Name: broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
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岬-ブラジル、研究集会-ブラジル、FAP/DF の金融支援に感謝いたします。原稿の校正のため博士ヒューゴ コスタ ・ パエスに感謝しております。

1. ソリューションとメディア
<ol><li>2 X ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 媒体、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、サブロー ・ デキスト ロース ・ スープ、表 1に従ってサブロー デキスト ロース寒天培地を準備します。</li>
</ol>2. 真菌の菌の成長条件
<ol><li>必要になるまで、-80 ° c、35% のグリセロールで凍結する在庫としてすべての真菌系統を格納します。</li>
	<li>各実験の前に次の手順を実行します。<ol>
<li>カンジダ ・ アルビカンス系統。<ol>
<li>ストックのバイアルを解凍し、200 μ L をキャップと撹拌 (200 rpm) 30 ° C で一晩文化滅菌 50 mL ポリプロピレン チューブにサブロー ブドウ糖液 10 mL に転送します。チューブを傾斜し、文化のよりよい通気を少し開いてキャップを残すしてください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>クリプトコッカス ・ ネオフォルマンス系統。<ol>
<li>冷凍ストック バイアル表面をこすり。サブロー ・ ブドウ糖寒天培地プレート上に細胞をプレートし、30 ° C で 48 時間インキュベート隔離されたコロニーの目に見える成長は後に、、最大 15 日間のパラフィン フィルムで封冷蔵庫 (4 ° C) でプレートを維持します。</li>
			<li>生殖不能のつまようじまたは滅菌接種ループを用いた平板から中型の隔離されたコロニーを収集し、滅菌 50 mL の円錐管にサブロー ブドウ糖液 10 mL に接種します。撹拌 (200 rpm) 30 ° C で約 24 時間インキュベートします。</li>
			<li>24 時間培養を超えないようにします。チューブを傾斜し、よい通気を少し開いてキャップを残すしてください。常に、これは抗菌薬耐性に影響を与える重要な要因ですので、各テストの前に細胞の生育を標準化することをお勧めします。 注: 両方の菌が急速な伝播実験では、30 ° C で栽培されたが、温度を研究、たとえば臨床治療 (37 ° C) の目的を反映するように変更できます。最も重要なは、この最初の孵化時間の各真菌の分離の事前確立・再現性を確保するためのすべてのテスト全体で維持する必要があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>菌の増殖後室温で 5 分間 1,200 x g で円錐管を遠心分離によって細胞を収集します。上澄みを廃棄し、PBS の 10 mL を加えます。</li>
	<li>再懸濁します細胞と遠心分離機再び室温で 5 分間 1,200 x g で。</li>
	<li>PBS 洗浄と遠心分離をさらに 2 回繰り返します。第 3 洗浄後 2 X RPMI 1640 媒体 (ペレットのサイズ) によると 5 mL の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>1: 100 または縮尺希釈 (細胞懸濁液の濁度) に応じて遠心管に 1 mL を準備します。</li>
	<li>この希釈 10 μ L 分注検定商工会議所に配置し、顕微鏡下での 4 つのコーナー領域内のセルの合計数をカウントします。計算式で濃度: (総細胞数/4) × 希釈係数 x 104 (商工会議所希釈定数)。<ol>
<li>生存数と成長条件が検討されている分離の体系的に関連付けられた場合は、100% の生存率を検討してください。 注: 標準化と生存率のカウントの品質管理することができる抗菌感受性試験 (EUCAST) 抗真菌酵母10 最小阻止濃度 (MIC) 法に関する欧州委員会に従ってバック メッキ.</li>
		<li>場合は調査の下で分離の成長/生存率の相関関係が確立されていない、フロキシン B11、トリパン ブルーなどの死んだ細胞を選択的に色の染料の援助と検定で生きているセルをカウントすることによって菌の生存率を測定します。12、ヤヌス グリーン13か。場合にのみ、この時点の人口の生存率は 90% 以上は、このプロトコルの真菌細胞を使用します。 注: デッド/生きている染料が選択の菌とも限りません。使用する前にそれらをテストしてください。たとえば、トリパン ブルー色素はクリプトコッカスとうまく働きません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>その後、2 X RPMI 1640 培地で細胞懸濁液を準備 (2 X 調整 RPMI 1640 培地で接種)。96 ウェルのプレートは、各プレートの 5 mL の量を検討してください。<ol>
<li>C. アルビカンス株すべての 4 x 103セル/mL のストックの細胞懸濁液を準備します。この濃度は各ウェル (2 x 103セル/mL) の最終的な細胞濃度の 2 X です。</li>
		<li>クリプトコッカス菌 2 x 10 のセル4セル/mL のストック文化を準備します。この濃度 (1 × 104セル/mL) 各ウェルで最後のセル濃度 2 倍であります。</li>
		<li>他の菌濃度、培養時間に関連して特定の研究にとって理想的である知られている抗真菌剤でテストします。菌の代謝と複製の時間を考慮します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ペプチド (不明なエージェント)
