Name: use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
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この作品の交わりに支えられて s. h. a.NIH/NCATS (TL1TR001104) からウェルチ財団 (I-1827) を与えるし、Z.W. Z.W. に日の出 (RGM120502A) から R01 グラントはテキサス州学者の研究所 (R1222) やがん予防医学研究のバージニア マーチソン リンシカム学者。

1. 試料を準備します。
<ol><li>2 x 10 の文化6アミロイド 10 ml のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清とペニシリン-ストレプトマイシンを含む 10 cm 培養皿に HT 29 大腸がん細胞を生産します。培養細胞は、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩します。<ol>
<li>セルは、80% の confluency に成長後は、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 ml セルを洗浄しています。トリプシン溶液 3 mL を追加し、3 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>セルはお皿から完全解離後培地 10 mL を追加し、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットで細胞を転送します。室温で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心します。培地を吸引を 5 mL の培地、細胞を再懸濁します、携帯カウンターを使用してセルをカウントします。それぞれ 2 つの 10 cm 料理のプレート 2 x 106セルです。</li>
		<li>細胞が接着し、5% CO2と 37 ° C のインキュベーターで一晩回復を許可します。一皿 20 ng/ml の腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、100 nM Smac 擬態と 20 μ M 汎カスパーゼ阻害剤 Z VAD FMK11アミロイドの形成を誘導するために治療を適用します。組み合わせはチーリンと省略されます。コントロールとして車両と他の料理を扱います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>適切な期間後 6 h 通常細胞ライセートの収穫します。<ol>
<li>プラスチックのスクレーパーとプレートから細胞をこすり、15 mL の円錐管に 10 mL のピペットを使用します。4 ° C で 3 分間 1,000 x g で細胞を遠心分離します。</li>
		<li>10 mL の氷冷 PBS に再、4 ° C で 3 分間 1,000 × g で遠心分離によってセルを洗浄して 2 回PBS ソリューションを吸い出しなさい。 注: プロセスをここで休止して細胞ペレットを液体窒素で凍結し、˗80 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブに細胞ペレットを転送し、0.3 mL の氷の上で 30 分間溶解バッファーで孵化させなさい。4 ° C で 15 分間 20,000 × g で遠心します。上清は全細胞ライセートです。 注: プロセスは、-20 ° c で数ヶ月にサンプルを格納することによってここで休止できます。</li>
		<li>製造元のプロトコルに従ってブラッドフォードの試金蛋白質濃度を測定します。4 x 20 μ 3 μ g/μ L のサンプルを準備し、10 分間室温でインキュベート SDD 時代読み込みバッファーを追加します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 準備し、ゲルを実行
<ol><li>寒天 2 g を 200 mL のガラス製ビーカーで agarose を溶かし、電子レンジで加熱 1 x トリス酢酸バッファー (TAE) に追加します。最終濃度 0.1 %sds の 20 %sds の 1 mL を追加します。慎重に混合旋回します。SDS 添加後泡を生成しないように注意してください。</li>
	<li>15 cm × 14 cm ゲル平板にアガロース溶液を注ぐ。1 mL ピペットを使用して任意の気泡を除去します。1 つの 20 も櫛を上部に配置します。</li>
	<li>まず寸法: ピペット 60 μ g の全細胞ライセート一番右車線で。(染料のフロントはゲルを通って約 ¾) まで約 4 時間 60 V でゲルを実行実行バッファーとして 0.1 %sds を含む TAE を使用します。</li>
	<li>2 番目の寸法: 慎重回転させるとゲル 90 ° 反時計回り (図 2A)。約 4 時間の 60 V でゲルを実行します。 注: 一般的な走行条件は 4 V/cm のゲルの長さです。実行条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることが重要です。</li>
</ol>3. 転送
<ol><li>ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜 (図 2B) に蛋白質を転送するための毛管転送メソッドを使用します。<ol>
<li>転送バッファーの 500 の mL を追加し、約 20 cm × 20 cm のコンテナー。コンテナーの横にあるペーパー タオルの 5 cm 高スタックを確認します。スタックの先頭の表面積は、ゲルの大きさよりも大きくなければなりません。</li>
		<li>転送バッファーの 14 cm x 15 cm のフィルター ペーパーを浸し、紙タオルのスタック上に配置。しわや気泡がない紙の上に注意してください。フィルター紙の別の部分でを繰り返します。</li>
		<li>30 のメタノールで 14 cm x 15 cm PVDF 膜をアクティブに s は、ローラーを使用して、すべてのバブルを削除する世話ろ紙上にレイヤーします。転送バッファーでゲルを洗い流すし、再び任意の気泡をロールアウト、膜上にレイヤーします。</li>
		<li>プラスチック製のラップと転送バッファーのコンテナーに最も近いペーパー タオルの端をカバーします。ペーパー タオルのスタックとの直接接触に次の手順で紙の鉄橋が来ないことが重要です。</li>
		<li>転送バッファーの 15 cm × 35 cm フィルター紙を浸漬し、一端がゲルの上をカバーしてもう一方の端は、転送バッファーのコンテナー内に配置します。別の橋を繰り返します。</li>
		<li>プラスチック製のラップのコンテナーをカバーし、室温で一晩おきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ウエスタンブロット検出
<ol><li>0.05% を含む PBS の 50 mL の膜を洗浄トゥイーン 20 (pbst;) 20 cm × 20 cm のコンテナー。PBST で 5% ミルク 20 mL を追加します。ブロックを 30 分間室温でロック。</li>
	<li>PBST で 5% ミルク 20 mL にウサギ抗 MLKL 抗体の 10 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。4 ° C で一晩ロッカーでインキュベートします。</li>
	<li>5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。</li>
	<li>Pbst; 5% ミルク 20 mL に抗うさぎ HRP の 4 μ L をピペットし、コンテナーに追加します。ロッカー 2 時間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>5 分繰り返し 5 回 20 ml PBST の膜を洗浄します。</li>
	<li>基板化学発光 (ECL) を追加し、製造元のプロトコルによると x 線フィルムを公開します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

