著者は、データの統計的分析のため博士 Su 博士を認めたいと思います。著者もありがとう博士 McClure、DVM、博士 DACLAM、麻酔に関する彼女のアドバイスと痛み管理プロトコルが研究に使用します。このプロジェクトは、研究 (12678v) および米国農務省セクション 1433 資金 (2090) 副社長の西保健大学理学部学務係からの補助金によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウエスタン大学の保健学科によって承認されています。
1. 分離とウマ臍帯行列から MSCs の拡大
<ol><li>観察 foaling 後大人の牝馬 (妊娠している) から胎盤を入手して無菌胎盤から臍帯を分離します。おいて臍帯リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1% ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) の 4 ° C での転送中に処理まで。</li>
	<li>1% と室温 PBS で 2 回臍帯を洗う P/S 50 mL のチューブに。セクション 2 インチ長さ 150 mm の板と P/S 50 mL のチューブの 2 つのまたは 3 回まで血液のほとんどをすすいだ 1% 室温 PBS で洗浄断章に臍帯。</li>
	<li>船を公開する縦へその緒を切る。2 動脈、静脈、鉗子、はさみを使用してコードから尿の茎などの血管を削除します。メスで削って 150 mm の板の上にゼリーのようなマトリックスの周囲血管臍帯マトリックス (Wharton のゼリー) を収集し、細かい部分にゼリーをみじん切り。</li>
	<li>場所ワルトン 15 ml の PBS の 0.1% (w/v) コラゲナーゼ タイプ IA ソリューションの 50 mL チューブに 2-3 臍帯断片 (約 12-15 g) から。3-4 時間溶解するまで穏やかな揺れで 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>15 分間 300 x g で消化組織を遠心し、上清を吸引します。室温 PBS 1% の 15 mL で消化組織を再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、5 分間 150 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。二回以上洗濯を繰り返します。</li>
	<li>室温 PBS 1% の 15 mL のセルを洗浄再懸濁します P/S、ピペッティングで混ぜる、100 μ m セル ストレーナー付け, 150 x g で 5 分間遠心によるひずみ、上清を吸引します。</li>
	<li>低血糖ダルベッコを混合することによって培養液 (CM) を準備変更イーグル培地 (LG DMEM) ウシ胎児血清 (FBS) と 1 %p/s. 濾過により培地を滅菌します。</li>
	<li>37 ° C に加温 CM の 10 mL で緊張した細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜる、25 cm2培養フラスコに移す、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい変更 CM 文化文化、継代時に 70-80% の合流点に達するまで 3 日おき。</li>
	<li>文化を通路にフラスコから CM を吸引、室温 PBS の 5 mL で 2 回洗浄、3 ml の 5 分の 37 ° C で 0.25% トリプシン/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) のデタッチします。</li>
	<li>トリプシン/EDTA 37.0 ° C に加温 CM の 6 ml を中和する、ピペッティングで混ぜる、150 x g で 5 分間遠心 15 mL チューブに移す、上清を吸引します。CM の 1 mL 中の剥離細胞を再懸濁します、ピペッティングで混ぜます。トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。5,000 セル/cm2で 25 cm2培養フラスコに再シードし、5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい</li>
</ol>2. UCM mscs キトサン膜上で培養した回転楕円体の準備
<ol><li>1% (w/v) キトサン溶液の 100 mL を準備するには、キトサンの 1 g を加えて 99 mL の蒸留水 (dH2O)、および磁性攪拌器でよく混ぜます。</li>
	<li>氷酢酸の 670 μ L を追加し、キトサンを溶解して粘性になるまで混合を続行します。これは通常 3-4 時間がかかります。</li>
	<li>12 ウェル培養プレートの各ウェルにキトサン溶液 500 μ L を追加し、キトサン ソリューションを均等に分散し、すべて底面のカバー プレートを旋回します。</li>
	<li>キトサン コーティング ソリューション平板層流 24 時間一晩カバーなしキャビネットを乾燥させます。一度乾燥、薄膜を形成・ プレートに付着されます。</li>
	<li>各ウェルに 0.5 N 水酸化ナトリウム (NaOH) 溶液の 1 mL を追加してキトサン フィルムを中和し、室温で 2 時間インキュベートします。各ウェルから NaOH を吸引し、それぞれを洗ってよく dH2O の 1 mL で 3 回。それぞれを洗って一度 70% エタノール (エタノール) 1 mL でも。</li>
	<li>キトサン フィルムを殺菌するには、層流れのキャビネットで一晩 70 %etoh それぞれによく、インキュベートの 1 mL を追加します。次の日に各ウェルから残りのエタノールを吸引します。それぞれを洗っても 1 ml 滅菌 PBS の 3 回。キトサン フィルム流カバーなし一晩キャビネットの下紫外光を滅菌します。</li>