<ol><li>-20 ° C で凍結乾燥させたペプチドを格納し、それらを各実験の前に脱イオン水に溶解します。一度水に溶解したストレージの最大時間は、各ペプチドの性質によって異なります。</li>
	<li>試金 (2 X) でテスト最高の最終濃度 2 倍の因数を準備します。理想的には、凍結融解サイクルを避けるために 1 つの時間の使用のための十分なペプチドの因数の数が少ないを準備します。 注: 濃度の選択は、文学とペプチドの性質に基づく必要があります。約 100 μ m、ペプチドのシリアル希薄を開始し減少するか、または得られた結果によってこの濃度範囲を増加させることをお勧めします。</li>
</ol>4. 参照抗真菌薬 (ポジティブ コントロール)
<ol><li>水で希釈したそれらのため: 分析の最高濃度の 2 X ソリューションの準備 (セクション 5 を参照してください: ステップの希釈の抗真菌の試金)。<ol>
<li>C. アルビカンス菌のフルコナゾールの 128 μ G/ml またはキャスポファンギンの 128 μ g/mL の溶液を準備します。両方のプレート濃度 64 μ g/mL になります。</li>
		<li>クリプトコッカス菌のアムホテリシン b (水溶性溶液) 32 μ g/mL の溶液を準備します。プレート濃度 16 μ G/ml になります。 注: 通常アムホテリシン B 希釈ジメチルスルホキシド (DMSO) でこの抗真菌剤は水には溶けにくいので。ただし、市販水溶性アムホテリシン B 製剤があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>有機溶剤で希釈した抗真菌薬のため: X、DMSO に原液 100 を用意し、その使用のための水で 10 倍に希釈します。 注: したがって、井戸に DMSO の最終濃度が 1% を超えてください。制御が必要ないくつかの菌類を容認しないもこの濃度、溶媒のことを考えると 1 %dmso を含んでいる媒体で菌をなるも。DMSO は感光性を覚えて、だから箔プレート カバーまたは潜伏期間の持続期間のための暗い部屋に配置。</li>
</ol>5. 抗真菌アッセイ
注: In vitro抗真菌アッセイがいくつかの変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性試験に基づいて実行されます。
<ol><li>各ペプチドが 2 倍連続希釈を準備し、50 μ L の最終巻にポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートで抗真菌薬を制御します。<ol>
<li>最高の 2 倍の濃度で抗真菌剤/ペプチドの 100 μ L 必要な列に最終濃度 1-3、行内 A. 追加ピペットを使用して</li>
		<li>マルチ チャンネル ピペットを使用して、行 B h で、他の井戸に 50 μ L の滅菌水を追加します。</li>
		<li>最高濃度 (行 A) と井戸の 50 μ L を削除、次の濃度 (B 列) の次に移し、均質化します。</li>
		<li>最低濃度で井戸まで上記の手順を繰り返して、この井戸 (列 H) の 50 μ L を廃棄します。水だけで空のコントロールまたは負/成長コントロールのいずれかを列 11、12 (行 A、B、C) を残します。</li>
		<li>(1-3 列と列 11 (負/成長制御)); 各ウェルに RPMI 1640 中調整接種 × 2 の 50 μ L を追加します。C. albicansの最終濃度になり 2 x 103セル/mL、最終濃度クリプトコッカス菌 104セル/mL になります。</li>
		<li>空白のコントロールを準備 (50 μ L の水 + 50 μ L 2 セルなし X RPMI 1640 媒体) 負/成長制御 (50 μ L 水 + 抗真菌薬なし 50 調整 μ L 接種 2 X RPMI 1640 媒体) と記載されている上記のウェル プレートに負荷。</li>
	</ol>
</li>
	<li>テストするそれぞれの化合物のプロシージャは、選択した抗真菌コントロール (4-10 列) を繰り返します。 注: シリアル希薄することができる垂直方向に、下の実験としてまたは水平方向 (すなわち、与えられた化合物/抽出テストする必要があるの希釈液の数が 8 個以上場合) のプレートに。<ol>
<li>化合物を参照する場合薬、またはそのコンポーネントのいずれかが感光性、削減された光でアッセイを行う、箔、板をカバーまたは孵化中に暗い部屋に配置。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次のオプションの推奨事項を検討してください。<ol>
<li>蒸発を削減とガス交換を許可する明確なカバー プレートとプレートをシールします。</li>
		<li>プレートが、湿気のある商工会議所;それも蒸発を減らすのに役立ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クリプトコッカスの揺れ 200 rpm 37 ° c 24 時間または 48 h 48 h、 c. アルビカンス株すべての版を孵化させなさい。最終的な音量 (100 μ L) により、波及効果が発生しません。 注: 有意差が認められなかった 24 h でマイク測定値とC. albicansの緊張のための 48 時間の間。それにもかかわらず、48 時間の測定値は、視覚化やすくなっています。</li>
	<li>潜伏期間前後倒立光学顕微鏡の援助と汚染の兆候を確認する同様の形態変化を確認するすべての井戸を観察します。 注: 読みすることができます視覚的に行うし、実験の終わりに撮影します。読む前にプレートを少しホモジナイズしてください。読み取りは、600 の外径を測定することによっても実行できます nm、細胞塊またはフィラメント現象は観察されていません。</li>
	<li>別の日に少なくとも 3 回の実験を実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

