この作品は、向かわせる、リール2大学、MEDIALZ、LabEx（卓越した研究室、プログラムは将来のための投資）とDISTALZ（アルツハイマー病への横断型アプローチのための革新的な戦略の開発）によってサポートされていました。 FJ.FGは現在、ANR（フランス国立研究機関/ NeuroSpliceドタウ01プロジェットANR-2010-BLAN-1114）の受信者の交わりですが、この作品はJCCM（スペイン）からの助成金の支援の下にもありました。

1。均質化およびヒトおよびマウス脳組織からの全タンパク質の抽出<ol><li>脳組織の均質化。 （ヒトサンプルについて）、ポッターガラスまたはマウス（サンプルの）テフロンホモジナイザーを用いて脳組織を10％（w / v）の8 M尿素、2 Mチオ尿素およびw / vのSDS緩衝液（UTS）を1％均質化する。全組織の崩壊13、14のための0.5秒を適用する超音波発生器と60 Hzの30パルスで超音波処理。 <ol><li>標準としてBSAを使用して、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を決定します。これは、バッファ抽出限り溶解物が過熱カルバミル15を避けてはならないように1次元のSDS-PAGEと完全に互換性がありますUTS。 </li><li>アンバーの（w / v）の1％を加え、室温で10分の間に穏やかに混合しながらインキュベートする。その後、0.22μmのシリンジフィルターにフィルター処理し、最終的に尿素/チオ尿素溶液にSDSを加える。このステップは、equilibrである尿酸およびイソシアン酸の量を低減溶液中の尿素でIUMとその分解を促進する。 </li></ol></li><li>クロロホルム/メタノールタンパク質沈殿。 11センチメートルIPGストリップのための蛋白質の100〜150μgの18センチのもの（独立IEFを実行するために選択されたpH範囲での）のために1〜1.5ミリグラムの間で沈殿させる。 <ol><li>氷上または4℃で、すべての手順を実行します。沈殿手順を開始する前に30分間、4℃でクール、クロロホルムとメタノール。 </li><li> UTS溶解物の1の体積にメタノールとクロロホルムの1の体積の3ボリュームを追加します。手動での混合物を振ると冷水の3ボリュームを追加します。 1分間の4℃で30分間、12,000×gでの遠心分離によってタンパク質をペレット渦</li><li>パスツールピペットを用いて上清を捨て、冷MeOHの3ボリュームを追加します。再びボルテックスし、4℃で30分間12,000 xgで遠心最終的に上澄み液を廃棄し、N 2下でペレットを乾燥させます。 </li></ol></li><li>二次元分析のためのタンパク質の調製。2D-バッファー（8 M尿素、4％CHAPSを補充した2 Mチオ尿素）中のタンパク質 - 乾燥ペレットを再懸濁する。上に示したようにアンバーライトで溶液を洗浄し、2D-DIGE用2Dバッファー200μl当たりタンパク質500μgの割合を維持しようとします。注：2Dバッファは-80℃で保存するか、または（尿素分解を防ぐために）一週間の間4℃に保つことができる。 <ol><li>超音波処理とは、次の工程を実施するまで-80℃でサンプルを格納します。注目すべきは、このプロトコルは、タンパク質凝集体10のギ酸可溶化して使用することができる。簡単に言うと、N 2下でギ酸を蒸発させて説明したようにペレットを再懸濁。 </li></ol></li></ol> （2）2D-DIGE <ol><li>サンプルテスト品質。投与量は、試料を再びブラッドフォード法を用いて。 、LDSサンプル緩衝液中のタンパク質15μgのを希釈し、37℃で加熱し、15〜12％ポリアクリルアミドゲル上にロードする。 </li><li>クマシー染色。 0.1％ポリアクリルアミドゲルを染色（w / v）のクーマブルーG-250は、少なくとも1時間、50％エタノール及び10％（v / v）の酢酸溶液。背景が7％酢酸および10％（v / v）エタノール溶液中で一晩脱色しましょう​​。 </li><li>サンプルの前の電気泳動ラベル。シアニン色素標識を実行する前に、N-ヒドロキシスクシン置換が塩基性pHでより効率的であり、pH 8.6において最適であることが指定されて以来、基本的な、あるいは中性であるべき試料のpHを確認する。 <ol><li> 50μgのprotein/400 pmolの色素の比率を最小限にCy3またはCy5蛍光色素を用いた研究の2サンプルにラベルを付け、非プロトン化アミンとシアニンのNHSエステルの反応基を容易にするために、暗闇の中で、4℃で1時間保つリジンのグループ。 </li><li>特にシアニンに1サンプルの優先的な結合を回避し、Cy3およびCy5色素でクロスラベルを作るサンプル変動を低減。シアニン色素標識は、最小限の広報は1μgの比率を維持しながら、タンパク質の少量に適合させることができることに留意されたい8 pmolのシアニン色素につきotein。その場合、ミニ2DEシステムが代わりに大きな2Dゲルシステムを用いることもできる。これは脳組織の少量のための2D-DIGE解析が可能になります。 </li><li> Cy2は蛍光色素で同量のタンパク質（計50μg）を用いて、両方のサンプルのプールを標識し、内部標準として用いられる。先に示したのと同じ条件を使用してください。 </li><li> 1.1％のDestreak試薬、IPGバッファーの1.2％とフェノールブルー標識されたタンパク質の合計150μgの（Cy2と50μgの、Cy2との50のCy3のおよび50μg）の痕跡を含む2次元のバッファーで、総容量350μLへの完全な。 4の独立したストリップを使用して四重に、この手順を実行します。また、分取ゲル用タンパク質の350〜450μgの2の追加の非標識ストリップ（各サンプルの1）を準備します。 </li><li>受動的な再水和のための鉱物油を一晩で覆わ6ロードされたストリップを残す。 </li></ol></li><li>等電点電気泳動法。 20でIEFを実施6。C. pHは3-11NLの場合は、18センチメートルは、プロトコルを削除されています：最大電流設定は8段階で50μA/ストリップである：1）、150Vで1時間ステップ、2）200 Vの5時間、3）500 Vのグラデーションのステップのために2時間後、24,000 Vの計2時間、2時間、5）2000 Vの勾配、2時間6）4000 Vの勾配、2時間および8用7）8,000 Vの勾配）のため4）千Vの勾配·時間ステップ。 IEF後、クロマトグラフィーペーパーを用いて鉱物油を過剰に派遣し、二次元目まで-20℃でストリップを格納する。 </li><li> IPGは平衡を取り除きます。同じ緩衝液中の4.7％ヨードアセトアミドではなくDTTなしに6 M尿素、2％SDS、30％グリセロール、50mMのトリス-HCl、15分間のDTT、1％の緩衝液中で8.6とした後、ストリップを平衡化する。 </li><li>二次元またはSDS-PAGE電気泳動。 6〜12％SDS-PAGEゲル（1.5 Mトリス-HCl、8.6、12％アクリルアミド/ビスアクリルアミド、0.1％（w / v）のSDS 0.072％（w / v）のAPSおよび0.1％（v / v）を作るTEMED ）STRIための4つの低蛍光ガラス板と、大きな2Dシステムを使用して同時にタンパク質スポットを切除するために、分取ゲルについての厚さの1.5ミリメートルの蛍光サンプルと他の二つのガラス板とPS。 <ol><li> （w / v）アガロース0.5％でゲルの上に層状の上に6 IPGストリップをロードします。ランニング緩衝液は25mMトリス、192mMグリシンおよび0.1％（w / v）のSDSで構成されている。 4℃で16,17に設定された冷凍システムを用いて一晩2.5 W /ゲルで泳動を行う。 </li></ol></li><li>蛍光画像の取得と分析。蛍光ゲル画像（一つの実験のための12のイメージ）を得るために台風9400スキャナーを使用してください。スキャンCy2は、520分の488ナノメートル、580分の532 nmおよび670分の630 nmの励起/発光波長は、それぞれの各ゲルのためのCy3およびCy5のイメージ。画像を分析するインフォマティクスソフトウェアを使用してください。データは、研究2試料間の4のゲル間での信号の分配に関連するスポット量の変化を表している。 </li><li>大きなゲルについてクマシー染色。 5で分取ゲルを修正0％（v / v）のエタノールおよび3％、少なくとも24時間（v / v）のオルトリン酸溶液。次いで後、20分間超純水で2回洗浄する。クマシーブルーG-250（w / v）の0.1％を添加する前に34％で着色1時間（v / v）のメタノール、17％（w / v）の硫酸アンモニウムおよび2％オルトリン酸を実行する。少なくとも48時間、着色がゲルを維持し、超純水で脱色。 <ol><li> MS同定のためのスポット。蛍光画像を解析されると、ソフトウェアが表現統計的に差があるスポットのリストを提供します。手動で取ゲルからこれらのスポットを切り出す。この手順では、ケラチン汚染を回避するために実際に、いくつかの手先の器用さを必要とする。次いで、サンプルを、MSに送信するまで-20℃で水中に保つことができる。スポットの同定は、タンデム質量分析（MS / MS）と完全に互換性があり、タンパク質アイデンティティの関連性は、0.05に（p &lt;0.05）18のp値が計算された確率もとのMowseスコアに従って判定される。 </li> &lt;/ OL&gt; </li></ol> 3。定性的ミニ2DEアッセイ<ol><li> 11センチメートルIPGストリップのための最終容量200μlまでの2Dバッファにタンパク質試料の最大1​​00μgの再懸濁する。過剰発現系または精製されたタンパク質の場合、開始量は20μgのに下げることができる。 </li><li> 200μlの最終容量まで（v / v）のDestreak試薬、0.55％（v / v）のIPG緩衝液およびブロモフェノールブルー、微量の1.1％を加える。その後、渦は、高速スピンをして、一晩鉱物油で覆われた（元の厚さにストリップをもたらすために）パッシブ再水和のためにIPGストリップにロードします。注：IPG緩衝液の割合は、（pHが3-11、4-7、7-11、等）の所望のpHのすべての区間について同じであるが、その組成物は、選択されたpH範囲の関数として変化する。 </li><li> Isoelectrofocalisation。 20℃でIEFを実行プログラムの期間は、選択されたpH間隔に依存します。注目すべきは、このような電気浸透は、IEFプロファイルを乱す可能性があるこれらの場合のパラメータ、electrofocalisation時間の最適化が19必要です。注：それは必ずしも良い結果を提供しますが、IEFの時間を短縮することも解像度を向上させることができ、より長いIEFではありません。 IEFの後、IPGストリップをヶ月間-20℃で保存することができる。 </li><li> IPGは平衡を取り除きます。 25mMのトリス-HCl、pH6.8、20mMのDTT、10％グリセロール、5％SDS、0.05％ブロモフェノールブルーを含有する緩衝液中でストリップを平衡化する。 3平衡は、各浴との間の緩衝液を変えて15分間浸す作る。 </li><li> SDS-PAGE。目的のタンパク質の分子量に応じて選択アクリルアミドの割合がプレキャストゲル（IPG 1だけでなく、11センチメートルIPGストリップ）にIPGストリップレイヤ。その後、33分の間に100 mVでニトロセルロース/ PVDF膜上にゲルをブロット。 </li><li>必要な抗体を用いて一晩インキュベートし、ペルオキシダーゼ活性により可視化する。二次抗体によって明らかに無関係なポリペプチドを用いてイムノブロットのアライメントを行う。半quantitリーチImageJのソフトウェアを使用してトレース/スポットのボリュームと強度のデンシトメトリー分析をative。 </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function.">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li><li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer's+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach.">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li><li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia:+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment.">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li><li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice.">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li><li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical,+neuropathological,+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S.">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li><li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue.">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li><li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank:+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium.">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li><li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE.">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li><li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+(2-D+DIGE).">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li><li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis.">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li><li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling.">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li></ol>