	<li>フォームは UCM MSCs の回転楕円体に種子を拡大し 5,000 セル/cm2、各ウェルに、細胞を継代そして 5% CO2 90% の湿度と 37.0 ° c. で孵化させなさい 注: セルは、低酸素症又は治験責任医師の関心に応じて常孵化することができます。</li>
</ol>3 フローサイトメトリー分析表面マーカーの発現
<ol><li>
単一細胞懸濁液の準備
	<ol>
<li>標準プレート<ol>
<li>各ウェルからメディアを削除し、室温 PBS で 2 回洗います。</li>
			<li>室温で 5-10 分の 12 ウェル プレートの各ウェルに、細胞解離試薬の 500 μ L でセルをデタッチします。</li>
			<li>インキュベーション後、染色バッファー (0.5 %bsa を含む PBS) 1 ml を各ウェルに、細胞をデタッチするピペッティングで混ぜます。</li>
			<li>15 mL の円錐管 150 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>キトサン プレート<ol>
<li>先端が 1,000 μ L ピペットを使用して吸引媒体によってすべての回転楕円体を収集します。15 mL の円錐管に集められた媒体。媒体を収集した後、PBS の 1 mL を追加してよく洗うし、同じ 15 mL の円錐管に洗浄 PBS を転送します。</li>
			<li>5 分間 150 x g で回転楕円体を遠心し、上清を除去します。</li>
			<li>細胞解離試薬 (例えばaccutase) を 500 μ l 添加し、室温で 5-10 分の間孵化させなさい。ミックスによるピペット 1 mL 先端まで回転楕円体を切り離して考えるし、表示されなくなります。</li>
			<li>単一細胞懸濁液や 150 x g で 5 分間遠心に染色バッファーの 1 つの mL を追加します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
洗浄のセル
	<ol>
<li>円錐管から上澄みを除去し、再バッファーを染色冷 3 mL のセルを中断します。このステップから氷上実験を通して細胞を保ちます。</li>
		<li>5 分 (洗濯) 300 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>2 回洗います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
セルを汚す
	<ol>
<li>5 分間 300 × g で遠心し、上清を除去します。</li>
		<li>トリパン ブルーと検定を使用して実行可能なセルを数えます。50 μ L ブロックで 1 x 10 の6セルを再停止 (PBS 含む 10% 馬血清) をバッファーし、氷の上で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>10 μ L フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗体 (CD44、CD90, CD105、CD34、主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) クラス II、または各抗体アイソタイプ コントロール) とバッファーを染色の 40 μ L を追加し、氷の上の 1 h の光から保護します。</li>
		<li>染色バッファー冷 3 mL を加えるとミックス、5 分 300 × g で遠心、上清 (洗浄) を吸引します。</li>
		<li>二回洗濯を繰り返します。</li>
		<li>再バッファーを染色の 0.5 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
		<li>7 AAD (生存率色素) の 5 μ L を追加し、氷の上で 30 分間インキュベート</li>
		<li>フローサイト メーターによる細胞染色サンプルを分析します。小さく SSC と FSC によって破片を除外し、7 AAD の吸収性の低い実行可能なセルを識別します。プロット FL1 と FL2 に、y 軸と x 軸、それぞれ。アイソタイプ コントロールを使用すると、対角線上のゲートを作成できます。地域で積極的に陽性細胞の割合を測定します。少なくとも 20,000 イベント/サンプル (補足図 1) をカウントします。</li>
		<li>ゲーティング生菌と自動蛍光抗体染色細胞の割合を測定し、染色のアイソタイプ コントロールのセルの割合を減算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 両側膝蓋腱欠損モデル ラットの
<ol><li>ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g) を選択します。このモデルに使用されるラットの比較的大きいサイズに注意してください。</li>
	<li>麻酔し、誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までマスクを介して配信される 2 L/分 100% 酸素を 8% セボフルラン ラット人工眼の潤滑剤を適用します。</li>
	<li>先制鎮痛としてメロキシカム (1 mg/kg の筋肉内注射を管理します。</li>
	<li>暖かい水で満たされ、皮膚傷害を防ぎながら体の温度と位置を維持するために布で覆われた 2 つの 0.5 L 水ボトル間ネズミを配置します。テーブルにそれぞれの端をテープします。低体温症のリスクを減らすためには、バブルラップ (図 1) と体をカバーします。</li>
	<li>5% セボフルラン 1 L 100% 酸素混合背臥床水加熱パッドの上に動物の鼻の円錐形の連続的な流れで麻酔を維持します。</li>