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希釈テスト目標化合物、化合物の少量を使用して潜在的な抗真菌活性を解析したり、同時に濃度の範囲でそれをテストします。したがって、潜在的な新規抗真菌化合物のスクリーニングの最初のステップとしては、このプロトコルの使用をお勧めします。ここで提示されたプロトコルは、抗真菌療法診療所の選択を支援するために設計、M27 A3 プロトコルに基づいており、さまざまな新しい抗...

真菌感染症となっている重要な医学的関心最近数十年でがん治療と HIV/エイズとともに生きる人の受診者など免疫不全の個体数の増加を主因は増大したことや臓器1,2を移植しました。ただし、使用可能な抗真菌薬の非常に限られた配列とそれらにカビ抵抗性の報告数の増加が全身性真菌症3の治療法に関する主要な問題に貢献します。
新規抗真菌化合物の潜在的なソースは、抗菌ペプチド (アンペア)、感染4彼らの生得の免疫反応の一部として多くの生物によって生成される小さなカチオン性ペプチドです。それにもかかわらず、真菌病原体に対するこれらの化合物をテストするスクリーニング法は標準化されていません。異なったプロシージャは、時に同じモデル微生物5,6,7アンペアの抗真菌活性を評価するために使用されています。これらの相違点といくつかのプロトコルの細部の欠乏は、化合物とフラワーの再現性比較を複雑にします。
新しい薬剤の候補者の試験を標準化する方法の 1 つは、臨床などの臨床現場における抗真菌薬感受性を定義するために使用し、実験室標準研究所 (CLSI) M27 A3 のガイドラインに従うことです。ただし、これらの抗真菌薬感受性試験が厳しすぎると考慮しない代謝の変化を考察種類を渡って、彼らはのみいくつかの [エージェントの確立されました。たとえば、とることはありません考慮非発酵性酵母の代謝の必要な。
このプロトコルにより、将来の抗真菌活性物質の活動の評価と抗真菌ペプチドの検索ここに実装されています。それは、新しい化合物8,9のスクリーニングを最適化修正 CLSI M27 A3 ガイドラインからスープ希釈感受性テストに基づいています。これらの変更はコントロールとして参照を抗真菌薬の使用で結果を標準化しながら、最適の事前テスト成長少量化合物の温度や初期とさまざまなメディアでのバリエーションの使用を許可します。ウェル培養皿の使用で、このメソッドでは、画面多数の化合物の迅速かつ確実に可能です。
その固有の柔軟性のため化合物のいくつかの適応で、他の微生物に対する別の化学の授業でこのプロトコルを使用することができます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media and Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino) propane sulfonic acid&lt;em&gt; (MOPS) (o que a gente usa tem um s&amp;oacute;dio, completa o nome dele please)&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Use to buffer 2X RPMI medium</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Din&amp;acirc;mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% for (solu&amp;ccedil;&amp;atilde;o de estoque? Criopreserva&amp;ccedil;&amp;atilde;o?)</td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td>Para dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o das drogas na dilui&amp;ccedil;&amp;atilde;o seriada</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antifungal drugs&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plastics&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Dish petri</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Solution Reservoir</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment and other materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugue</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Set to 37&amp;deg; C</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Set to 37&amp;deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Cell counting chamber, Neubauer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

