저자는 데이터의 그녀의 통계 분석에 대 한 수, 박사, 인정 하 고 싶습니다. 저자는 또한에 대 한 그녀의 조언을 마 취 박사 McClure, DVM, 박사 DACLAM, 감사 하 고 통증 관리 프로토콜 연구에 사용. 이 프로젝트는 연구 (12678v)와 USDA 섹션 1433 자금 (2090) 부사장의 웨스턴 대학 보건 과학 사무실에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 웨스턴 대학 보건 과학에 의해 승인 되었습니다.
1. 격리와 말 탯 매트릭스에서 MSCs의 확장
<ol><li>태 반 (임신) 성인 마 레에서 foaling 관찰 후을 aseptically 탯 태에서 분리 합니다. 탯에에서 계속 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 1% 페니실린-스 (P/S)와 4 ° C에서 전송 하는 동안 처리까지.</li>
	<li>실내 온도 PBS 1%로 두 번 탯 워시 50ml 튜브에 P/S. 150 m m와 1 %P / S 50 mL 튜브 2 또는 세 번까지 혈액의 대부분은 밖으로 씻어 서 실내 온도 PBS에 세척에 2 인치 길이의 조각으로 탯 섹션.</li>
	<li>잘라 배를 경도 탯. 2 동맥, 정 맥, 그리고 집게와가 위를 사용 하 여 코드에서 allantoic 줄기를 포함 하 여, 혈관을 제거. 메스로 근 근 의해 150 mm 접시에 젤리 같은 매트릭스 주변 혈관은 탯 매트릭스 (왓슨의 젤리)를 수집 하 고 정밀한 조각으로 젤리를 말하다.</li>
	<li>PBS에서 0.1% (w/v) 콜라 유형 IA 솔루션의 15 mL 50 mL 튜브에 2-3 탯 조각 (약 12-15 g)에서 장소와 튼 젤리 해산 때까지 3-4 h 동안 부드러운 흔들어 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>15 분 동안 300 x g에서 소화 조직 원심 하 고 상쾌한 발음. 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 소화 조직 resuspend P/S, pipetting으로 혼합, 5 분 동안 150 x g에서 원심 및 상쾌한 (세척)을 발음. 세척 두 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>Resuspend 셀 1% 실내 온도 PBS의 15 mL에 세차 P/S, pipetting으로 혼합, 100 µ m 셀 스 트레이너, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기와에 의해 변형 및 상쾌한 발음.</li>
	<li>낮은 포도 당 Dulbecco의 혼합 하 여 배양 (CM) 준비 소 태아 혈 청 (FBS)와 1 %P 수정이 글의 중간 (LG-DMEM) / 미 여과 의해 매체를 소독.</li>
	<li>37 ° C에 미리 데워 CM의 10 mL에 긴장된 셀 resuspend, pipetting으로 혼합, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 전송 및 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 변경 c M 매 3 일 마다 문화 문화 passaged 것 이다 때 70-80%의 합류를 도달할 때까지.</li>
	<li>문화 통로를 플라스 크에서 CM을 발음 하 고 두 번, 실내 온도 PBS의 5 mL로 세척 하 고 0.25 %trypsin / ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 5 분 동안 37 ° C에서의 3 mL와 분리.</li>
	<li>트립 신/EDTA 37.0 ° C에 미리 데워 CM의 6 mL로 중화 하 고, pipetting으로 혼합 하 고 15 mL 튜브, 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 한 상쾌한 발음. Resuspend CM의 1 mL에 분리 된 셀, pipetting으로. Trypan 블루과 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 5, 000 셀/cm2, 25 cm2 조직 배양 플라스 크에 다시 시드해야 하 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어</li>
</ol>2. 키토 산 영화에 교양 UCM MSCs와 Spheroids의 준비
<ol><li>1% (w/v) 키토 산 용액 100 mL를 준비 하려면 99 ml의 증류수 (dH2O), 키토 산의 1 g을 추가 하 고는 자력으로 잘 혼합 합니다.</li>
	<li>빙 초 산의 670 µ L을 추가 하 고 혼합 키토 산 녹이 고 점성 된다 때까지 계속. 이 일반적으로 3-4 시간 걸립니다.</li>
	<li>12 음 조직 배양 플레이트의 각 음에 키토 산 솔루션의 500 µ L을 추가 하 고 접시 키토 산 솔루션을 균등 하 게 배포 하 고 모든 바닥 표면에 소용돌이.</li>
	<li>층 류 24 h에 대 한 하룻밤 커버 없이 캐비닛에서 키토 산 코팅 솔루션 접시 건조. 건조 되 면, 박막 형성 하 격판덮개를 준수 합니다.</li>
	<li>각 우물에 0.5 N 수산화 나트륨 (NaOH) 용액 1 mL를 추가 하 여 키토 산 영화를 중화 하 고 실 온에서 2 h에 품 어. 각 우물에서 NaOH를 발음 하 고 각각을 씻어 세 번 dH2O의 1 mL와 함께 잘. 각 세척 한 번 70% 에탄올 (EtOH)의 1 mL와 함께 잘.</li>
	<li>키토 산 영화를 소독, 층 류 캐비닛에 70 %EtOH 각 잘하고 품 어의 1 mL을 하룻밤 추가 합니다. 다음 날에 각 우물에서 나머지 EtOH를 발음. 각 세척 살 균 PBS의 1 mL 세 번 잘. 키토 산 필름 층 류 커버 없이 하룻밤 캐비닛 아래 자외선으로 소독.</li>
	<li>UCM MSCs의 양식 spheroids, 씨앗 확장 5000 셀/cm2, 각 잘으로 셀 passaged 고 습도 90%와 37.0 ° C에서 5% CO2 에서 품 어 참고: 셀 수 있는 알을 품을 산소 또는 normoxia, 탐정의 관심에 따라.</li>
</ol>3. 표면 마커 Cytometry 통해 분석의 표현
<ol><li>
단일 세포 현 탁 액의 준비
	<ol>
<li>표준 플레이트<ol>
<li>각 우물에서 매체를 제거 하 고 실내 온도 PBS로 두번 세척.</li>
			<li>실 온에서 5-10 분에 대 한 12-잘 접시의 각 음에 셀 분리 시 약의 500 µ L로 세포를 분리 합니다.</li>
			<li>부 화, 후 각 우물에 버퍼 (PBS 0.5 %BSA 포함) 얼룩의 1 ml을 추가 하 고 셀을 분리를 pipetting으로 혼합.</li>
			<li>세포 현 탁 액 15 mL 원뿔 튜브와 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 전송 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>키토 산 판<ol>
<li>모든 spheroids는 피 펫을 사용 하 여 1000 µ L 팁 발음 매체에 의해 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브에 수집 된 매체를 전송. 매체를 수집, 후 1 mL PBS의 추가 의해 잘 세척 하 고 동일한 15 mL 원뿔 튜브에 씻어 PBS를 전송 합니다.</li>
			<li>5 분 동안 150 x g에서 spheroids 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
			<li>셀 분리 시 약 (예, accutase)의 500 µ L을 추가 하 고 실 온에서 5-10 분 동안 품 어. Pipetting을 사용 하 여 1 mL 팁 spheroids 해리는 더 이상 표시 될 때까지 혼합.</li>
			<li>단일 셀 펜션과 5 분 동안 150 x g에서 원심 분리기로 얼룩 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀을 세척
	<ol>
<li>상쾌한 원뿔 튜브에서 제거 하 고 다시 감기 버퍼 얼룩의 3 mL에 셀을 일시 중단. 이 단계에서 실험을 통해 아이스 셀을 계속.</li>
		<li>5 분 (세척)에 대 한 300 x g에서 원심.</li>
		<li>두 번 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포를 얼룩이 지기
	<ol>
<li>5 분 x 300g에 centrifuge 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>Trypan 블루와 hemocytometer를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 다시 일시 중단 1 x 106 셀 50 µ L 차단 (PBS 포함 10% 말 혈 청)를 버퍼링 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어.</li>