	<li>皮膚外傷を避けるためには、施術部位を切てはいけない。代わりに、両方の抑圧に除去クリームを適用します。舌圧子を使用して、クリームや髪を削除します。</li>
	<li>クロルヘキシジン酸スクラブで手術部位をスクラブし、3 回を 70% エタノールでリンスします。</li>
	<li>抑圧の craniomedial の側面に、遠位、近位方向に滅菌 #15 メス刃で皮膚を切開します。膝蓋骨のレベルに近位部に約 1 cm の切開を開始し、約 5 mm 脛骨結節の遠位はそれを拡張します。</li>
	<li>#15 メス刃を持つ基になる皮下組織の解放によって膝蓋腱を公開するスキンが反映されます。</li>
	<li>
#15 メス刃を使用して、脛骨粗面に膝蓋骨の遠位面から各膝蓋腱 (1 mm) の中央 3 分の 1 を切除します。
	<ol>
<li>各肢 (図 2) の欠陥のサイズを標準化するためのテンプレートとして腱に対して 0.99 mm 径 Kirschner 金網を合わせます。</li>
		<li>(図 3) の腱の中央部分を分離する #15 メス刃を Kirschner 線の各側に 2 全層切開を作る。近位および遠位罰金アイリスはさみ (図 4) で中央部を切除します。</li>
		<li>膝関節の筋膜を閉じる前に 5.5 で説明したように、適切な治療グループの血栓 (混合細胞懸濁液および ACP) を挿入します。十字パターンと筋膜と皮膚 5-0 polyglactin 910 縫合糸 (図 5) を使って皮のパターンを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>対側の抑圧に手順を繰り返します。 注: 1 つの欠陥は無作為に治療 (キトサン エアコンまたは標準プレート上で培養した幹細胞)。対側の欠陥が内部統制として機能する、空のまま。</li>
	<li>手術後管理エンロフロキサシンの 4 錠 (2 mg/錠、経口投与、1 日 1 回) とメロキシカム錠 (2 mg/錠経口投与、1 日 1 回) を 7 日間。これらの用量は実験動物の獣医師が推奨され、IACUC プロトコルで承認します。</li>
</ol>5. 膝蓋腱欠損内の MSCs の配信
<ol><li>2 L/分 100% 酸素マスクを届け誘導室でピンチからつま先まで反射の消失までに 8% セボフルランを膝蓋腱欠損を作成使用されていない健康なラットを麻酔します。</li>
	<li>収集する 5 mL の血液心臓穿刺によって麻酔 Sprague-dawley ラット (成人男性、4-5 ヶ月、体重 350-375 g)、5 mL シリンジで酸-クエン酸-ブドウ糖 (5:1 v/v) 1 mL を含む 20 G 針で。</li>
	<li>ペントバルビ タール (100 mg/kg)、同じ麻酔中の intracardial 注入による心臓穿刺・採血後のラットを安楽死させます。</li>
	<li>室温で 15 分間 350 x g でサンプルを遠心します。上清を転送し、使用するまで-20 ° C で因数 (各 120 μ L) を格納します。</li>
	<li>体内注入の直前に上記の因数を解凍しミックス 0.5 x 10 と 20 μ L6 MSCs (1.9 または 3.1.2.1) からトリプシン/EDTA を用いた標準的な板から分離または (PBS/中) とフラッシュしてキトサン プレートから収集します。</li>
	<li>解凍プラズマ プラズマをアクティブにし、血栓の形成を誘導する 96 ウェル プレートのウェル内の残りの 100 μ L に 10% 塩化カルシウム (CaCl2) の 6 μ L を追加 (エアコン プラズマをアクティブ化: ACP)。</li>
	<li>細胞懸濁液 (20 μ L) をミックスし、ACP (100 μ L) (図 6) 血栓を形成します。膝関節の筋膜を閉じる前に作成した膝蓋腱欠損内血栓を配置 (4.10.3 の手順を参照してください)。</li>
</ol>6. 機能的予後
<ol><li>ラットのラット顔をしかめるスケール (RGS)37,38に基づいて、着床に腫れ、痛みの兆候を 1 日 2 回を監視します。 注: スコアリング システム (0-6) (0-3) サポート前肢と後肢の時間立っているを含む 3 の活動に基づく歩行の機能を評価するため開発された、時間自力で後肢に立って (0-2) と 17 cm プラスチック製ケージの壁 (0-1) (を登る能力表 1)。</li>
	<li>朝と夕方には平均スコアを計算する各時点のラットの 2 つの後肢に立って活動を評価します。</li>
	<li>ラット正常に登頂両後肢と 17 cm プラスチック製ケージの壁を登る能力を評価します。</li>
</ol>7. 総外観と膝蓋腱の病理組織学
<ol><li>(炎症の評価) に 7 日目にラットを安楽死させるか (組織の治癒を評価) に 28 日の投稿 (100 mg/kg) ペントバルビ タール麻酔 8% セボフルランと 2 L 100% 酸素マスクを介して配信の intracardial 注射治療。</li>
	<li>安楽死した後膝蓋腱-脛骨結節台メスとはさみを収穫します。軟部組織や靭帯膝蓋腱を除いて、抑圧の周りを削除します。</li>
	<li>外見と (図 7) 腱の肥厚のため検体を調べる。</li>
	<li>腱の近位部と外側面に 5.0 Polydioxanone の外科医の結び目を置くことによって試料に合わせます。10% 中性緩衝ホルマリン液で検体を修正し、各腱の中間部分から横断 (5 μ m) を取得します。</li>
	<li>ヘマトキシリンとエオシン、次の標準的なプロトコルを染色、マッソンの Trichrome を使用してセクションを染色します。</li>
	<li>炎症などの病理学的変化と同様、欠陥、内血腫の存在を検出するセクションを確認します。</li>
	<li>コラーゲン生、血管新生、および軟骨形成 (表 2)39度に基づいて、以前に発行されたスコアリング システムを使用してセクションの組織学的スコアを評価します。</li>
</ol>