真菌感染症になっている最後の十年の重要な医療条件ですが使用可能な抗真菌薬の数は限られています。このシナリオでは、新しい抗真菌薬のサーチが必要です。ここで報告されるプロトコルは、抗真菌薬のプロパティの画面のペプチドにメソッドを詳しく説明します。それは潜在的な新しい抗真菌薬としての抗菌ペプチドの研究に合わせて変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性テストに基づいています。このプロトコルは、抗真菌化合物の活性を評価する機能の試金を記述および調査の下の分子の特定のクラスに合わせて簡単に変更可能性があります。法は、少量を使用して 96 ウェル プレートで実行される、大規模スクリーニングは、特に場合は、自動設定で実施時間の短時間で完了できます。この手順では、標準化された、調節可能な臨床プロトコルが真菌症の治療を改善するために新しい分子のベンチ作業の追求を助けることができる方法を示しています。

マイクは、潜伏期間の終わりに目に見えるカビを完全に阻害する最も低い抗菌化合物の濃度として定義されます。任意も濁度負/増殖制御井戸に似ていますが、明確なメディア空井戸のようで、よくは肯定的な結果を考慮この議定書の目的は画面の潜在的な抗真菌薬の高速メソッドを持っているため、否定的な考え。ただし、指定されたアンプは菌や殺菌するかどうか...

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Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

抗真菌化合物をスクリーニングするための簡単と適応のスープ微量液体希釈法。

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

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Research

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Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

18.8K ビュー.  University of Brasília. 抗真菌化合物をスクリーニングするための簡単と適応のスープ微量液体希釈法。

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

免疫・感染学

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

生物工学

Measuring Volatile and Non-volatile Antifungal Activity of Biocontrol Products

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental stages. A specified number of spores are spread on an agar plate. This agar plate is incubated for a defined period to allow the fungi to reach the expected developmental stage, except for spores where incubation is not required. Agar plugs covered by spores, hyphae, or mycelium are next withdrawn and transferred onto agar media containing the antifungal compound to be tested either placed at a distance from the fungi or in contact. This method is applicable to test both liquid extracts and solid samples (powders). It is particularly well suited for quantifying the relative contributions of volatile and non-volatile agents in bioactive mixtures and for determining their effects, specifically on spores, early hyphae, and mycelium.
The method is highly relevant for the characterization of the antifungal activity of biocontrol products, notably plant-derived products. Indeed, for plant treatment, the results can be used to guide the choice of mode of application and to establish the trigger thresholds.

We describe a modified agar-based method designed to quantify the antifungal effects of plant-derived products. Both volatile and non-volatile contributions to the antifungal activity can be assessed through this protocol. In addition, efficacy against fungi can be measured at key developmental stages in a single experimental setup.

バイオコントロール製品の揮発性および不揮発性抗真菌活性の測定

The protocol described is based on a plug-transfer technique that allows accurate determination of microorganism quantities and their developmental ...