		<li>얼음에 1 시간에 대 한 빛에서 보호 품 어 다음 10 µ L fluorescein isothiocyanate (FITC) 활용 된 항 체 (CD44, CD90, CD105, CD34, 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 II, 또는 각 항 체 isotype 제어) 및 버퍼, 얼룩의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>감기 버퍼 얼룩의 3 개 mL를 추가 하 고 혼합, 5 분, 300 x g에서 원심 상쾌한 (세척)을 발음.</li>
		<li>두 번 세척을 반복 합니다.</li>
		<li>다시 버퍼를 얼룩이 지기의 0.5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단</li>
		<li>7-AAD (생존 염료)의 5 µ L을 추가 하 고 얼음에 30 분 동안 품 어</li>
		<li>교류 cytometer에 의해 스테인드 세포 샘플을 분석 합니다. 그들의 작은 SSC와 FSC, 파편을 제외 하 고 7-AAD의 낮은 통풍 관으로 가능한 셀을 식별 합니다. 플롯 FL1 및 FL2에는 y와 x-축, 각각. Isotype 제어를 사용 하 여 대각선 위에 게이트를 만들. 지역에 있는 긍정적으로 얼룩진된 세포의 백분율을 측정 합니다. 적어도 20000 이벤트/샘플 (보충 그림 1)을 계산 합니다.</li>
		<li>실행 가능한 셀 및 자동-형광, 게이팅 하 여 항 체로 얼룩진 셀의 비율 측정 하 고 세포 isotype 제어와 스테인드의 백분율을 뺍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 쥐에서
<ol><li>Sprague Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)을 선택 합니다. 이 모델에 사용 하는 쥐의 비교적 큰 크기 note</li>
	<li>Anesthetize 고 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 쥐 핀치 발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 인공 눈 윤활제를 적용 합니다.</li>
	<li>선제 무 통으로 Meloxicam (1 mg/kg)의 근육 주사를 관리 합니다.</li>
	<li>따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 두 0.5 L 물 병 사이 쥐를 놓습니다. 테이블에 각 말단을 테이프. 저체온증의 위험을 줄이기 위해 버블 랩 (그림 1)와 함께 시체를 커버.</li>
	<li>마 취 5 %sevoflurane 원뿔, 물 난방 패드에 지 recumbency에 동물을 통해 1 L 100% 산소 혼합물에의 지속적인 흐름을 유지 합니다.</li>
	<li>피부 외상을 방지 하려면 수술 사이트를 클립 하지 않습니다. 대신, 두 stifles 이상 머리 제거 크림을 적용 합니다. 혀 억압 물을 사용 하 여 크림 및 머리 제거.</li>
	<li>수술 부위의 액체 digluconate 스크럽, 스크럽 하 고 3 번 70% 에탄올으로 씻어.</li>
	<li>피부는 억압의 craniomedial 측면에 인접 하 원심 방향에서 살 균 #15 메스 블레이드와 incise. 약 1 cm 수준, 슬 개 골의 근 위 절 개를 시작 하 고 약 5 mm tibial 결 절에 원심 확장.</li>
	<li>#15 메스 블레이드와 기본 피하 조직을 확보 하 여 슬 개 골 힘 줄 노출에 피부를 반영 합니다.</li>
	<li>
#15 메스 블레이드를 사용 하 여 소비 세 각 슬 개 골 힘 줄 (1 m m)의 중앙 세 번째 슬 개 골의 원심 부분에서 tibial tuberosity에.
	<ol>
<li>각 사지 (그림 2)에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대해 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어를 맞춥니다.</li>
		<li>힘 줄 (그림 3)의 중앙 부분을 #15 메스 블레이드와 Kirschner 와이어의 각 측에 2 전체 두께 절 개를 확인 합니다. 정밀한 아이리스가 위 (그림 4)와 함께 중앙 섹션 proximally 고 distally resect.</li>
		<li>억압의 근 막을 닫기 전에 5.5에 설명 된 대로 적절 한 치료 그룹에 대 한 응고 (혼합된 셀 펜션과 ACP)를 삽입 합니다. 십자 패턴으로 근 막과 피부 패턴 5-0 polyglactin 910 봉합 (그림 5)를 사용 하 여 피부를 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contralateral 억압에서 절차를 반복 합니다. 참고: 하나의 결함 치료 (줄기 세포 chitosan에 조건 또는 표준 접시에 배양) 무작위로 할당 됩니다. Contralateral 결함은 내부 통제 역할을 빈 남아 있습니다.</li>
	<li>수술 후 관리 enrofloxacin의 4 정제 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) meloxicam의 태블릿 (2 mg/태블릿, 구두, 하루에 한 번씩) 7 일 동안. 이 복용량 실험 동물 수 의사에 의해 권장 되었고 IACUC 프로토콜에 승인.</li>
</ol>5. 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 MSCs의 배달
<ol><li>핀치-발가락 반사 유도 실에서의 실종까지 마스크를 통해 전달 하는 2 L/분 100% 산소에서 8 %sevoflurane 슬 개 골 힘 줄 결함 생성에 사용 되지 않는 건강 한 쥐 anesthetize</li>
	<li>수집 5 mL 혈액 심장 펑크에 의해 마 취 Sprague-Dawley 쥐 (성인 남성, 4-5 개월, 몸 무게 350-375 g)에서 5 mL 주사기에 산 시트르산 포도 당 (5:1 v/v)의 1 mL를 포함 하는 20 G 바늘.</li>
	<li>Pentobarbital (100 mg/kg), 같은 마 취에서의 intracardial 주입 하 여 심장 펑크와 혈액 수집 후 쥐를 안락사.</li>
	<li>실 온에서 15 분 동안 350 x g에서 샘플 원심 상쾌한 전송 및 사용까지 aliquots (120 µ L 각)-20 ° C에서 저장.</li>
	<li>생체 내에 이식 직전 위의 약 수를 녹여 섞어 0.5 x 10와 20 µ L 트립 신/EDTA를 사용 하 여 표준 격판덮개에서 분리 (1.9 또는 3.1.2.1)에서6 MSCs 또는 (PBS/매체)와 홍 조에 의해 키토 산 판에서 수집.</li>
	<li>해 동된 플라즈마는 플라즈마를 활성화 하 고 혈전의 형성을 유발 하 96 잘 접시의 우물에서의 나머지 100 µ L를 6 µ L 10% 칼슘 염화 물 (CaCl2)의 추가 (바른된 플라즈마 활성화: ACP).</li>
	<li>세포 현 탁 액 (20 µ L) 혼합 및 ACP (100 µ L) 형태로 응고 (그림 6). 장소는 억압의 근 막 닫기 전에 만든 슬 개 골 힘 줄 결함 내에서 응고 (단계 4.10.3 참조).</li>
</ol>6. 기능적 결과
<ol><li>통증, 쥐 얼굴을 찡 그리기 규모 (RGS)37,38 에 기반 하 고 이식 사이트 위에 붓기의 표시를 위해 하루에 두 번 쥐를 모니터링 합니다. 참고: 채 점 시스템 (0-6) 보 행 기능 지원 앞 발 타임된 뒷 다리 서 포함 하 여 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) (등반 능력을 초과 표 1)입니다.</li>
	<li>아침에 각 시간 점의 평균 점수를 계산 하기 위해 저녁에 2 개의 뒷 다리 서 활동에 대 한 쥐를 평가.</li>
	<li>성공적으로 도달 상단 두 뒷 다리 사지와 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능에 대 한 쥐를 평가 합니다.</li>
</ol>7. 총 모양 및 슬 개 골 힘 줄의 Histopathology
<ol><li>7 일 (염증 평가)에 쥐를 안락사 또는 (평가 조직 치유)을 28 일 pentobarbital 8 %sevoflurane 2 L 100% 산소 마스크를 통해 전달 마 취 (100 mg/kg)의 intracardial 주입 하 여 치료를 게시.</li>
	<li>안락사 후 슬 개 골-힘 줄-경골 tuberosity 단위 메스와가 위를 걷. 부드러운 조직 및 슬 개 골 힘 줄 제외한 억압, 주위 인 대를 제거 합니다.</li>
	<li>총 모양 및 힘 줄 (그림 7)의 농축에 대 한 각 견본을 검사 합니다.</li>
	<li>힘 줄의 인접 하 고 측면 측면에 5.0 Polydioxanone의 외과 의사 매듭을 배치 하 여 표본 동양. 각 표본 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 용액에 고정 하 고 각 힘 줄의 중간 부분에서 가로 섹션 (5 µ m).</li>
	<li>되며 고 오신, Masson의 Trichrome 표준 프로토콜에 따라 얼룩을 사용 하 여 섹션을 얼룩.</li>
	<li>염증 등 병 적인 변화 뿐 아니라 결함, 내 혈의 존재를 감지 하는 섹션을 검사 합니다.</li>
	<li>콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (표 2)39의 정도에 따라 이전 게시 된 채 점 시스템을 사용 하 여 섹션의 조직학 점수를 평가 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