著者はある利益相反を開示します。

馬のセルは、最終的に馬の自然な伸張の管理の候補者のアプローチをテストしていきますのでこのプロジェクトに選ばれました。確かに、馬の腱損傷は浅指屈筋と人間41アキレス腱の生物学的類似性のため男で寛解の自然なモデルとして訴えています。細胞表面マーカー CD44、CD90, CD105、CD34 と MHC II は、細胞、細胞療法42国際社会によって推薦の基準に従っ?...

腱損傷は、種1にわたって大幅に痛みや筋肉萎縮の最も一般的な原因の 1 つです。獣医学で腱と靱帯損傷は、馬に特別な関心の競走馬のすべての傷害の 82% を含む筋骨格系とそれらの 46% の腱や靭帯の2,3に影響を与えます。瘢痕形成が癒される腱の力学的特性に影響を与えるし、屈筋腱の傷害後運動の使用へのリターンに守られた予後を説明します再傷害は最大で 2 年以内発生パワードップラーを馬の 67%4。再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。自家幹細胞療法はいくつかの励みになる結果5,6を生産しているが、組織の採取、細胞の処理/リプログラミングによる遅延管理の影響に関連する罹患率によって制限されます、幹の特性に (年齢) などの患者さんの健康状態は、7、8 を細胞します。これらの制限は、既製の代替として同種幹細胞を調査するための理論的根拠を提供します。胎児の付属器由来の細胞は、倫理的な問題および胚性幹細胞に関連する奇形腫形成の危険性を回避するために魅力的な候補です。胎児の付属器の中で臍帯マトリックス (UCM)、Wharton のゼリーとも呼ばれますが豊富、集めやすいです。
細胞ソースに関係なく幹細胞性を高めることは同種の再生医療細胞バンクの確立に不可欠です。機能的観点から自己複製と多系統分化9の可能性として幹細胞性を定義できます。幹細胞性の証拠は、アッセイ、遺伝子マーカー Oct4、 Sox2, Nanog9の式と一緒に増殖と分化に依存します。幹細胞性を強化する方法の 1 つは、void のフィラーと UCM MSCs の増殖・分化を高めるキャリアとして機能する生体材料の使用に依存します。このアプローチは、多能性細胞に成熟した細胞を再プログラムする転写因子の操作に関する懸念を排除できます。生体幹細胞の潜在的なキャリアとして考慮される間、キトサンは生体適合性と分解性10魅力的です。この天然アミノ多糖類は、主に上位製貝10品として得られる 2 番目の最も豊富な天然多糖類キチン質のアルカリ脱アセチル化によって形成されます。以前 MSCs とキトサン足場間の相互作用を調査して回転楕円体11,12,13,14,15,の形成の観察16. 我々 はまたキトサン行列12,13,14,15,16,17、軟骨分化の優位性を報告 18。最近では、2 つの独立した研究は、脂肪組織によってスフェロイド形成を説明および胎盤組織由来キトサン フィルム19,20上で培養した MSCs。回転楕円体のこの形成だけでなく、幹細胞性を強化、また生体内注入20後幹細胞の保存を改善しました。
有病率と罹患率の種にわたって寛解の伸張の病態を検討して幹細胞注射など新しい治療法をテストする実験モデルの開発を求めています。馬、コラゲナーゼによる腱鞘炎は腱修復21で MSCs を使用して有効性を発揮する一般的なモデルです。注射は急性炎症性変化を引き起こすので、このアプローチの妥当性は限られている、臨床の伸張は通常慢性の結果に対し22,23ストレスを掛けすぎています。さらに、腱の疾患の化学的誘導は治癒反応を誘発して症例22,23に障害の治癒過程をレプリケートしません。浅指屈筋腱の部分の切除は、馬24で腱鞘炎の手術モデルとして記載されています。最近では、低侵襲アプローチは、浅指屈筋腱25の中核への外傷性の損傷を制限する使用されました。手術モデルは自然な腱の病気につながる可能性があります、25を作成された損傷の範囲内の再現性に欠けがち疲労機構をシミュレートしません。モデル, 罹患率と腱の馬のモデルに関連付けられているコストに関係なく病気は体内の新規治療法の評価のための最初のステップとして齧歯動物モデルに関心を正当化するための制限です。
齧歯動物の実験モデルの主な利点の 1 つは、費用と個体間変動を制御する能力で構成されています。齧歯動物は、その急速な成長率により様々 な生理的要因に関して標準化することができますおよび短い寿命のスパンの変化の源を制限して、その違いを検出するために必要な動物の数を減らします。齧歯動物の腱疾患を誘導する戦略は、化学的誘導部分の腱欠陥21の外科的創造にもに依存しています。手術モデルの化学モデルをより自然な伸張をシミュレートすることが、高い罹患率と損傷した腱の壊滅的な障害につながることができます。その点、ラットだこれらのモデルのマウスよりもより良い候補者のサイズは、組織の治癒の評価を促進することにより、大規模な欠陥を作成できます。ラットは、4 つの主要な腱グループの伸張の実験的研究で使用されている: 腱、屈筋、アキレス、膝蓋腱26。これらのうち、膝蓋腱を含むモデルは、この腱の大きなサイズと27それへのアクセスの容易さのため特に魅力的です。膝蓋腱が脛骨粗面に大腿四頭筋をアタッチします。この伸筋機構内膝蓋骨は、大腿四頭筋の操作を指示し、膝蓋腱の近位の範囲を区別する種子骨です。膝蓋腱の近位と遠位の範囲で骨アンカーの存在生体力学的テストが容易になります。通常膝蓋腱を含むモデルは、コントロール28,29として対側そのまま腱の片側手術の欠陥に依存します。最も一般的な膝蓋腱欠損モデルは、対側の膝蓋腱がそのまままま、脛骨粗面の挿入に膝蓋骨の遠位の頂点から膝蓋腱の中央部分 (幅 1 mm) を切除します。組織、非破壊力学的試験や生体力学的障害、超音波画像診断、 ex vivo蛍光イメージング、肉眼観察および機能テスト28,30 をテスト結果の措置が含まれています。 ,31。一方的なモデルは提案された治療と同じ動物内で同様の負傷の保守的な管理とを比較できないようにします。同様に、いくつかの治療の比較では、別の動物が必要です。二国間のモデルは個体間変動を取り除き、32の研究に必要な動物の数を減らすでしょう。しかし、二国間の傷害の罹患率を高める可能性があり、二国間跛行の治療評価を妨げる可能性が。簡単にいくつかの研究のレポート モデル33,34の罹患率・周術期管理ではなく、治療の効果に関する両側膝蓋腱欠損ラットがフォーカスの使用。
