この作品は、サウス·テキサス·技術経営（POCrr 2009.041）、研究資源のナショナルセンター（UL 1RR025767）から医学と科学の統合のための研究所からの補助金によって、歯科·頭蓋顔面研究所国立研究所（から一部で賄われていた5R21DE017294）。

1。官能スライドの準備<ol><li>取り外し可能なスライドラックに顕微鏡スライドを配置し、99％エタノール（組織学的悪性度）を含む染色瓶に浸漬することにより2回洗浄する。スライドは、圧縮窒素ガスのジェットを使用して、ペーパータオル（紙粉を生成しないように確保）、および乾燥を使用して拭いてください。 </li></ol> 注：それは上質紙の塵を生成するようにスライドを拭くためにキム·ワイプを使用しないでください。 <ol start="2"><li>室温で一晩濃硫酸とインキュベートで満たされた染色瓶にスライドを含むスライドラックを浸します。 </li></ol> 注：濃酸と有毒で腐食性の化学薬品での作業中に皮膚との接触を避けるため、耐薬品性手袋や安全ゴーグルを使用しています。 <ol start="3"><li> 30分間、スライドを超音波処理し、30分間のMilli-Q（MΩ18）水で洗浄し、内の別の洗浄に従う5分間cetone。この治療法は、ガラス表面のシラノール基を公開します。 </li><li>コー​​ト30分間APTESのスライドラックを浸漬し、3 - アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）溶液の2.5％（水中vol / vol）を、クリーンなスライド、15分各洗浄のためにMilli-Q水で3回洗浄し、ベーキング110℃炉内でスライド℃で15分間。ベーキングは、表面の-NH2機能化、その結果、APTESの架橋ができます。 </li></ol> 注：ガラス容器の壁に優先的にAPTES預金以来、プラスチック容器にAPTESのソリューションを作成します。 <ol start="5"><li> 1％（トルエン中wt / vol）の疎水性コーティング6の単層を達成するために、ポリスチレン-コ-無水マレイン酸（PS-MA）（Sigma社製）で被覆スライドを、スピンコーターを用いて。 30秒のために3,000 rpmでスピンコーターとコートに搭載された清浄なガラススライド上にPS-MAの2.0 mLを加える。これらの条件は、そのようなコーティングとしてスピンコーティングのパラメータに基づいて異なる場合がありますlution、基板、コーティングの厚さは、次の式（7）によって支配さ</li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq1.jpg" /> hはフィルムコーティングの厚さであり、eは蒸発率、η、C、ρはそれぞれ、塗布液の粘度、濃度と密度であり、ωは角速度である。 注：ヒュームフードの長い時間と使用するための吸入時にトルエンが有害であることをお勧めします。 <ol start="6"><li> 8℃ - スライドは2で、乾燥した無塵の条件で一ヶ月までのスライドラックに格納することができます</li></ol> 2。酵母の接種とコラーゲンのカプセルの調製<ol><li> Cの一晩培養を準備します。 Cの単一コロニーを接種することにより液体培地、酵母ペプトンデキストロース[10 g / Lの酵母エキス、20グラム/ Lペプトン及び20g / LデキストロースYPD]のカンジダ菌株SC5314、 アル10にbicans - YPD 8の20 mLの。 30℃で一晩 - オービタルシェーカー（200 rpmで約150）の文化をインキュベートします。 10mMリン酸緩衝液、2.7 mMの塩化カリウム、、収穫一晩YPD培養液から1 mLのカンジダ酵母細胞（5〜10分間5,000 rpmで遠心分離することによって）、滅菌リン酸1mL中に10分間2回洗浄するには（PBS緩衝生理食塩水洗浄ごとに137 mMの塩化ナトリウム、pH7.4）中（シグマ）。収穫は10分間1900 rpmで遠心分離することによっても、細胞を洗浄した。 1 mLの再建バッファー（2.2％と0.2 NのNaOH溶液（wt / vol）の重炭酸ナトリウムと4.8％（wt / vol）のHEPES、pH7.2）中で洗浄した細胞を再懸濁します。 </li></ol> 注：C.カンジダは、リスクグループ1/BSL1微生物である。常に、この微生物と作業のために良い無菌/滅菌技術を使用して、バイオハザード物質の適切な処分のための制度の手続きに従うことを覚えています。 <ol start="2"><li> hemocytを用いて細胞数を数える明視野顕微鏡でometerと5の細胞密度×10 7細胞/ mLに調整します。 </li><li>さらに10の添加により懸濁液を10倍希釈×RPMI-1640、L-グルタミンおよびモルホリン（MOPS）酸（pH7.2）で緩衝。 </li><li>コラーゲン（1.8 mg / mL）を含むRPMI-1640で細胞懸濁液を混合することによってコラーゲンの酵母細胞をカプセル化した（ラットの尾からタイプ1、BD Biosciences社、ベッドフォード、MA）は、/ 4の最終濃度×10 6個の細胞を得るためにmLである。印刷前にコラーゲンのゲル化を防ぐために氷の上でコラーゲン細胞懸濁液を保持します。 </li></ol> 3。 カルシウム BChipの調製<ol><li>きれいにし、70％イソプロパノールで拭いソースプレート駅、洗浄と真空ステーション、真空スライドの盛り合わせや印刷室を含むマイクロアレイの全ての表面を、消毒。 </li><li>マイクのスライドデッキにPS-MA-コーティングしたガラススライドを、所望の数を配置し、真空で保持するroarrayer。 </li><li>積極的にコラーゲンの渦細胞懸濁液を、単に印刷する前に、96ウェルプレートのウェルによく混合した懸濁液100μLを吸引除去する。ローディングステーションで、このソースプレートを配置します。 </li><li>印刷工程全体のマイクロアレイチャンバ内で100％の相対湿度を維持するために、加湿器のスイッチをオンにします。 </li><li>円錐テーパー190​​μmのオリフィスセラミックチップを使用して非接触蒸着法によりマイクロアレイスポッター（Omnigridマイクロ、Digilab株式会社ホリストン、MA）を使用して、1.2ミリメートル間隔をあけスポットで48行と16列の配列内の細胞懸濁液を50 NLを印刷（Digilab）。 </li><li>首相は、印刷の各ラウンドの後に二回のヒントを、洗浄し真空乾燥させます。 </li><li>印字直後、気密、加湿チャンバー（ハイブリダイゼーションカセット、ArrayIt株式会社サニーベール、カリフォルニア州）でスライドを配置し、37℃でバイオフィルムの形成を可能にするため、24時間インキュベートします。 </li></ol> 4。 Prの感受性試験抗真菌剤に対するCaの BChipでeformedバイオフィルム<ol><li>抗真菌薬の原液または粉末から、RPMI-1640培地中での作業溶液を調製する。ワーキングソリューションの典型的な最大濃度は、フルコナゾールのために1024μg/ mLで、アムホテリシンB 5の16μg/ mLである。他の濃度が異なるエージェントに使用することができます。 </li><li>真ん中の化合物の推定IC 50を含む範囲をスパニング、2倍希釈で原液を希釈することにより、化合物の8つの異なる濃度を準備します。 </li><li>バイオフィルムの成長の24時間後、少なくともでは、プラス（メディアのみで無薬剤、すなわち細胞）とマイナス（20分間次亜塩素酸ナトリウム処理）コントロールと共に、薬物の8つの異なる濃度の50 NLを印刷するためにマイクロアレイを使用し6は、バイオフィルムの上に複製されます。 </li></ol> 注：追加しながら、スポットの乾燥を防ぐために100％の相対湿度を維持薬を優先します。 <ol start="4"><li>すぐに薬を追加した後、24時間、37℃で加湿チャンバー内での薬剤とチップをインキュベートします。 </li><li> PBSで毎回2分間3-5回をCaBChipをダンクで薬を洗い流し、37で0.5μMfun1の℃で30分間9 Cとカルシウム BChipをインキュベートすることにより染色。 </li><li> 1〜3分ごとにダンクシュートをPBS中の Ca BChip 3-5回をダンクではオフに染色し、窒素気流を使用してCA BChipを乾燥させ洗浄します。 