著者らは、宣言する特別の利害関係はありません。

タンパク質の病理学的な発現変化を発見、バイオマーカー探索および薬理学的標的の可能性経路の調節がneuroproteomicsの目的の一つであるが30に近づく 。新興のツールの中で、2DEフィールドが有望予想されているものが追加されます。それにもかかわらず、コンセンサスがばらつきを最小限にし、実験で再現性を高めるために、到達されるべきである。このアイデアの行に2D-DIG...

精神的、神経学的障害は、病気の世界的な負担の13パーセントを表し、病態生理学的メカニズム、リスク要因と前駆症状のバイオマーカーのような新たな課題は、1を模索しなければならない。この目的に沿ったもので、人間の脳のプロテオミクス研究は、生理学的のためだけでなく、病理学的状態のためだけでなく、メモリ、行動、感情やインスタンスの神経可塑性のようなプロセスに関与する分子経路を明らかにすることが不可欠になる。従って、動物モデルの使用、より具体的にはトランスジェニックマウスは、ヒト神経変性障害の病因2を模倣する可能性の広い範囲をもたらす。 プロテオミクスアプローチは神経科学分野では、これらの新しい視点を達成するために、現在では利用可能です。二次元ゲル電気泳動（2DE）は、広範囲の試料のプロテオームを比較することができ、強力かつ簡単な方法である可能性が高い。また、も識別し、さらに質量分析によって分析するために複雑な混合物からタンパク質を単離するための強力な方法。 （IEF）を等電点電気泳動による等電点（pI）に係る1）タンパク質分離：この技術は、本質的に2つの連続するステップからなる。より正確には、電位がpH勾配の中でイモビアクリルアミドストリップに印加され、次いでタンパク質は、それらのグローバルネット電荷の関数に移動し、決定されたpIに焦点を当てる。 2）等電集束タンパク質が変性しており、それによって負にその第1の構造体中のタンパク質をSDS-PAGE 3によってそれらの見かけの分子量（MW）に応じて分離され、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の添加によってチャージされる。これら二つの異なる性質は、私たちはプロテオームの研究では、さらに行くためにdoub​​le値に対処することができます。一方で、このアプローチは、最小限の染料2D-DIGE法を用いて定量分析を実行するために可能性を提供し、一方qualitativウェスタンブロッティングに結合されたミニ2DEによるE分析。 2D-DIGEによる定量分析は、タンパク質の発現は、すべてのサンプルプロテオーム的に変化授ける。簡潔には、サンプルは三つの異なる波長（青、緑、赤）で発光する3シアニン（Cy 2を表し、Cy3およびCy5）で標識される。 N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル基を含有するこれらのフッ素最小限の染料は、共有結合、アミド結合4で得られたタンパク質のリジン残基のε-アミノ基と反応する。リジン残基は、タンパク質および主要なネットチャージ修正5,6ごとに複数のラベルの追加を防ぐ唯一の1〜3％、したがって、ラベルが付いています。 Cy3およびCy5は、多くの場合、Cy2は、比較したサンプルの同じ割合の組み合わせをタグしながら、2の独立したサンプルを標識するために使用される。 2つの主な利点は、全ての標識されたサンプルが混合され、IEFおよびSDS-PAGEの比較をゲル化するため、実験間のばらつきを回避する間、ステップごとに一度に1つのゲル中で行われていることである。また、タンパク質7の約1フェムトモルの高い検出閾値を示す。ゲルを走査し、2次元ソフトウェアがCy2と質量分析によるそれらの後方同定のためのスポットのうち統計的差異の同定を可能にする内部標準としての2Dゲルの蛍光画像を比較している。内部標準を用いて二次元解析ソフトウェアは、統計的信頼8の95％以上を有するサンプル間の差の10％未満の迅速な検出を達成する。 ミニ2DEによる定性分析は、タンパク質の特性評価のための重要なステップである。原理は、以前のpI及びMW分離のために記載したのと同じであるが、この場合、タンパク質は、膜およびイムノブロッティングに小さなポリアクリルアミドゲルから転送され、その後実行される。一次元ゲル電気泳動は、抗体の機能における1つまたはいくつかのタンパク質のエピトープのためのタンパク質発現の変化、情報技術を提供するがミニ2DEのNは、2つの追加パラメータを指定して賦与。まず、タンパク質isovariantsは、翻訳後修飾が起こる可能性があることを示す、pIはの関数として変化する。第二に、質量分析同定は、もっともらしいチモーゲン及びタンパク質の異化生成物を示すことができる。従って、2D-DIGEによって観察修飾は、グローバルプロテオームプロフィールの変化のメカニズムを示す可能性がある。同じタンパク質のエピトープのためのいくつかのサンプル間のイムノブロットのアライメント/ミニ2DEによるSはやや一次元免疫ブロッティング9、10で観測されたりしない翻訳後の変化に光を流して酸味の変更を反映することができる。