著者は利益相反を宣言しません。

2 D の SDD 時代の最も重要な側面は、電気泳動条件が最初と 2 番目のディメンションの同じであることです。45 ° (解離や劣化が発生しなかったことを示す) でシャープな斜めラインによって異なります両方中に同じ方法で移行する繊維を検出する能力は electrophoreses します。電圧または実行時間の長さを変更するなど、さまざまな条件を使用して、これらの結果があいまいされます。また、従?...

1アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの病態に関与するタンパク質のミスフォールディングによるアミロイド繊維の形成を知られている長い。最近では、アミロイドやアミロイド様線維形成が抗ウイルス自然免疫応答2ネクロトーシス3,4中を含む人間と低い有機体のシグナル伝達経路の一部であると示されています。酵母5,6などしたがって、実験室でこれらの繊維を検出する機能は重要です。現在、アミロイドとアミロイド様線維を検出する 3 つの主な方法があります: 染料、EM、および SDD 時代の使用。
コンゴ赤や Thioflavin T などの染料の使用では、急速な顕微鏡、分光法7を使用して容易に検出できるという利点を提供しています。しかし、コンゴ赤の場合、顕微鏡による検出には、繊維、または繊維のサイズを構成するタンパク質の特異性は提供しません。同様に、コンゴ赤または Thioflavin T のバインディングを蛋白質の複合体を検出する分光学の使用は、正または負の結果のみを提供します。
EM は、繊維と繊維の長さと直径の8について定量的な情報の存在の決定的な証拠を提供します。ただし、この方法では、非常に厳格な浄化が必要です。さらに、EM は高価な機器を使用する特殊な技術です。
SDD 時代は、SDS 耐性メガ ダルトン タンパク質やアミロイドのようなアミロイド繊維を含むを検出するために使用されています。多くの利点を提供しています。最初に、それは繊維の精製を必要としないし、peform9に簡単です。第二に、それは相対的なサイズおよび繊維の heterogenicity の量を含む繊維のサイズに関する定性的情報を提供します。ウェスタンブロッティングは、電気泳動後実行できます、ために、最後に、それは、SDD 時代は半変化、いくつかのエピトープが隠されたままにするそれに注意する必要がありますを任意のタンパク質、抗体がある存在を検出する簡単です抗体による検出を複雑になります。
最近では、受容体相互作用タンパク質キナーゼ 1 (RIPK1) と 3 (RIPK3) は、ネクロトーシス、壊死3のプログラムのフォームの間にプラットフォームをシグナルとして機能するフォーム アミロイド線維に報告されています。これらの繊維を勉強しながら私たちの研究室は、リネージュ キナーゼ ドメインのような (MLKL) を混合、別のネクロトーシス関連蛋白質がまた4アミロイド様線維を形成を示した。しかし、SDD の年齢を調べると、MLKL 繊維のサイズ登場登場お互い (図 1) と同じ RIPK1 と RIPK3 の繊維とは異なる。MLKL RIPK1/RIPK3 にバインド ネクロトーシス シグナリング複合 necrosome10と呼ばれる形成して知られているのでこれは予想外だった。
少なくとも 2 つの説明があります。最初に、2 つのまったく異なるアミロイドのような繊維がネクロトーシス、1 つ含む RIPK1/RIPK3 およびその他の含まれている MLKL の中にフォームがあります。第二に、含む RIPK1/RIPK3/MLKL 可能性がありますネクロトーシス、MLKL 協会他の蛋白質との間に形成されるアミロイド様線維の 1 種類のみですそれは SDD 時代の間に電離する十分に弱いです。
これに対処するため二次元 (2 D) SDD 時代を実行することを提案します。SDD 時代安定アミロイドやアミロイド様線維は最初と 2 番目のディメンションの電気泳動中に同じの移行パターンをあります。膜へのタンパク質の転送、西部のしみの実施後、これは検出可能になります。安定した繊維は、シャープな斜めパターンを展示いたします。これからの逸脱は、繊維が SDS 電気泳動による変化を受けることを示唆するでしょう。