380のPMTゲインを持つ532nmの波長でのマイクロアレイスキャナ（GenePix 4100A、アクソンインスツルメンツ、CA）を使用して蛍光強度を読み取る。 </li><li>陽性対照（無薬剤）と100％と0％で死んだ（漂白処理）バイオ·スポットの蛍光強度は、それぞれを設定します。 </li><li>次の式を使用して、制御点の平均値からの相対蛍光強度（F）の減少によって阻害率を決定する</li></ol><img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/3845/3845eq2.jpg" /> ここで、F、F maxとF oは 、それぞれの薬剤処理、無薬物コントロールと漂白処理されたスポットの生の蛍光強度である。スキャナの設定はそれぞれF maxと30000 4000 RFUのF oを取得するために調整されました。 <ol start="9"><li>グラフパッドプリズムソフトウェア（カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して可変スロープヒル式をフィッティングすることにより50％阻害濃度またはIC 50を計算します 。 </li></ol> 5。代表的な結果 48で構成される代表的なカルシウムBChip、×Cのナノバイオフィルムの16列の配列カンジダは、 図2に示されています。明視野顕微鏡は、ナノバイオフィルムの全体的な建築の特徴を示しています。菌糸があるのマトリックス内に埋め込まれているバイオフィルムショーの走査型電子顕微鏡画像直径約2μmと100 nmであるコラーゲン繊維は、それぞれ。 fun1の染色マイクロアレイスキャナー画像は、真菌バイオフィルムの特徴である酵母と菌糸の形態を示しています。 fun1の染色バイオフィルムの2Dおよび3D共焦点蛍光画像は、細胞外マトリックス（によっても製造exopolymeric材料の封止材料と最も可能性が高いとコラーゲンから成る内に散在して代謝活性を有する細胞の領域で、空間的な異質性を持つように見ることができます代謝染料で染色されていないバイオフィルム細胞）。バイオフィルムの厚さは約50μmであると推定された。 カルシウム BChipは二つの薬、フルコナゾールやアムホテリシンBの抗真菌薬感受性を推定するために使用し、その結果を図3に示されています。業界標準96ウェルプレートアッセイでパブリッシュされたレポートと一致して、バイオフィルムはフルコナゾール10と計算したIC 50に対して耐性がある<html>アムホテリシンBは、0.3μg/ mLで11です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig1.jpg" /> カルシウム BChipの製造のために図1のフローチャート。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3845/3845fig2.jpg" /> 図2印刷高thoughput カルシウム BChipの画像がロボットのマイクロアレイを使用してPS-MA-コーティングしたスライド上の768箇所を含む。各半球のスポットは、直径約700μmであり、スポット間の1.2ミリメートルの分離と、そのボリュームに50 nLのです。また、（時計回り）に示す光学顕微鏡、マイクロアレイスキャナ、2Dと3D-蛍光顕微鏡、 および Ca BChip上の個々のバイオフィルムの電子顕微鏡画像をスキャンしている。 25000 xの高倍率でのSEMの図は、幅2μmの菌糸フィラメントを示しています。 図3 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/3845/3845fig3.jpg &quot;/&gt; 図3 の Ca BChipを使用して、（A）フルコナゾールと（B）アムホテリシンBのIC 50値の抗真菌薬感受性試験と測定の結果。アムホテリシンB投与バイオフィルムの蛍光顕微鏡画像は、（C）に示されています。結果は平均±10を含む2つの別々のチップの標準誤差の平均は、それぞれの条件を複製します。