環境学

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法<em&gt;インビトロ</em好気的に成長する細菌の&gt;感受性試験

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation on implanted devices or catheters, which is associated with increased virulence and mortality. Biofilms produced by different Candida species exhibit enhanced resistance against various antifungal drugs. Therefore, there is a need to develop effective immunotherapies or adjunctive treatments against Candida biofilms. While the role of cellular immunity is well established in anti-Candida protection, the role of humoral immunity has been studied less.
It has been hypothesized that inhibition of biofilm formation and maturation is one of the major functions of protective antibodies, and Candida albicans germ tube antibodies (CAGTA) have been shown to suppress in vitro growth and biofilm formation of C. albicans earlier. This paper outlines a detailed protocol for evaluating the role of antibodies on biofilms formed by C. tropicalis. The methodology for this protocol involves C. tropicalis biofilm formation in 96-well microtiter plates, which were then incubated in the presence or absence of antigen-specific antibodies, followed by a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) assay for measuring the metabolic activity of fungal cells in the biofilm.
The specificity was confirmed by using appropriate serum controls, including Sap2-specific antibody-depleted serum. The results demonstrate that antibodies present in the serum of immunized animals can inhibit Candida biofilm maturation in vitro. In summary, this paper provides important insights regarding the potential of antibodies in developing novel immunotherapies and synergistic or adjunctive treatments against biofilms during invasive candidiasis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms

A 96-well microtiter plate-based protocol using a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reduction assay is described herein, to study antibodies' effects on biofilms formed by C. tropicalis. This in vitro protocol can be used to check the effect of potential new antifungal compounds on the metabolic activity of Candida species cells in biofilms.

カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

Candida species are the fourth-most common cause of systemic nosocomial infections. Systemic or invasive candidiasis frequently involves biofilm formation ...

An In Vitro Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilm

Source: Chandley, P., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64425">A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates an in vitro technique to study the effect of antibodies on fungal biofilms. The pathogenic fungus Candida tropicalis secretes a virulence factor secreted aspartyl proteinase 2 (Sap2), facilitating biofilm formation. Upon introducing a heat-inactivated serum containing Sap2-specific antibodies that inhibit biofilm maturation, the viability of the fungal cells is assessed using a chromogenic assay.

Candida tropicalis Biofilmに対する抗体の影響を評価するためのIn vitroアッセイ

1. C. tropicalis&#160;biofilm formation

	Prepare&#160;Candida&#160;biofilms in a 96-well flat-bottomed polystyrene microtiter plate as described earlier ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

抗体ベースの技術

特性評価と機能分析

An In Vitro Broth Microdilution Assay for the Screening of Antifungal Compounds

Source: de-Souza-Silva, C. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57127">Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates an in vitro assay to screen antifungal compounds using a broth microdilution assay. Test compounds are serially diluted in a microtiter plate and incubated with a fungal inoculum. Post-incubation, the plate is examined for wells without visible fungal growth to assess the antifungal potential of the test compounds and their minimum inhibitory concentration (MIC).

抗真菌化合物のスクリーニングのためのIn vitroブロス微量希釈アッセイ

1. Solutions and Media

	Prepare 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, phosphate-buffered saline (PBS), Sabouraud dextrose broth, and ...

免疫診断

In Vitro および In Vivo モデル

Real-Time Assessment of the Antifungal Activity of Primary Human Immune Cells

Source: Brunel, S. F. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55444">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a>J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates live cell imaging for the analysis of antifungal activity in human neutrophils using fluorescent Aspergillus reporter conidia. Initially, both red and magenta fluorescence are detected within neutrophils, while red fluorescence decreases over time, indicating the degradation of conidia and confirming the antifungal activity of neutrophils.

初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

細胞免疫診断

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

Source: Zheng, X., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55273">System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

ブロス中のマイコバクテリアに対する試験化合物の有効性の評価

1. Bacterial Strain and Growth Medium

	Make albumin dextrose and salt stock solution (ADS) by solubilizing 25 g of bovine serum albumin, 10.0 g of ...

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

要約

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ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（カルシウム BChip）

バイオコントロール製品の揮発性および不揮発性抗真菌活性の測定

ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム

カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

Candida tropicalis Biofilmに対する抗体の影響を評価するためのIn vitroアッセイ

抗真菌化合物のスクリーニングのためのIn vitroブロス微量希釈アッセイ

初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

ブロス中のマイコバクテリアに対する試験化合物の有効性の評価

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

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ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法

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カンジダ・トロピカリス・バイオフィルムに対する抗体の効果を評価するための可溶性テトラゾリウムベースの還元アッセイ

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