この研究の長期的な目標は、UCM MSCs 宛ての同種移植の幹細胞性と生体内での生存率を改善するための戦略を開発することです。この目標を達成するために最近キトサン フィルムと35低酸素環境下での培養でスフェロイドの形成による UCM MSCs の改良された幹細胞性を報告した.これらの体外プロパティ エアコン UCM と扱われる膝蓋腱欠損の改善された生体力学的特性と関連していた-MSCs これらの結果に基づいて、ラット両側膝蓋腱欠損モデルが候補者をテストするには適しているようだ。腱の傷害の36のトリートメント。研究の目的は、分離とキャラクタリゼーション UCM MSCs の幹細胞、作成と両側膝蓋骨腱障害、手術後の治療のための生物学的デリバリー システムの準備のための詳しいプロトコルを提供するためにはここで報告回復と組織欠陥の中に癒しの評価。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PBS 10X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30258.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IA</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30021.FS</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100X</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.25%</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>AT104</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30084.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitosan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3646</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30574.01</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>149591A</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1082F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA47FT</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA1085F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>AbD serotec</td>
			<td>MCA928F</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab11415</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab91356</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB560942</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB555748</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD</td>
			<td>BDB559925</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacutainer 5ml</td>
			<td>Med Vet International</td>
			<td>RED5.0</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-citrate-dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3821</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sevoflurane</td>
			<td>JD Medical</td>
			<td>60307-320-25</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain code: 400</td>
			<td>Experimental animal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat surgical kit</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>728942</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blade #15</td>
			<td>MEDLINE</td>
			<td>MDS15115</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat MD&#39;s Baytril (2 mg/Tablet), 
			Rimadyl (2 mg/Tablet)</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>F06801</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyglactin 910, 5-0</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>J436G</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin alchol shandon</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>6766007</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>143907</td>
			<td>Consumable</td>
		</tr>
	</tbody>
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evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