さらに、この分析は、代謝残基11,12のPIとMWの知識に起因する潜在的な切断部位について通知します。 これら2つの技術の組み合わせは、相補的なプロテオミクス分析を提供する。一方では、2D-DIGEは、標準をもたらす表情は異なりますポリペプチドの正確な分離を可能差異のE。これらの違いは、スポットや蛍光ゲルのソフトウェア解析によって指定された1の強度の増加/減少の表示または非表示に本質的になる。しかし、それ自体でこれらの観​​察は、観察修飾の性質を説明する可能性は低い。の等変/アイソフォームレベルの変化：ポリペプチドを単離し、質量分析により同定されると、これらの理由から、ミニ2DEの使用は）正確に1を確認するために、単離されたタンパク質のアイデンティティと差の2）自然を可能にします例えば、発現、翻訳後修飾および切断プロセス。しかし、それは非常に似ていない抽出プロトコールの使用から生じる潜在的な分散体を制限するために2D-DIGEと、ミニ2DEと互換性両方の出発溶解緩衝液を開発する必要がある。 本稿では、デヒトおよびマウスの組織から来る脳タンパク質の2D-DIGEとミニ2DE技術の準備、抽出、性能に適合したプロトコルをスクライビング。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="709">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5nmol 1 * 5 Nmo</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">25-8010-65</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Immobiline DryStrip</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval/size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPG Buffer, pH X-X</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the pH interval desired</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&#160;</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">551797N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td>17-1335-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">28-9334-92</td>
			<td>Plastic box to make the passive rehydration&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">MILLEX GS Filter</td>
			<td style="width:113px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGS033SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td>
			<td style="width:113px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Reference in function of the MW to separate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">11-0033-64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td>
			<td style="width:113px;">GE Healtcare</td>
			<td style="width:119px;">80-6485-08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">P2D1.5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

consensus brain-derived protein, extraction protocol for the study of human and murine brain proteome using both 2d-dige and mini 2de immunoblotting

