. The method harnesses the intrinsic intracellular folding quality control mechanism of the Escherichia coli twin-arginine translocation (Tat) pathway to display an scFv library on the E. coli inner membrane. The Tat pathway ensures that only soluble, well-folded proteins are transported out of the cytoplasm and displayed on the inner membrane, thereby eliminating poorly folded scFvs prior to interrogation for antigen-binding. Following removal of the outer membrane, the scFvs displayed on the inner membrane are panned against a target antigen immobilized on magnetic beads to isolate scFvs that bind to the target antigen. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based secondary screen is used to identify the most promising scFvs for additional characterization. Antigen-binding and cytoplasmic solubility can be improved with subsequent rounds of mutagenesis and screening to engineer antibodies with high affinity and high cytoplasmic solubility for intracellular applications.

We provide a method to simultaneously screen a library of antibody fragments for binding affinity and cytoplasmic solubility by using the Escherichia coli twin-arginine translocation pathway, which has an inherent quality control mechanism for intracellular protein folding, to display the antibody fragments on the inner membrane.

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the use of four routinely used biosensor platforms in our laboratory to evaluate the binding affinity and kinetics of ten high-affinity monoclonal antibodies (mAbs) against human proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9). While both Biacore T100 and ProteOn XPR36 are derived from the well-established Surface Plasmon Resonance (SPR) technology, the former has four flow cells connected by serial flow configuration, whereas the latter presents 36 reaction spots in parallel through an improvised 6 x 6 crisscross microfluidic channel configuration. The IBIS MX96 also operates based on the SPR sensor technology, with an additional imaging feature that provides detection in spatial orientation. This detection technique coupled with the Continuous Flow Microspotter (CFM) expands the throughput significantly by enabling multiplex array printing and detection of 96 reaction sports simultaneously. In contrast, the Octet RED384 is based on the BioLayer Interferometry (BLI) optical principle, with fiber-optic probes acting as the biosensor to detect interference pattern changes upon binding interactions at the tip surface. Unlike the SPR-based platforms, the BLI system does not rely on continuous flow fluidics; instead, the sensor tips collect readings while they are immersed in analyte solutions of a 384-well microplate during orbital agitation.
Each of these biosensor platforms has its own advantages and disadvantages. To provide a direct comparison of these instruments&#39; ability to provide quality kinetic data, the described protocols illustrate experiments that use the same assay format and the same high-quality reagents to characterize antibody-antigen kinetics that fit the simple 1:1 molecular interaction model.

We describe here protocols for the measurement of antibody-antigen binding affinity and kinetics using four commonly used biosensor platforms.

四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling cascades during homeostasis and disease, and as such represent prime therapeutic targets. Despite their relevance, these interaction networks remain significantly underrepresented in current databases; therefore, most extracellular proteins have no documented binding partner. This discrepancy is primarily due to the challenges associated with the study of the extracellular proteins, including expression of functional proteins, and the weak, low affinity, protein interactions often established between cell surface receptors. The purpose of this method is to describe the printing of a library of extracellular proteins in a microarray format for screening of protein-protein interactions. To enable detection of weak interactions, a method based on multimerization of the query protein under study is described. Coupled to this microbead-based multimerization approach for increased multivalency, the protein microarray allows robust detection of transient protein-protein interactions in high throughput. This method offers a rapid and low sample consuming-approach for identification of new interactions applicable to any extracellular protein. Protein microarray printing and screening protocol are described. This technology will be useful for investigators seeking a robust method for discovery of protein interactions in the extracellular space.

Here, we present a protocol to screen extracellular protein microarrays for identification of novel receptor-ligand interactions in high throughput. We also describe a method to enhance detection of transient protein-protein interactions by using protein-microbead complexes.

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins with high specificity but low affinity. Through phage display, ubiquitin variants (UbVs) can be engineered such that they exhibit improved affinity over wildtype ubiquitin and maintain binding specificity to target proteins. Phage display utilizes a phagemid library, whereby the pIII coat protein of a filamentous M13 bacteriophage (chosen because it is displayed externally on the phage surface) is fused with UbVs. Specific residues of human wildtype ubiquitin are soft and randomized (i.e., there is a bias towards to native wildtype sequence) to generate UbVs so that deleterious changes in protein conformation are avoided while introducing the diversity necessary for promoting novel interactions with the target protein. During the phage display process, these UbVs are expressed and displayed on phage coat proteins and panned against a protein of interest. UbVs that exhibit favorable binding interactions with the target protein are retained, whereas poor binders are washed away and removed from the library pool. The retained UbVs, which are attached to the phage particle containing the UbV's corresponding phagemid, are eluted, amplified, and concentrated so that they can be panned against the same target protein in another round of phage display. Typically, up to five rounds of phage display are performed, during which a strong selection pressure is imposed against UbVs that bind weakly and/or promiscuously so that those with higher affinities are concentrated and enriched. Ultimately, UbVs that demonstrate higher specificity and/or affinity for the target protein than their wildtype counterparts are isolated and can be characterized through further experiments.

Ubiquitination is a critical protein post-translational modification, dysregulation of which has been implicated in numerous human diseases. This protocol details how phage display can be utilized to isolate novel ubiquitin variants that can bind and modulate the activity of E3 ligases that control the specificity, efficiency, and patterns of ubiquitination.

ファージディスプレイを使用してE3リガーゼ用ユビキチンバリアント変性変性器を開発する

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, as well as interactions with several growth factors and cytokines. Overexpression of specific MMPs is responsible in several diseases such as cancer, neurodegenerative diseases, and cardiovascular disease. MMPs have been the center of attention recently as targets to develop therapeutics that can treat diseases correlated to MMP overexpression.
To study the MMP mechanism in solution, more facile and robust recombinant protein expression and purification methods are needed for the production of active, soluble MMPs. However, the catalytic domain of most MMPs cannot be expressed in Escherichia coli (E. coli) in soluble form due to lack of posttranslational machinery, whereas mammalian expression systems are usually costly and have lower yields. MMP inclusion bodies must undergo the tedious and laborious process of extensive purification and refolding, significantly reducing the yield of MMPs in native conformation. This paper presents a protocol using Rosetta2(DE3)pLysS (hereafter referred to as R2DP) cells to produce matrix metalloproteinase-3 catalytic domain (MMP-3cd), which contains an N-terminal His-tag followed by pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) for use in affinity purification. R2DP cells enhance the expression of eukaryotic proteins through a chloramphenicol-resistant plasmid containing codons normally rare in bacterial expression systems. Compared to the traditional cell line of choice for recombinant protein expression, BL21(DE3), purification using this new strain improved the yield of purified Hisx6-pro-MMP-3cd. Upon activation and desalting, the pro domain is cleaved along with the N-terminal His-tag, providing active MMP-3cd for immediate use in countless in vitro applications. This method does not require expensive equipment or complex fusion proteins and describes rapid production of recombinant human MMPs in bacteria.

His-tag purification, dialysis, and activation are employed to increase yields of soluble, active matrix metalloproteinase-3 catalytic domain protein expression in bacteria. Protein fractions are analyzed via SDS-PAGE gels.

アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...