우리 결국 말에 자연 tendinopathies의 관리에서 후보 접근을 테스트 하는 것 때문에 말 셀이이 프로젝트에 대 한 선정 됐다. 실제로, 말에 힘 줄 부상 있습니다 말 표면 디지털 flexor 및 인간41킬 사이 생물 학적 유사성 때문에 자연 모델 남자에서 tendinopathy의 매력. 세포 표면 마커 CD44, CD90, CD105, CD34와 MHC II immunophenotyping 세포 치료42에 대 한 국제 학회에서 권장 하는 기준에 따라 셀의 선택 했다. 최근 연구에서 eqUCM-MSCs CD44에 대 한 긍정적이 고 부정적인 CD34와 MHC II, 문화 조건에 있었다. 표준 조건 하에서 경작 하는 세포 또한 CD90, CD105, 그로 인하여 표면 마커 표현의 측면에서 MSCs에 대 한 기준을 충족에 대 한 긍정적인 했다. 또한,이 연구 eqUCM-MSCs 키토 산 영화, 인간의 MSCs19,20이전 보고서 확인에 교양 때 spheroids의 형성에 첫 번째 보고서입니다. 3D 세포 배양 기술 있다 생리 적 틈새를 닮은 환경을 만드는 것을 목표로 하는 수십 년 동안 광범위 하 게 탐험 되었습니다. 실제로,이 학문은 보여주었다 Oct4, Sox2및 Nanog, 및 향상 된 차별화의 향상 된 stemness 유전자 식 수준 잠재적인, 어떤 다른 보고서19,20와 일치 하는. 다른 향상 된 immunomodulatory 속성43 및 유리 모양의 연골 재생44 MSCs spheroids를 사용 하 여 보고. 기법으로 다양 한 3D 문화 스피너 플라스 크, 회전 셀 bioreactors, 비 부착 판, 천연 및 합성 행렬, 키토 산 영화 여러 가지 이유로 매력적 보인다. 이 방법은 고가의 장비를 필요로 하지 않습니다 하 고는 비용에 비해 비 부착 판 합성 매트릭스, 키토 산 이기 때문에 해산물 업계의 부산물. 키토 산 영화에 세포를 배양 하는 것은 기술적으로 쉽다입니다. 결합, 이러한 장점을 대규모45에 임상 응용 프로그램을 허용할 것입니다.
양측 슬 개 골 힘 줄 모델 제안 여기 병 적 측면에서 허용 나타납니다. 아니 합병증 연구의 최근 연구에서 관찰 되었다. 우리는 결함 감지 biomechanical 및 조직학 변화 허용 하도록 충분히 큰에 의해 유도 된 스트레스 효과의 위험에 특히 염려 했다. 이러한 우려는 크기와 힘 줄의 전 임상 부상 모델에 대 한 성숙에 관련 된 연구에 따라이 연구에 대 한 쥐에 쥐의 선택 메시지가 나타납니다. '창 결함' 또는 중앙 3 슬 개 골 힘 줄 결함 힘 줄 치유와 확대를 공부 토끼46 와 쥐30,31 에서 설명 하고있다. 슬 개 골 힘 줄 '창 결함' 모델 조직학31,39, biomechanical30,31, ex vivo 형광 테스트와 쥐에 있는 힘 줄 수리 공부에 대 한 재현 발견 되었습니다. 31을이미지입니다. 이 연구에서 결함의 크기, 슬 개 골 힘 줄의 중앙 세 번째에 해당 되었고 템플릿으로 0.99 m m 직경 Kirschner 철사로 표준화 되었다. 이러한 차원 힘 줄 수술 파열을 유발 하지 않고 치유 공부에 적절 한 했다. 크기 때문에 그들의 더 큰 해부학 마우스 대, 쥐 큰 결함, 상해, 치료 납품, 및 측정 결과의 재현성 향상을 수용할 수 있습니다.
이 연구에서는 쥐에 게 투여 하는 진통 프로토콜 RGS37,38와 평가, 수술 후 통증 조절에 효과적 이었습니다. 그것은 이전 유효성 검사를 반영 하는 쥐37,38에 통증 수술 행동 변화를 감지 하기 때문에이 점수 시스템 여기 선정 되었다. RGS 궤도 강화, 코/뺨 병합, 귀/수염 변경 등 식별 하기 위해 비교적 간단한 표시를 기반으로 합니다. 쥐도 더 지원이 진통의 효능이이 연구를 통해 정상적인 음식 섭취 량을 유지. 실제로, 이전 보고서 쥐 meloxicam47같은 비 스테로이드 소염제로 치료에 수술 후 통증과 몸 무게 변화 사이의 상관 관계를 발견 했다. 이 에이전트는이 연구에서 선정 되었다과 선제 관리 쥐37,48 와 개49, 수술 직전 항 염증 성 에이전트의 관리를 발견 되었습니다 연구에서 파생 된 약하게 수술 통증 유발. 함수는 두 골반 사지의 사용을 평가 하도록 설계 채 점 시스템을 사용 하 여 수술 후 통증의 추가 지표로 서 평가 했다. 여기에서 선택 하는 세 가지 활동의 움직임과 골반 팔 다리에 체중을의 지의 범위는 일반적인 평가 제공 합니다. 이 채 점 시스템 쥐50,51 에서 모두 정적 및 동적 기능 복구 연구에서 파생 되었다 하 고 관찰 하는 기능 결과의 시간 과정을 비교 하도록 설계 되었습니다. 점수 표시 양자 힘 줄 결함 7 일, 28 일 이내 정상으로 복귀와 함께 함수에 임시 감소 유도. 기능 점수 통증 보다는 RGS 정형 조건에 보조 탐지에 더 민감한 나타납니다. 비슷한 기능 테스트 평가 하 아 킬 레 스 기능 인덱스28같은 힘 줄 치유, 발 고 보 폭 측정51또는 다른 거시적인 득점 시스템52사용 되었습니다.
이 모델은 연구 결과 치료 힘 줄과 두 줄기 세포 기반 치료 사이 분화 하는 동안에 동물의 수를 줄이기 위해 설계 되었습니다. 이 연구에서 테스트 하는 치료의 효과 다른 게시36에 설명 되어 있습니다. 여기에 사용 되는 모델 biomechanical 비파괴 힘 줄의 28 일 (하지 여기에 제시 된 데이터)와 함께 각 쥐에는 내부 컨트롤의 사용을 통해 치료 차이의 탐지를 허용.
활성화 된 조절된 플라즈마 줄기 세포, 생체 적합성, 접근성, 그리고 tendinopathies,5354의 관리에 현재 임상 응용 프로그램에 대 한 캐리어로 일반적인 사용 때문에 선정 되었다. 그것은 치료 힘 줄의 치유에 기여 하지만, 줄기 세포의 지역 보존을 허용 수 있습니다 그리고 그것은 방해 하지 않는 치료 그룹의 비교 때문에 둘 다 활성화 조건된 플라즈마의 동일한 금액을 포함. 치료 힘 줄의 조직학 특징 어디 괴 사 성 조직 및 방해 콜라겐 번들 제거 됩니다 먹어서 용균성 효소에 의해 세포에 의해 염증 단계, 힘 줄 치유의 이전 묘사와 일치 하는 최대 지속 10 일 부상54,,5556게시물. 증식 단계 세포 확산 및 복구 사이트의 vascularity 가장입니다 28 일 후에 힘 복구57,58에서. 우리는 힘 줄, 횡단면 지역 및 표본의 낮은 탄성 계수의 명백한 두껍게 사이의 상관 관계를 발견. 이러한 결과 바탕으로, 조직학 점수 바람직하지 않을 수 있습니다 biomechanical 강도, 콜라겐 섬유, 신생, 및 chondrogenesis의 해체 등으로 이어질 하지 않습니다 조직 변경 반영 하는 것으로 보인다. 조직학 특징에 따라 치료 차별이 모델 수 tenocytes, 세포 외 매트릭스 조직, proteoglycan 내용의 존재 같은 추가 기준을 통합 하 여 개선 하는 수 있습니다 미래에, 그리고 엘라 스 틴 섬유52,59의 분포.