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	<li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals:+a+three-year+analysis.">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li><li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms.">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li><li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip.">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li><li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans.">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li><li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing.">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li><li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays.">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li><li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning.">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li><li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms.">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li><li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans:+Development,+architecture,+and+drug+resistance.">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li><li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+biofilms+and+drug+resistance.">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li><li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+activity+of+amphotericin+B,+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases.">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li></ol>

ホセL.ロペスリボーと抗真菌剤を開発していますMicrobeHTS Technologies、Inc。のでアナンドK. Ramasubramanian自己資本。 MicrobeHTSテクノロジーズ社は、これらの研究のための財政的支援を提供しなかった。

我々は、 カンジダ·アルビカンスバイオフィルムのナノリットルボリュームで構成されるセルベースの高密度マイクロアレイは、Ca BChipを開発しました。マイクロアレイは、非拡散、半球状3Dゲルのために必要な疎水性を提供しながら、コラーゲンゲルスポットの堅牢な添付ファイルで許可される変更されたガラス基板上に印刷された。 単一のCA BChipは約8、96ウェルプレー...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 3 - アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 440140 </td></tr><tr><td>ポリスチレン - コ - 無水マレイン酸（PS-MA） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 426946 </td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-549-3 </td></tr><tr><td>ラット尾コラーゲンI型</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354236 </td></tr><tr><td>ロボットのマイクロアレイ</td><td> Omnigridマイクロ</td><td> MICROSYS4000/4100A </td></tr><tr><td>マイクロアレイスキャナ</td><td> Genepix個人4100A </td><td> GENEPIX4100A </td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションカセット</td><td> ArrayIt株式会社</td><td> AHCXD </td></tr><tr><td> fun1の[2 - 塩素RO-4-（2,3 - ジヒドロ-3 - メチル - （ベンゾ-1,3 - チアゾール-2 - イル） - メチリデン）-1 - フェニルquinoliniumiodide] </td><td>インビトロジェン株式会社</td><td> F-7030 </td></tr><tr><td>フルコナゾール</td><td> Sicor製薬株式会社</td><td> J02AC01 </td></tr><tr><td>アムホテリシンB </td><td>シグマ</td><td> A2411 </td></tr><tr><td> RPMI-1640 </td><td>メディアテック株式会社</td><td> 50から020-PC </td></tr><tr><td>セラミックチップ190μmのオリフィス</td><td> Digilab </td><td> 60020441から00 </td></tr><tr><td>グラフパッドプリズムソフトウェア</td><td>グラフパッドソフトウェア株式会社</td><td></td></tr><tr><td> GenepixプロV4.1 </td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm chip (cabchip) for high-throughput antifungal drug screening

カンジダ·アルビカンスは現在、米国の病院1の第四の最も一般的な院内血流感染を表すカンジダ症の主な病因物質が残ります。これらの日和見感染症は、標的の個人の増加のために成長して脅威を与えると、容認できないほど高い死亡率を運ぶ。これは、抗真菌薬の限られた武器にだけでなく、最も一般的に使用される抗真菌剤に対する耐性の出現に起因する部分である。さらに治療を複雑にしてカンジダ症の症状の大部分がバイオフィルムの形成に関連付けられているという事実であり、これらのバイオフィルム内の細胞は、最も臨床的に使用される抗真菌剤2に対する抵抗性のレベルの増加を示しています。ここでは Cで構成され、高密度マイクロアレイの開発を記述する我々 は 、Ca BChip 3名前を付けて アルビカンスナノバイオフィルム、。簡単に言うと、ロボットのマイクロアレイは、t使用されますCのOプリント酵母細胞固体基板上にカンジダ 。印刷中に、酵母細胞は、50 nLのように低く、適切なコーティングを施したガラス基板上に固定化されたボリュームを用いた3次元マトリックスで囲まれています。最初の印刷後、スライドはバイオフィルムの開発を可能にするために24時間37℃でインキュベートする。この期間中にスポットが成熟したC.に関連付けられている典型的な構造と表現型の特性を表示し、完全に開発した&quot;ナノバイオフィルム&quot;に成長albicansのバイオフィルム（ すなわち形態の複雑さ、三次元アーキテクチャと薬剤耐性）4。全体としては、Ca BChipは〜750と同等と空間的に別個のバイオフィルムから構成され、複数のチップを印刷して同時に処理することができる付加的な利点である。細胞の生存率は、fun1の代謝の蛍光強度マイクロアレイスキャナーを用いて染色を測定することによって推定されています。この菌のチップは、理想的にはuのに適しています抗真菌薬創薬のための真のハイスループットスクリーニングにおけるSE。現在の規格（ すなわち、バイオフィルム形成5の96ウェルマイクロタイタープレートモデル）に比べ、菌のバイオチップの主な利点は、自動化、小型化、量と試薬と分析時間のコストの節約だけでなく、労働の撤廃です。集中的な手順を実行します。我々はこのようなチップが大幅に抗真菌薬の創薬プロセスをスピードアップすると確信しています。

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Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

我々は3次元ナノバイオフィルムから成る高密度マイクロアレイプラットフォームを開発しました<em&gt; C.カンジダ</em&gt;と呼ばれる<em&gt; Caの</em&gt; BChip。上でテスト薬剤の感受性プロフィール<em&gt; Caの</em&gt; BChipは、真菌チップは理想的な抗真菌薬の真のハイスループットスクリーニングに適していることを示唆し、従来の96ウェルプレートモデルに匹敵するものです。

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

candida-albicans-biofilm-chip-cabchip-for-high-throughput-antifungal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

13.6K ビュー.  University of Texas at San Antonio. 我々は3次元ナノバイオフィルムから成る高密度マイクロアレイプラットフォームを開発しました C.カンジダと呼ばれる Caの BChip。上でテスト薬剤の感受性プロフィール Caの BChipは、真菌チップは理想的な抗真菌薬の真のハイスループットスクリーニングに適していることを示唆し、従来の96ウェルプレートモデルに匹敵?...