<table><tbody><tr><td>gel electrophoresis unit</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>appratus for gel running.</td></tr><tr><td>agrose</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>For agarose gel.</td></tr><tr><td>paper tower</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>filter paper</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>PVDF membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>for transfering</td></tr><tr><td>blocking milk powder</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>for blocking in Western blot</td></tr><tr><td>MLKL antibody</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>rabbit anti-MLKL antibody</td></tr><tr><td>RIPK1 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>mouse anti-RIPK1 antibody</td></tr><tr><td>RIPK3 antibody</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td></tr><tr><td>anti-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>secondary antibody</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Western chemiluminescent HRP substrate</td></tr><tr><td>X-ray film</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>for Western blot result</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>penicilin-streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>Trypsin solution</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>PBS for tissue culture</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>for cell culture</td></tr><tr><td>recombinant TNF</td><td>made in our lab</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>smac-mimetic</td><td>gift from Dr. Xiaodong Wang</td><td></td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Model TC20; for counting cells</td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>for measuring protein concentration in cell lysates</td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>to remove cells from dish</td></tr><tr><td>Lysis Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 840 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 10 mL Triton-X100&lt;br/&gt; (protease and phosphates inhibitors as desired)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48.4 g Tris base&lt;br/&gt; 11.42 mL glacial acetic acid&lt;br/&gt; 20 mL 0.5M EDTA pH 8&lt;br/&gt; ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 to 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td><td></td><td></td><td>5 mL 10X TAE&lt;br/&gt; 10 mL glycerol&lt;br/&gt; 4 mL 20% SDS&lt;br/&gt; 0.5 mL 10% bromophenol blue&lt;br/&gt; 31 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>TBS Transfer Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>20 mL 1 M Tris pH 7.4&lt;br/&gt; 30 mL 5 M NaCl&lt;br/&gt; 950 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST Wash Buffer (1 L)</td><td></td><td></td><td>100 mL 10xPBS&lt;br/&gt; 800 mL ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 L)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl&lt;br/&gt; 20 g KCl&lt;br/&gt; 144 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 24 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 10 L</td></tr></tbody></table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

アミロイドやアミロイド様線維は多くの人間の病気に関連付けられている、今多くのシグナル伝達経路の重要であることが発見されています。様々 な実験条件下でのこれらの繊維の形成を容易に検出する機能は潜在的な機能を理解するために不可欠です。多くの方法は、繊維を検出するために使用されているいくつかの欠点がないわけで。たとえば、電子顕微鏡検査 (EM) やコンゴーレッドまたは Thioflavin T にしばしば染色繊維の精製が必要です。その一方で、半変化洗剤アガロース電気泳動 (SDD-年齢) は精製することがなく細胞抽出液の SDS 耐性のアミロイド様線維の検出をことができます。さらに、それは繊維の大きさの違いの比較をことができます。もっと重大に、それは西部にしみが付くことによって繊維内の特定の蛋白質を識別するために使用できます。時間がかかるであり、ラボの広い数をより簡単にアクセスできます。SDD 時代結果しばしば不均質性が変化します。それはタンパク質の SDS 存在下での電気泳動の中に複合体の解離に起因する不均一性の一部であるかどうか質問を上げます。このため、我々 は SDD 時代の SDD 時代に見られるサイズの不均一性が真に繊維不均質体内の結果、劣化または中にタンパク質のいくつかの解離の結果ではないかどうかの 2 番目の次元を採用しています。電気泳動。このメソッドは、SDD 時代プロセス中にアミロイドやアミロイド様線維が部分的に解離しない高速、定性の確認できます。