힘 줄 부상 종1에 걸쳐 상당한 통증과 근육 위축 증의 가장 일반적인 원인 중 하나입니다. 수의학, 경주 말에 모든 상해의 82 %musculoskeletal 시스템을 포함 하 고 그의 46%에 영향을 미칠 힘 줄과 인 대2,3말에 특별 한 관심의 힘 줄 및 인 대 부상 있습니다. 흉터 조직 형성과 치료 힘 줄의 biomechanical 속성에 영향을 미치는 flexor의 힘 줄 부상; 후 운동 사용에 반환에 대 한 경비 예 후를 설명 한다 다시 부상 발생에 2 년 이내 최대 말의 67%4신중 하 게 취급 합니다. 재생 의학 도전 전통적인 치료 조건에 새로운 대안을 제공 합니다. 자가 줄기 세포 치료 몇 가지 고무적인 결과5,6 생산 하지만 조직 컬렉션, 지연 처리/프로그래밍으로 인해 셀, 행정과의 영향와 관련 된 병 적 상태에 의해 제한 되는 줄기의 속성 (예: 연령) 환자의 건강 상태7,8세포. 이러한 제한은 상용 해서도 수용자 줄기 세포를 조사 근거를 제공 합니다. 그들은 윤리적 문제 및 기형종의 배아 줄기 세포와 관련 된 위험을 회피 하기 때문에 태아 adnexa 파생 셀 매력적인 후보자 이다. 태아 adnexa 가운데 탯 매트릭스 (UCM)와 튼의 젤리 라는 풍부 하 고 수집 하기 쉬운입니다.
셀 소스에 stemness 강화 allogenic 재생 의학을 위한 세포 은행 확립에 필수적 이다. 기능 관점에서 stemness 자체 갱신 및 다중 계보 분화9에 대 한 가능성으로 정의할 수 있습니다. Stemness의 증거 분석, 유전자 마커 Oct4, Sox2, 및 Nanog9의 식 함께 확산 및 감 별 법에 의존합니다. 한 전략 stemness 향상을 void 필러와 강화 확산 및 UCM MSCs의 차별화로 생체 재료의 사용에 의존 합니다. 이 방법은 유도 만능 세포로 성숙 세포를 재 설 정할 transcriptional 요인의 조작에 관한 우려를 제거 합니다. 생체 줄기 세포에 대 한 잠재적인 운반대로 간주, 중 키토 산 생체 적합성과 분해성10매력적 이다. 이 자연 aminopolysaccharide 카이, 두 번째 가장 풍부한 천연 다 당 류 주로 조개10의 subproduct로 얻은 알칼리 성 deacetylation에 의해 형성 된다. 우리 이전에 MSCs 및 키토 산 건설 기계 사이의 상호 작용을 조사 하 고 spheroids11,12,13,,1415, 의 형성 관찰 16. 우리는 또한 키토 산 행렬12,13,14,15,,1617, chondrogenesis의 우수성에 보고 18. 최근에, 2 개의 독립적인 연구 지방 조직에 의해 spheroids 형성을 설명 하 고 태 반 조직 유래 키토 산 영화19,20에 경작 하는 MSCs. Spheroids의이 형성 뿐만 아니라 stemness, 강화 하지만 또한 생체 내에 이식20후 줄기 세포의 보존을 향상.
정도와 병 종에 걸쳐 tendinopathy의 tendinopathies의 병 태 생리학을 연구 하 고 줄기 세포 주사 등 새로운 치료법을 테스트 실험 모델의 개발 라는 메시지가 있다. 말, 콜라 유도 염증이 생길 수도 힘 줄 수리21에서 MSCs를 사용 하 여 효능을 입증 하는 일반적인 모델입니다. 이 접근의 관련성, 주사는 급성 염증 성 변화를 일으킬, 임상 tendinopathies 만성에서 일반적으로 발생 하는 반면 팽팽하게22,23. 또한, 힘 줄 질환의 화학 유도 치료 응답을 유도 하 고 임상의 경우22,23에 장애인된 치유 과정을 복제 하지 않습니다. 표면 디지털 flexor의 힘 줄의 세그먼트의 절단 말24에 염증이 생길 수도의 외과 모델로 설명 하고있다. 더 최근에, 최소로 침략 접근 표면 디지털 flexor의 힘 줄25의 중앙 코어를 외상 성 손상 제한 하 사용 되었다. 외과 모델 자연 힘 줄 질환으로 이어질 수 있는 손상 만든25의 범위 내에서 재현성 부족 경향이 피로 메커니즘을 시뮬레이션 하지 않습니다. 모델, 병 적 상태 및 힘 줄의 말 모델와 관련 된 비용에 질병 vivo에서 새로운 치료의 평가 대 한 첫 번째 단계로 설치류 모델에 대 한 관심을 정당화 하는 추가 제한이 있습니다.
설치류의 실험 모델의 주요 장점 중 하나 비용과 간 개별 가변성을 제어 하는 기능으로 이루어져 있다. 설치류 그들의 빠른 성장 속도로 인해 다양 한 생리 적인 요인에 관하여 표준화 수 고 상대적으로 짧은 수명을, 변이의 소스를 제한 및 그러므로 차이 감지 하는 데 필요한 동물의 수를 감소. 설치류에 힘 줄 질환을 유도 하는 전략 부분 힘 줄 결함21의 외과 생성 뿐만 아니라 화학 유도에 의존 했습니다. 외과 모델 자연 tendinopathies 화학 모델 보다 더 나은 시뮬레이션 수 있습니다 하지만 더 높은 사망률 및 손상 된 힘 줄의 치명적인 오류가 발생할 수 있습니다. 그 점에서 쥐 조직 치유의 평가 촉진 함으로써 더 큰 결함의 생성을 허용 하는 그들의 크기가이 모델에 대 한 마우스 보다 더 나은 후보를 보인다. 4 주요 힘 줄 그룹에서 tendinopathies의 실험 연구에서 사용 된 Sprague-Dawley 쥐: 회전자, flexor, 아 킬 레 스, 그리고 슬 개 골 심 줄26. 이 중, 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델은이 힘 줄의 더 큰 크기와27에 액세스의 용이성 때문에 특히. 슬 개 골 힘 줄 tibial tuberosity에 quadriceps 근육을 연결합니다. 이 신 근 메커니즘 내에서 슬 개 골은 sesamoid 뼈는 허벅지 근육의 동작을 지시 하 고 슬 개 골 힘 줄의 인접 정도 구분. 슬 개 골 힘 줄의 인접 하 고 말 초 범위에서 뼈 앵커의 존재 biomechanical 테스트를 지원합니다. 일반적으로 슬 개 골 힘 줄을 포함 하는 모델 contralateral 그대로 힘 줄 컨트롤28,29봉사와 일방적인 외과 결점에 의존 합니다. 가장 일반적인 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에서는 contralateral 슬 개 골 힘 줄은 그대로 동안 tibial tuberosity의 삽입에 슬 개 골의 원심 꼭대기에서 슬 개 골 힘 줄의 중앙 부분 (폭에서 1 m m)를 절 개 합니다. 측정 결과의 조직학, 비-파괴적인 biomechanical 테스트 또는 biomechanical 테스트 실패, 초음파 영상, ex vivo 형광 이미징, 총 관찰, 그리고 기능 테스트28,30 포함 ,31. 일방적인 모델 같은 동물 내에서 유사한 상해의 보수 관리와 제안 된 치료의 비교를 허용 하지 않습니다. 마찬가지로, 여러 치료 간의 비교는 별도 동물을 필요합니다. 양자 모델 간 개별 변이 제거 하 고 연구32에 필요한 동물의 수를 줄일 것 이다. 그러나, 양자 상해 사망률을 증가 시킬 수 있습니다 그리고 양자 lameness 치료 평가 방해 수 있습니다. 몇 가지 연구 짧게 페리 요원 관리 보다는 오히려 치료의 효과 모델33,34의 병 적에 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 쥐 하지만 초점에의 사용을 보고합니다.
이 연구의 장기 목표는 UCM MSCs allogenic 이식에 운명의 stemness 그리고 vivo에서 생존을 개량 하는 전략을 개발 하는 것입니다. 이 목표를 달성 하기 위해 우리 최근 키토 산 영화와 인큐베이션 hypoxic 환경35아래에 spheroids의 형성에 의해 UCM MSCs의 향상 된 stemness을 보고 있다. 이러한 생체 외에서 속성은 관련 된 슬 개 골 힘 줄 결함 조건된 UCM으로 치료의 향상 된 biomechanical 속성-MSCs. 이러한 결과에 기반, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 후보 테스트에 적합 한 것 힘 줄 부상36에 대 한 치료입니다. 연구의 목적은 여기 격리 및 특성화 UCM MSCs의 줄기 세포, 창조 및 양측 슬 개 골 힘 줄 결함, 그리고 수술 후의 치료에 대 한 생물 학적 전달 시스템의 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하는 보고 복구 및 조직 결함 내 치유의 평가 합니다.