再生医療は、伝統的な治療法に挑戦する条件に新しい選択肢を提供します。有病率と罹患率、生物種間の寛解のこの組織の限られた癒しのプロパティと組み合わせて細胞療法に関する検索を求め、その有効性を検討するための実験モデルの開発を推進します。臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞 (UCM MSC) は、豊富な簡単に収集、倫理的な問題と奇形腫形成の危険性回避まだ原始胚性幹細胞をもっと密接に類似している魅力的な候補者よりも大人の組織由来の MSCs。 重要な関心は、スフェロイドの形成を通じて MSCs のプロパティを強化する戦略としてキトサンを重視しています。UCM-MSCs を分離するこの紙詳細テクニックはキトサン フィルムの回転楕円体を準備し、表面マーカー式回転楕円体形成の効果を分析します。その結果、キトサン膜上に形成した UCM MSC 回転楕円体の体内注入のラットの両側膝蓋腱損傷モデルの作成を説明します。合併症を認めなかった罹患率に関して研究、ストレス上昇の効果、または組織感染症。7 日手術群の合計機能スコアは正常ラットよりも低かったが、手術後 28 日以内に正常に返されます。組織の治癒の組織学的スコアは、異物反応と 28 日で治癒の進行がないこと 7 日間に評価処理の欠陥で血栓の存在を確認しました。この両側膝蓋腱欠損モデルが許容可能な罹患率に関連付けられているは、未処理の腱とトリートメントの違いの検出を許可各ラットにおける内部統制の作成による個体間変動を制御します。