ネクロトーシス誘導後 RIPK1 と RIPK3 は、ほぼ同一のアミロイドのようなパターン (レーン 2、4、図 1) を示した。しかし、MLKL 繊維はより均一であった、RIPK1/RIPK3 繊維 (レーン 6、図 1) よりも小さくなるように見えた。求め、私たちは MLKL フォーム RIPK1/RIPK3 に依存しない繊維または MLKL を単に SDD 時代に大規模な RIPK1/RIPK3/MLKL ?...

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Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.7K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. ここでは、異機種混在サイズのアミロイド様線維の存在を確認し、ゲルの中にアミロイド線維の解離によるサイズの不均一性がある可能性を除外する二次元半変化 agarose のゲルの電気泳動を使用します。実行中のプロセス。

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SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

神経科学

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer is widely accepted as the leading neurotoxin in the progress of Alzheimer&#39;s disease (AD) and is considered to be the crucial event in the pathogenesis of AD. Therefore, A&#946; oligomer inhibitors might prevent neurodegeneration and have the potential to be developed as disease-modifying treatments of AD. However, different formation protocols of A&#946; oligomer might lead to oligomers with different characteristics. Moreover, there are not many methods to effectively screen A&#946;1-42 oligomer inhibitors. An A11 antibody can react with a subset of toxic A&#946;1-42 oligomer with anti-parallel &#946;-sheet structures. In this protocol, we describe how to prepare an A11-positive A&#946;1-42 oligomer-rich sample from a synthetic A&#946;1-42 peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A11-positive A&#946;1-42 oligomer in samples by a dot blotting analysis using A11 and A&#946;1-42-specific 6E10 antibodies. Using this protocol, inhibitors of A11-positive A&#946;1-42 oligomer can also be screened from semi-quantitative experimental results.

This protocol describes how to prepare A&#946; oligomers from a synthetic peptide in vitro and to evaluate relative amounts of A&#946; oligomer by a dot blotting analysis.

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

生化学

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

生物学

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

偏光感受性2光子顕微鏡による球晶石の特性評価

Polarization-Sensitive Two-Photon Microscopy for a Label-Free Amyloid Structural Characterization

Compared to its one-photon counterpart, two-photon excitation is beneficial for bioimaging experiments because of its lower phototoxicity, deeper tissue penetration, efficient operation in densely packed systems, and reduced angular photoselection of fluorophores. Thus, the introduction of polarization analysis in two-photon fluorescence microscopy (2PFM) provides a more precise determination of molecular organization in a sample compared to standard imaging methods based on linear optical processes. In this work, we focus on polarization-sensitive 2PFM (ps-2PFM) and its application in the determination of molecular ordering within complex bio-structures-amyloid spherulites. Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's or Parkinson's are often diagnosed through the detection of amyloids-protein aggregates formed due to an impaired protein misfolding process. Exploring their structure leads to a better understanding of their creation pathway and consequently, to developing more sensitive diagnostic methods. This paper presents the ps-2PFM adapted for the determination of local fibril ordering inside the bovine insulin spherulites and spherical amyloidogenic protein aggregates. Moreover, we prove that the proposed technique can resolve the three-dimensional organization of fibrils inside the spherulite.

著者スポットライト:偏光感受性2光子顕微鏡を用いた複雑な生体構造の非侵襲的イメージング 

This paper describes how polarization-sensitive two-photon microscopy could be applied to characterize the local organization within label-free amyloid superstructures-spherulites. It also describes how to prepare and measure the sample, assemble the required setup, and analyze the data to obtain information about the local organization of amyloid fibrils.

偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

Compared to its one-photon counterpart, two-photon excitation is beneficial for bioimaging experiments because of its lower phototoxicity, deeper tissue ...

化学

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

Source: Sultana, S. et al. <a href="https://www.jove.com/v/62628">Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor</a>. J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

タンパク質分析のためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動:分子量に基づいてタンパク質を分離し、可視化する技術

Source: Sultana, S. et al. Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

生物学的手法

電気泳動技術

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

要約

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ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

A11 肯定的なアミロイド β オリゴマーの合成と評価を使用してドットのしみが付く分析

セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

タンパク質分析のためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動:分子量に基づいてタンパク質を分離し、可視化する技術

脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離