<table><tbody><tr><td>PBS 10x</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Collagenase type IA</td><td>Worthington</td><td>LS004197</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>DMEM low glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30021.FS</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Hyclone</td><td>SV30084.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma</td><td>C3646</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Hyclone</td><td>SH30574.01</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Round bottom polystyrene tube</td><td>Corning</td><td>149591A</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-horse CD44 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1082F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-rat CD90 (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA47FT</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-horse MHC-II (FITC)</td><td>AbD serotec</td><td>MCA1085F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td><td>AbD serotec</td><td>MCA928F</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)</td><td>abcam</td><td>ab11415</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 (FITC) - Isotype Control</td><td>abcam</td><td>ab91356</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD34 (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB560942</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Mouse IdG1 kappa (FITC)</td><td>BD</td><td>BDB555748</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD</td><td>BDB559925</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Vacutainer 5 mL</td><td>Med Vet International</td><td>RED5.0</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Acid-citrate-dextrose</td><td>Sigma</td><td>C3821</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>JD Medical</td><td>60307-320-25</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Rats</td><td>Charles River</td><td>Strain code: 400</td><td>Experimental animal</td></tr><tr><td>Rat surgical kit</td><td>Harvard apparatus</td><td>728942</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Surgical Blade #15</td><td>MEDLINE</td><td>MDS15115</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Rat MD&#039;s Baytril (2 mg/Tablet),&lt;br/&gt; Rimadyl (2 mg/Tablet)</td><td>Bio Serv</td><td>F06801</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Polyglactin 910, 5-0</td><td>Ethicon</td><td>J436G</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Eosin alchol shandon</td><td>Thermo scientific</td><td>6766007</td><td>Consumable</td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>143907</td><td>Consumable</td></tr></tbody></table>