ビデオ: Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation 3を用いてTRPチャネルの機能のハイスループットスクリーニングへの媒体のためのセルベースカルシウムアッセイ

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

生物工学

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoautoの使用：ハイスループット自動クライオ電子断層撮影のためのプロトコル

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

医療機器のための細菌撥ポリマーのハイスループット同定

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these procedures in basic research and preclinical drug development, it is important to develop protocols for automated generation and analysis under standardized conditions. Here, we present a technique to generate engineered heart tissue (EHT) from cardiomyocytes of different species (rat, mouse, human). The technique relies on the assembly of a fibrin-gel containing dissociated cardiomyocytes between elastic polydimethylsiloxane (PDMS) posts in a 24-well format. Three-dimensional, force-generating EHTs constitute within two weeks after casting. This procedure allows for the generation of several hundred EHTs per week and is technically limited only by the availability of cardiomyocytes (0.4-1.0 x 106/EHT). Evaluation of auxotonic muscle contractions is performed in a modified incubation chamber with a mechanical interlock for 24-well plates and a camera placed on top of this chamber. A software controls a camera moved on an XYZ axis system to each EHT. EHT contractions are detected by an automated figure recognition algorithm, and force is calculated based on shortening of the EHT and the elastic propensity and geometry of the PDMS posts. This procedure allows for automated analysis of high numbers of EHT under standardized and sterile conditions. The reliable detection of drug effects on cardiomyocyte contraction is crucial for cardiac drug development and safety pharmacology. We demonstrate, with the example of the hERG channel inhibitor E-4031, that the human EHT system replicates drug responses on contraction kinetics of the human heart, indicating it to be a promising tool for cardiac drug safety screening.

Here, we show the generation of human engineered heart tissue from induced pluripotent stem cells (hiPSC)-derived cardiomyocytes. We present a method to analyze contraction force and exemplary alteration of contraction pattern by the hERG channel inhibitor E-4031. This method shows high level of robustness and suitability for cardiac drug screening.

心臓医薬品安全性スクリーニングのための人間エンジニア心臓組織の自動収縮分析

Cardiac tissue engineering describes techniques to constitute three dimensional force-generating engineered tissues. For the implementation of these ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Applications for Open Source Microplate-Compatible Illumination Panels

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well as large-scale high-throughput screening (HTS) campaigns. Though laboratory automation has greatly increased the utility of microplates there remain instances where automation-based instrumentation is not feasible, cost-effective or compatible with microplate formatting needs. In these cases, microplates must be manually prepared. Problematic to manual microplate manipulations is that a number of difficulties can arise pertaining to the accurate tracking of sample operations, data record keeping and quality control (QC) inspection for well artifacts or formatting errors. As microplate well densities increase (i.e., 96-well, 384-well, 1536-well) the potential for introducing errors also drastically increases.&#160; Moreover, for small bench-top laboratory operations there exists a need to improve the ease and accuracy of sample handling in a cost-effective fashion. Herein, we describe a system that acts as a semi-automated pipetting guide referred to as the Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.). &#160;M.A.P.L.E. has multiple uses for supporting compound hit-picking and microplate preparation for assay development in high-throughput screening or laboratory benchtop operations, as well as QC/quality assurance (QA) diagnostic evaluation of microplate quality or visualizing well formatting errors.

Microplate Assistive Pipetting Light Emitter (M.A.P.L.E.) is a computer-driven device that systematically illuminates microtiter wells to provide guidance for the manual preparation of microplates.&#160; M.A.P.L.E. improves the accuracy of microplate preparation while automating data recordkeeping. &#160;In addition, it can assist with examining microplate quality or aid in the detection of errors.&#160; &#160;

オープンソースマイクロプレート互換照明パネルのアプリケーション

Microplates are commonly used in the modern laboratory environment for a wide variety of tasks both in small-scale laboratory benchtop operations as well ...

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（ カルシウム BChip）

ハイスループット抗真菌薬スクリーニングのためのカンジダバイオチップ（カルシウム BChip）