現在の研究では、平均 ± SD (標準偏差) に結果が表示されます。セルは 6 馬のへその緒から隔離され標準またはキトサンのエアコンの下で各細胞の表面マーカーを表現する分離細胞の割合を比較したフリードマン検定との非パラメトリック解析の分散として繰り返し対策。腱欠損モデル作成用 7 日術後評価 8 ラットを用い、12 ラット 28 日間評価のため使用されました?...

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Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

ラットの両側膝蓋腱損傷モデルの幹細胞療法の評価

準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2 処置間テスト許容罹患率に関連付けられていた。

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

evaluation-stem-cell-therapies-bilateral-patellar-tendon-injury-model

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K ビュー.  Western University of Health Sciences. 準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2 処置間テスト許容罹患率に関連付けられていた。

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

のマウスモデル子宮内で移植

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

医学

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is described to obtain a consistent model of severe SCI. Use of a stereotactic frame and computer controlled impactor allows for creation of reproducible injury. Hypothermia and urinary tract infection pose significant challenges in the post-operative period. Careful monitoring of animals with daily weight recording and bladder expression allows for early detection of post-operative complications. The functional results of this contusion model are equivalent to transection models. The contusion model can be utilized to evaluate the efficacy of both neuroprotective and neuroregenerative approaches.

A contusion model of severe spinal cord injury is described. Detailed pre-operative, operative and post-operative steps are described to obtain a consistent model.

ラットにおける重度の脊髄損傷挫傷モデル

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter connected to a radio transmitter into the femoral artery of rats that underwent a T4 spinal cord transection with or without grafting of embryonic brainstem-derived neural stem cells expressing green fluorescent protein. Compared to other methods such as cannula insertion or tail-cuff, telemetry is advantageous to continuously monitor blood pressure and heart rate in freely moving animals. It is also capable of long term multiple data acquisitions. In spinal cord injured rats, basal cardiovascular data under unrestrained condition and autonomic dysreflexia in response to colorectal distension were successfully recorded. In addition, cardiovascular parameters before and after SCI can be compared in the same rat if a transmitter is implanted before a spinal cord transection. One limitation of the described telemetry procedure is that implantation in the femoral artery may influence the blood supply to the ipsilateral hindlimb.

We present a protocol for using a radio-telemetric system to record cardiovascular parameters in T4 spinal cord transected rats eight weeks after embryonic brainstem neural stem cell grafting into the lesion site. Telemetry is an advanced technique to accurately evaluate cardiovascular function in conscious freely moving spinal cord injured rats.

ラジオ遠隔測定システムは、脊髄離断および胚性神経細胞移植片幹ラットの心臓血管機能を監視する

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can be used both to investigate the biological responses to injury and to test potential therapies. Contusion or compression injury delivered to the surgically exposed spinal cord are the most widely used models of the pathology. In this report the experimental contusion is performed by using the Infinite Horizon (IH) Impactor device, which allows the creation of a reproducible injury animal model through definition of specific injury parameters. Stem cell transplantation is commonly considered a potentially useful strategy for curing this debilitating condition. Numerous studies have evaluated the effects of transplanting a variety of stem cells. Here we demonstrate an adapted method for spinal cord injury followed by tail vein injection of cells in CD1 mice. In short, we provide procedures for: i) cell labeling with a vital tracer, ii) pre-operative care of mice, iii) execution of a contusive spinal cord injury, and iv) intravenous administration of post mortem neural precursors. This contusion model can be utilized to evaluate the efficacy and safety of stem cell transplantation in a regenerative medicine approach.

Spinal cord injury is a traumatic condition that causes severe morbidity and high mortality. In this work we describe in detail a contusion model of spinal cord injury in mice followed by a transplantation of neural stem cells.

脊髄損傷の実験的挫傷モデルにおける神経幹細胞移植

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.

Evaluation of the Efficacy of the H. pylori Protein HP-NAP as a Therapeutic Tool for Treatment of Bladder Cancer in an Orthotopic Murine Model

Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.