evaluation of stem cell therapies in a bilateral patellar tendon injury model in rats

재생 의학 조건 전통적인 치료에 도전 하는 새로운 대안을 제공 합니다. 정도와 종에 걸쳐 tendinopathy의 사망률이 조직의 한정 된 치료 속성 결합, 세포 치료에 대 한 검색 메시지가 있고 그들의 효능을 연구 실험 모델의 개발을 추진. 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 (MSC UCM)는 매력적인 후보 때문에 풍부 하 고, 수집, 윤리적인 우려 및 기형종 형성의 위험 회피 아직 원시적인 배아 줄기 세포를 더 밀접 하 게 닮은 쉽게 보다 성인 조직 유래 MSCs 상당한 관심은 회전 타원 체 형성을 통해 MSCs의 재산을 강화 하는 전략으로 키토 산에 집중 했다. UCM-MSCs을이 종이 세부 기법 키토 산 필름 spheroids를 준비 하 고 표면 마커 식에 회전 타원 체 형성의 효과 분석. 따라서, 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델의 창조는 UCM MSC spheroids 키토 산 필름 형성의 vivo에서 이식에 대 한 설명 되어 있습니다. 아니 합병증 관찰 되었다 병 적 상태에 관하여 연구에서 스트레스 상승 효과, 또는 조직 감염. 7 일 운영된 쥐의 총 기능 점수 정상 쥐 보다 낮은 했지만 수술 후 28 일 이내 정상으로 돌아왔다. 조직 치유의 조직학 점수 7 일 평가 처리 결함에 응고 이물질 반응, 그리고 28 일에 치료 진행의 부재의 존재를 확인 했다. 이 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 각 쥐에는 내부 통제의 창조를 통해 간 개별 변형 제어, 수용 병 적 상태와 관련 된 되었고 치료 힘 줄과 치료의 차이점의 탐지를 허용.

현재 연구에서 결과 ± SD (표준 편차)를 의미 하는 대로 표시 됩니다. 셀 6 mares의 탯에서 고립 되었다 및 표준 또는 키토 산 컨디셔닝에서 각 세포 표면 마커를 표현 하는 격리 된 셀 라인의 비율 비교 했다 프리드먼 테스트와 함께 비패라메트릭 분산 분석으로 반복 측정 한다입니다. 힘 줄 결함 모델 생성 8 쥐 7 일 수술 후 평가 위해 사용 되었다 및 12 쥐 28 일 평가 위해 사용 되었다. 기능 결과의 결과 ± SEM (뜻의 표준 오류)을 의미 하는 대로 표시 됩니다 하 고 t-검정을 사용 하 여 비교. UCM은 셀룰러 소스 그것의 풍부, 수집, 및 다른 태아 adnexa 소스40기준으로 우수한 확산의 용이성으로 인해로 선정 됐다. UCM 표준 접시에 배양에서 분리 된 세포 확장에 걸쳐 구와 같은 모양을 유지. 셀 키토 산 판 (그림 8)에 경작 하는 때 spheroids를 형성 했다.
표준 조건 하에서 경작 하는 세포의 대부분 표현 CD44 (98.6 ± 1.62%), CD90 (88.7 ± 3.04%), 그리고 CD105 (77.9 ± 6.84%), 표현 CD34의 동안 (0.07 ± 0.17%)와 MHC II (1.33 ± 1.12%)은 매우 낮은. 바른된 문화, CD44 식 수준 아래 (97.0 ± 2.12%)와 CD34 (1.13 ± 1.58%) 식 수준의 CD90 동안 표준 문화에서 차이가 없 (33.3 ± 37.1%)와 CD105 (54.0 ± 19.0%) 감소와 MHC II (2.84 ± 0.98%) 증가35.
절연 및 UCM MSCs에서 생체 외에서의 특성을 다음 조건된 셀의 생물 학적 행동 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델에 표준 조건 하에서 경작 하는 세포의 비교 되었다. 치료 되지 않는 결함 각 쥐에 내부 통제로 봉사 했다. 붓기는 수술 후 모든 쥐에 최소한의 고 48 시간 이내에 해결. RGS에 따르면 쥐의 통증이 나 조 난 신호를 표시 하는 같은 궤도 강화, 코/뺨 병합, 또는 귀/수염 변경. 모든 쥐에 사용 3-4 알 약의 정상적인 범위 또는 사료 연구를 통해 매일 15-20 그램. 총 기능 점수 지원 포함 하 고 남의 뒷 다리 뿐만 아니라 점수를 등반으로 서 정상적인 쥐 7 일 운영된 쥐에 비해 높았다 (n = 8, p < 0.0001, 표 3). 그러나, 총 기능 점수 수술 후 28 일 이내 정상에 반환 (n = 12, p = 0.78). 따라서, 쥐 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 간 개별 변화를 제한 하 고 중요 한 병 적 상태 (비디오 1-5)을 유발 하지 않고 동물의 필요한 수를 감소에 대 한 효과적인 것으로 표시 되었습니다.
28 일 수집 된 힘 줄의 약 37% 현저 하 게 두꺼워 (그림 7) 등장. 이 두껍게 빈 및 처리 결함 사이 동등 하 게 배포 했다. 총 조직학 점수 치료 결함에 시간 증가 (n = 20, p 0.0034 =). 연골 형성, 7, 28 일 사이 증가 이루어져 있었다 때 치유 점수의 각 구성 요소는 평가 하지 독립적으로 시간 변경 하는 유일한 매개 변수 (n = 20, p < 0.0001). 신생 시간과 함께 증가 하는 경향이 (p = 0.3), 콜라겐 형성을 다 하지 않았다 (p = 0.69). 조직학 검사, 염증 치료의 존재에 수술 후 7 일에 시험 하는 힘 줄의 조직 단면도의 모든 관찰 되었다. 혈 종 모든 취급된 결함에 존재 했다입니다. 조직학 신생 점수 1, 0에서 배열 했다 (표 2, 그림 9) 적당 한 되 고 모 세관 침투, 콜라겐 등급 점수 (표 2, 그림 10) 동안 3 전체, 2에서 배열 했다 제안 제안 광범위 한 중간 콜라겐 형성입니다. 연골 형성 점수 (표 2, 그림 11) 연골 형성의 25% ~ 50% 힘 줄 섹션 영역의 중간에 전혀 연골 형성을 제안 하는 2 0에서 배열 했다. 모든 조직학 수치는 힘 줄의 중간 부분의 가로 섹션의 중간 양상으로 위쪽과 앞쪽 측면으로 왼쪽으로 향하게.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig1.jpg"> 그림 1: 쥐와 무 균 수술에 대 한 준비의 위치. 각 쥐 0.5 L 물병 두 따뜻한 물으로 채워지고 피부 부상을 방지 하면서 체온과 위치를 유지 하기 위해 천으로 덮여 사이 배치 했다. 테이블에 각 쥐의 사지 녹화 했다 고 본문은 버블 랩으로 덮여. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig2.jpg"> 그림 2: 슬 개 골 힘 줄 (맞춤)의 외과 모델. 0.99 m m 직경 Kirschner 와이어는 각 사지에서 결함의 크기를 표준화 하는 템플릿으로 힘 줄에 대 한 정렬 됩니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig3.jpg"> 그림 3: 슬 개 골 힘 줄의 (절 개) 수술 모델. 2 전체 두께 절 개 힘 줄의 중앙 부분을 Kirschner 와이어의 양쪽에 만들어집니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig4.jpg"> 그림 4: 슬 개 골 힘 줄의 (절제술) 수술 모델. 중앙 섹션 proximally 고 distally, Kirschner 와이어의 크기를 일치 하는 결함을 만드는 절제입니다. 절제 지역 점선 상자 안에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig5.jpg"> 그림 5: 운영된 stifles의 수술 모습. 근은 십자 패턴으로 닫히고 피부 피부 패턴으로 폐쇄 되었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig6.jpg"> 그림 6: UCM MSCs의 배달에 대 한 활성화 조절된 플라즈마의 준비. 줄기 세포 조절된 플라즈마 활성화 이전에 중단 되었다. 그 결과 응고 슬 개 골 힘 줄 결함에 삽입 되었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig7.jpg"> 그림 7: 총 정상 (C, D)의 모양 및 (A, B) 두꺼워 힘 줄. (A, C) 후부 보기; (B, D) 측면 보기; 블록 화살표는 경골을 식별 하 고 얇은 화살표 힘 줄을 식별 합니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig8.jpg"> 그림 8: 조직 문화에 배양 세포의 형태학 접시 19% 미만 산소 수준 (표준 그룹: A) 키토 산 영화 미만 5%와 산소 수준 (조건된 그룹: B). 스핀 들 표준 그룹 (A)에 형성 했다 세포 분리 및 형성 조건된 그룹 (B)에 spheroids. 눈금 막대 400 µ m = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig9.jpg"> 그림 9: 대표 현미경 신생 등급에 대 한 사용 빛. 치유의 7 일, 다음 치료와 힘 줄 조절된 세포 (C, F) 또는 표준 세포 (B, E) 각각 0.5와 0의 등급을 받은 반면 0 (A, D)의 급료를 받았다. 28 일, 치료 힘 줄 (G, J)와 그 조절 세포 (난,L) 또는 (H,K) 표준 셀 각각 1.0과 0.5의 점수를 받은 반면 0 등급을 받았다. 화살표는 혈관 힘 줄 샘플에 존재를 식별합니다. 100 배 확대 혈관을 가리키는 화살표가 400 배 확대에 혈관을 가리키는 같은 화살표에 해당 합니다. (M, N)에 티슈를 정상 힘 줄 Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig10.jpg"> 그림 10: 대표 콜라겐 등급에 사용 하는 현미경 빛. 치유의 7 일, 다음 치료와 힘 줄 (B, C, E, F) 치료와 함께 그 3.0의 등급을 받은 반면 2.5 (A, D)의 급료를 받았다. 28 일, 치료 힘 줄 (G, J) 반면 그 조건 (I, L) 세포 또는 1.0 및 3.0의 표준 셀 (H, K) 받은 점수 각각 3.0 등급을 받았다. 힘 줄 섬유의 해체는 400 X 인세트 (H, K)에서 감상할 수 있습니다. 정상 힘 줄 조직 (M, N) Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56810/56810fig11.jpg"> 그림 11: 대표 현미경 연골 등급에 대 한 사용 빛. 치유의 7 일, 다음 치료 (A, D), 그와 함께 힘 줄 조절 세포 (C, F) 또는 표준 세포 (B, E), 모든 0의 등급을 받았다. 반면 그 조건 (I, L) 세포 또는 0과 2.0의 표준 셀 (H, K) 받은 점수 각각 28 일, 치료 힘 줄 (G, J) 1.0, 등급을 받았다. 화살표는 chondrocytes 힘 줄 샘플에에 향하고 있습니다. 100 배 확대에 chondrocytes을 가리키는 화살표가 가리키는 400 배 확대에 chondrocytes 같은 화살표에 해당 합니다. 정상 힘 줄 조직 (M, N) Masson의 trichrome 얼룩 (A, B, C, G, H, I, M); 되며 고 오신 얼룩 (D, E, F, J, K, L, N); 눈금 막대 = 100 µ m (A N). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/56810fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
비디오 1: 쥐에 외래 함수 계산. 남의 뒷 다리 서 타임 (1-5 s: 점수 1) post-operatively 4 h를 관찰 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_1.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 2: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 도움의 앞 발과 뒷 다리 서 시간 (0-5 s: 점수 0) 4 h operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_2.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 3: 쥐에 외래 함수 계산. 남의 뒷 다리 서 타임 (1-5 s: 1 점수), 지원의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (5-10 s: 1 점수) 14 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_3.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 4: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 지원의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (10-15 s: 2 점수), 17 cm 플라스틱 케이지 벽 등반 능력 없이 (아무 등반: 점수 0) 27 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_4.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
비디오 5: 쥐에 있는 보 행 기능 평가. 도움의 앞 발과 뒷 다리 서 타임 (5-10 s: 1 점수), 17 cm 플라스틱 케이지 벽을 등반 하는 기능 (예: 1 점수) 14 일 operatively 게시 하는 것을 지적 했다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56810/Video_5.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>기능 테스트</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>점수</td>
		</tr>
<tr>
<td>뒷 다리 서 보조</td>
			<td>0-5 s</td>
			<td>> 5-10 s</td>
			<td>> 10-15 s</td>
			<td>> 15 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>남의 뒷 다리 스탠드</td>
			<td>0-1 s</td>
			<td>> 1-5 s</td>
			<td>> 5 s</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>상승 능력</td>
			<td>아니요</td>
			<td>예</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>총</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 쥐에 있는 보 행 기능을 평가 하는 시스템 점수. 채 점 시스템 (0-6) 외래 함수 초과 뒷 다리 서 앞 발 지원 등 3 활동에 따라 (0-3)를 평가 하기 위해 개발 되었습니다, 그리고 남의 뒷 다리 서 (0-2), 그리고 17 cm 플라스틱 케이지 벽 (0-1) 등반 능력을 초과 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="6">콜라겐 학년</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="5">일반 콜라겐 tangentially 지향</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="5">콜라겐 섬유 조직을 파괴 하는 25% 보다 적은 가벼운 변화</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="5">25%와 50% 사이 콜라겐 섬유와 온건한 변화 무질서</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="5">콜라겐 조직을 파괴 하는 50% 이상 표시 변경</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">신생의 정도</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="5">보통 침투 arterioles와 조직의</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="5">모세 혈관의 존재</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="5">아니 맥 관 구조 침투</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">연골 형성</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="5">전혀 연골 형성</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="5">절연된 유리 모양의 연골 혹</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="5">보통 연골 형성 25% ~ 50%의</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="5">광범위 한 연골 형성, 관련된 분야의 50% 이상</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 등급을 득점 하는 조직학. 섹션의 조직학 점수 콜라겐 학년, 신생, 및 연골 형성 (로젠바움 외. 에서 적응의 정도에 따라 등급이 매겨 했다 39)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>그룹</td>
			<td>± Sem의 의미</td>
		</tr>
<tr>
<td>일반 (n = 3)</td>
			<td>6.00 ± 0.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>수술 후 7 일 (n = 8)</td>
			<td>2.25 ± 0.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>수술 후 28 일 (n = 12)</td>
			<td>5.83 ± 0.24</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 정상 쥐와 치료 쥐의 기능 점수. 정상적인 쥐와 치료 쥐 7과 28 일의 기능 점수 postoperatively 등급 했다. n = 쥐의 수.
보충 그림 1: 게이팅 전략 및 표면 마커 식의 예: 파편은 작은 FSC 그리고 SSC (A)에 따라 제외 했다. 라이브 셀 7-AAD FL3에 의해 감지 된 부정적인 얼룩이 지기에 따라 선정 됐다 (B). Isotype 일치 제어 (C)는 부정적인 컨트롤로 CD44 FITC 긍정적인 세포 (D)의 게이트를 만드는 데 사용 된.