の有効性の評価<em&gt; H。ピロリ</em同所性マウスモデルにおける膀胱癌の治療のための治療ツールとして&gt;タンパク質HP-NAP

Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is the gold ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal cord. A major current area of research is focused on the mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous or induced functional recovery following SCI. Spontaneous functional recovery is reported to be greater early in life, raising interesting questions about how adaptive plasticity changes as the spinal cord develops. To facilitate investigation of this dynamic, we have developed a SCI model in the neonatal mouse. The model has relevance for pediatric SCI, which is too little studied. Because neural plasticity in the adult involves some of the same mechanisms as neural plasticity in early life1, this model may potentially have some relevance also for adult SCI. Here we describe the entire procedure for generating a reproducible spinal cord compression (SCC) injury in the neonatal mouse as early as postnatal (P) day 1. SCC is achieved by performing a laminectomy at a given spinal level (here described at thoracic levels 9-11) and then using a modified Yasargil aneurysm mini-clip to rapidly compress and decompress the spinal cord. As previously described, the injured neonatal mice can be tested for behavioral deficits or sacrificed for ex vivo physiological analysis of synaptic connectivity using electrophysiological and high-throughput optical recording techniques1. Earlier and ongoing studies using behavioral and physiological assessment have demonstrated a dramatic, acute impairment of hindlimb motility followed by a complete functional recovery within 2 weeks, and the first evidence of changes in functional circuitry at the level of identified descending synaptic connections1.

This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.

新生児マウス脊髄圧縮損傷モデル

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers and general hand function. Injuries to the FTs are common, and satisfactory healing is often impaired due to excess scar tissue and adhesions between the tendon and surrounding tissue. However, little is known about the molecular and cellular components of FT repair. To that end, a murine model of FT repair that recapitulates many aspects of healing in humans, including impaired range of motion and decreased mechanical properties, has been developed and previously described. Here an in-depth demonstration of this surgical procedure is provided, involving transection and subsequent repair of the flexor digitorum longus (FDL) tendon in the murine hind paw.&#160;This technique can be used to conduct lineage analysis of different cell types, assess the effects of gene gain or loss-of-function, and to test the efficacy of pharmacological interventions in the healing process. However, there are two primary limitations to this model: i) the FDL tendon in the mid-portion of the murine hind paw, where the transection and repair occur, is not surrounded by a synovial sheath. Therefore this model does not account for the potential contribution of the sheath to the scar formation process. ii) To protect the integrity of the repair site, the FT is released at the myotendinous junction, decreasing the mechanical forces of the tendon, likely contributing to increased scar formation. Isolation of sufficient cells from the granulation tissue of the FT during the healing process for flow cytometric analysis has proved challenging; cytology centrifugation to concentrate these cells is an alternate method used, and allows for generation of cell preparations on which immunofluorescent labeling can be performed. With this method, quantification of cells or proteins of interest during FT healing becomes possible.

Flexor tendons in the hand are commonly injured, leading to impaired hand function. However, the scar-tissue healing response is not well characterized. A murine model of flexor tendon healing is demonstrated here. This model can enhance overall understanding of the healing process and assess therapeutic approaches to improve healing.

マウス屈筋腱損傷および修復手術

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine balloon denudation model, which is comparable with established vessel injury models in large animals. The aorta denudation model with balloon catheters mimics the clinical setting and leads to comparable pathobiological and physiological changes. Briefly, after performing a horizontal incision in the aorta abdominalis, a balloon catheter will be inserted into the vessel, inflated, and introduced retrogradely. Inflation of the balloon will lead to intima injury and overdistension of the vessel. After removing the catheter, the aortic incision will be closed with single stiches. The model shown in this article is reproducible, easy to perform, and can be established quickly and reliably. It is especially suitable for evaluating expensive experimental therapeutic agents, which can be applied in an economical fashion. By using different knockout-mouse strains, the impact of different genes on MH development can be assessed.

This article demonstrates a murine model to study the development of myointimal hyperplasia (MH) after aortic balloon injury.

マウスの腹部大動脈 Myointimal 過形成を誘導するために気球を利用した傷害

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

ラットにおける心筋虚血再灌流後の冠動脈流量の評価

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...