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Evaluation of Stem Cell Therapies in a Bilateral Patellar Tendon Injury Model in Rats

쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

Regenerative medicine provides novel alternatives to conditions that challenge traditional treatments. The prevalence and morbidity of tendinopathy across ...

evaluation-stem-cell-therapies-bilateral-patellar-tendon-injury-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K 조회수.  Western University of Health Sciences. 이 종이 준비와 쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 결함 모델 탯 매트릭스 유래 중간 엽 줄기 세포 spheroids의 평가 설명합니다. 이 모델 수용 병 적 상태와 관련 되었다와 치료 및 치료 힘 줄 사이의 차이 검출 하기 위하여 발견 되었고 2 개의 처리 사이 테스트.

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Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

연구

의학

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

엔지니어링 전방 십자 인대 이식의 평가 흉선 쥐 모델

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

생체공학

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

의 응용 프로그램<em&gt; 생체</em&gt; 조직 평가를위한 쥐 앞정 전방의 기능 테스트는 골격근 수리 엔지니어링

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 ​​이미징 및 추적에서

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

A Rat Tibial Growth Plate Injury Model to Characterize Repair Mechanisms and Evaluate Growth Plate Regeneration Strategies

A third of all pediatric fractures involve the growth plate and can result in impaired bone growth. The growth plate (or physis) is cartilage tissue found at the end of all long bones in children that is responsible for longitudinal bone growth. Once damaged, cartilage tissue within the growth plate can undergo premature ossification and lead to unwanted bony repair tissue, which forms a "bony bar." In some cases, this bony bar can result in bone growth deformities, such as angular deformities, or it can completely halt longitudinal bone growth. There is currently no clinical treatment that can fully repair an injured growth plate. Using an animal model of growth plate injury to better understand the mechanisms underlying bony bar formation and to identify ways to inhibit it is a great opportunity to develop better treatments for growth plate injuries. This protocol describes how to disrupt the rat proximal tibial growth plate using a drill-hole defect. This small animal model reliably produces a bony bar and can result in growth deformities similar to those seen in children. This model allows for investigation into the molecular mechanisms of bony bar formation and serves as a means to test potential treatment options for growth plate injuries.

The growth plate is a cartilaginous region in children's long bones where longitudinal growth occurs. When injured, bony tissue can form and impair growth. We describe a rat model of growth plate injury that leads to bony repair tissue, allowing the study of repair mechanisms and growth plate regeneration strategies.

쥐 경골 성장 플레이트 손상 모델 수리 메커니즘을 특성화하고 성장 플레이트 평가 재생 플레이트 전략

A third of all pediatric fractures involve the growth plate and can result in impaired bone growth. The growth plate (or physis) is cartilage tissue found ...

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a lesion in the Achilles tendon; prepare PRP and inject it (or the saline solution); remove the tendon; and perform biomechanical, molecular, and histological evaluations. At each step, all the procedures and methods are described in detail, so they can be reproduced easily.
Achilles tendons have been surgically sectioned (removal of a 5-mm long section). Afterwards, PRP or saline solution was injected to study whether PRP has a positive effect on the healing of the tendon. Three groups of 40 animals (a total of 120 rats were used in this study) were subdivided into 2 subgroups: PRP injection group and a saline injection control group. Rats were sacrificed at increasing time points (Group A: 5 days; Group B: 15 days; Group C: 30 days) and tendons were removed. 90 tendons underwent biomechanical testing before performing transcriptomic analysis and the 30 remaining tendons were submitted to histological analysis.

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma PRP on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

This protocol describes the evaluation process of healing tendons in rats that have been injected with allogeneic platelet rich plasma (PRP) or saline solution after removing part of the Achilles tendon. The progress of tendon healing is evaluated at several time points using different types of analyses.

쥐의 Sectioned 아 킬 레 스 힘 줄의 치유 과정에서 수용자 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 효과: 방법론 설명

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a ...

힘줄 충돌의 이해 – 기계생물학 연구를 위한 쥐 외식물 모델

Murine Hind Limb Explant Model for Studying the Mechanobiology of Achilles Tendon Impingement

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a localized fibrocartilage phenotype characterized by accumulation of glycosaminoglycan (GAG)-rich matrix and remodeling of the collagen network. While fibrocartilage is a normal feature in impinged regions of healthy tendons, excess GAG deposition and disorganization of the collagen network are hallmark features of tendinopathy. Accordingly, impingement is clinically recognized as an important extrinsic factor in the initiation and progression of tendinopathy. Nevertheless, the mechanobiology underlying tendon impingement remains understudied. Prior efforts to elucidate the cellular response to tendon impingement have applied uniaxial compression to cells and excised tendon explants in vitro. However, isolated cells lack a three-dimensional extracellular environment crucial to mechanoresponse, and both in vitro and excised explant studies fail to recapitulate the multiaxial strain environment generated by tendon impingement in vivo, which depends on anatomical features of the impinged region. Moreover, in vivo models of tendon impingement lack control over the mechanical strain environment. To overcome these limitations, we present a novel murine hind limb explant model suitable for studying the mechanobiology of Achilles tendon impingement. This model maintains the Achilles tendon in situ to preserve local anatomy and reproduces the multiaxial strain environment generated by impingement of the Achilles tendon insertion upon the calcaneus during passively applied ankle dorsiflexion while retaining cells within their native environment. We describe a tissue culture protocol integral to this model and present data establishing sustained explant viability over 7 days. The representative results demonstrate enhanced histological GAG staining and decreased collagen fiber alignment secondary to impingement, suggesting elevated fibrocartilage formation. This model can easily be adapted to investigate different mechanical loading regimens and allows for the manipulation of molecular pathways of interest to identify mechanisms mediating phenotypic change in the Achilles tendon in response to impingement.

저자 스포트라이트: 힘줄 충돌의 기계생물학 규명 – 다축 쥐 뒷다리 이식 모델 

We present a custom experimental platform and tissue culture protocol that recreates fibrocartilaginous change driven by impingement of the Achilles tendon insertion in murine hind limb explants with sustained cell viability, providing a model suitable for exploring the mechanobiology of tendon impingement.

아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델

Tendon impingement upon bone generates a multiaxial mechanical strain environment with markedly elevated transverse compressive strain, which elicits a ...

Applying a Three-dimensional Uniaxial Mechanical Stimulation Bioreactor System to Induce Tenogenic Differentiation of Tendon-Derived Stem Cells

Tendinopathy is a common chronic tendon disease relating to inflammation and degeneration in an orthopaedic area. With high morbidity, limited self-repairing capacity and, most importantly, no definitive treatments, tendinopathy still influences patients&#8217; life quality negatively. Tendon-derived stem cells (TDSCs), as primary precursor cells of tendon cells, play an essential role in both the development of tendinopathy, and functional and structural restoration after tendinopathy. Thus, a method that can in vitro mimic the in vivo differentiation of TDSCs into tendon cells would be useful. Here, the present protocol describes a method based on a three-dimensional (3D) uniaxial stretching system to stimulate the TDSCs to differentiate into tendon-like tissues. There are seven stages of the present protocol: isolation of mice TDSCs, culture and expansion of mice TDSCs, preparation of stimulation culture medium for cell sheet formation, cell sheet formation by culturing in stimulation medium, preparation of 3D tendon stem cell construct, assembly of the uniaxial-stretching mechanical stimulation complex, and evaluation of the mechanical stimulated in vitro tendon-like tissue. The effectiveness was demonstrated by histology. The entire procedure takes less than 3 weeks. To promote extracellular matrix deposition, 4.4 mg/mL ascorbic acid was used in the stimulation culture medium. A separated chamber with a linear motor provides accurate mechanical loading and is portable and easily adjusted, which is applied for the bioreactor. The loading regime in the present protocol was 6% strain, 0.25 Hz, 8 h, followed by 16 h rest for 6 days. This protocol could mimic cell differentiation in the tendon, which is helpful for the investigation of the pathological process of tendinopathy. Moreover, the tendon-like tissue is potentially used to promote tendon healing in tendon injury as an engineered autologous graft. To sum up, the present protocol is simple, economic, reproducible and valid.

A three-dimensional uniaxial mechanical stimulation bioreactor system is an ideal bioreactor for tenogenic-specific differentiation of tendon-derived stem cells and neo-tendon formation.

쥐에서 양측 슬 개 골 힘 줄 부상 모델에서 줄기 세포 치료의 평가

요약

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아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델

아킬레스건 충돌의 기계생물학 연구를 위한 쥐 뒷다리 이식 모델

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