二次元ゲル電気泳動（2DE）は潜在的に異なる生理学的または病理学的状態に関連するプロテオームの変更を明らかに強力なツールです。基本的に、この技術は、第一工程におけるそれらの等電点に係るタンパク質の分離に基づいており、そして第二SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によってそれらの分子量に記載の方法。本報告書では、ヒトの死後、マウス脳組織の少量のための最適化されたサンプル調製プロトコルが記述されている。この方法は、両方の二次元蛍光差ゲル電気泳動（2D-DIGE）とミニ2DEイムノブロッティングを行うことが可能となる。これらのアプローチの組み合わせは、一質量分析検出との相溶性にそれらの発現のおかげで、新しいタンパク質および/またはタンパク質修飾を見つけることができるだけでなく、またマーカーの検証への新しい洞察。このように、ミニ2DEポストを特定し、検証するために、ウェスタンブロッティングを許可に結合された翻訳の修正、蛋白異化と異なる条件および/または処理間の定性的な比較を提供します。ここで、我々は、ADなど、アミロイドβペプチドとα-シヌクレインなどのレビー小体型認知症に見られるタンパク質凝集体の成分を研究するための方法を提供する。我々の方法は、このようプロテオームの解析のために適合させることができ、不溶性タンパク質もヒト脳組織およびマウスモデルから抽出する。並行して、それは、神経変性疾患、ならびに潜在的な新規バイオマーカーおよび治療標的に関与する分子および細胞経路の研究に有用な情報を提供することができる。

理想的な緩衝液は、タンパク質の100％、特に膜結合又は細胞骨格タンパク質を回収するために存在しないので、脳組織に対するプロテオミクスは依然として厳しい。実験の最初のセットは、タンパク質の大きなパネルを回復することができますつのアプローチと互換性の適切な溶解バッファーの検索に焦点を当てた。したがって、3つの溶解緩衝液は、最も適切なものを決定するためにアッセ...

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Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K ビュー.  Inserm UMR 837. 人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。 

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS：脆弱X症候群と自閉症の可塑性のMechasnismを探検するシータバーストプロトコルを使用する

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

神経科学

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

New Methods to Study Gustatory Coding

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons (GRNs) detect tastant molecules, they encode information about the identity and concentration of the tastant as patterns of electrical activity that then propagate to follower neurons in the brain. These patterns constitute internal representations of the tastant, which then allow the animal to select actions and form memories. The use of relatively simple animal models has been a powerful tool to study basic principles in sensory coding. Here, we propose three new methods to study gustatory coding using the moth Manduca sexta. First, we present a dissection procedure for exposing the maxillary nerves and the subesophageal zone (SEZ), allowing recording of the activity of GRNs from their axons. Second, we describe the use of extracellular electrodes to record the activity of multiple GRNs by placing tetrode wires directly into the maxillary nerve. Third, we present a new system for delivering and monitoring, with high temporal precision, pulses of different tastants. These methods allow the characterization of neuronal responses in vivo directly from GRNs before, during and after tastants are delivered. We provide examples of voltage traces recorded from multiple GRNs, and present an example of how a spike sorting technique can be applied to the data to identify the responses of individual neurons. Finally, to validate our recording approach, we compare extracellular recordings obtained from GRNs with tetrodes to intracellular recordings obtained with sharp glass electrodes.

We present three new methods to study gustatory coding. Using a simple animal, the moth Manduca sexta (Manduca), we describe a dissection protocol, the use of extracellular tetrodes to record the activity of multiple gustatory receptor neurons, and a system for delivering and monitoring precisely timed pulses of tastants.

味覚コーディングを研究する新しい方法

The sense of taste allows animals to detect chemicals in the environment, giving rise to behaviors critical for survival. When Gustatory Receptor Neurons ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

ショウジョウバエ島アッセイにおける歩行行動の高スループット解析

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Extraction and Dissection of the Domesticated Pig Brain

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular systems, gastrointestinal systems, and nutrition, and the pig is increasingly being used as a large animal model in neuroscience. Furthermore, the pig is an accepted model to study neurodevelopment as it displays brain growth and development patterns similar to what occurs in humans. As a less common animal model in neuroscience, surgical and dissection procedures on pigs may not be as familiar or well-practiced among researchers. Therefore, a standardized visual protocol detailing consistent extraction and dissection methods may prove valuable for researchers working with the pig. The following video showcases a technique to remove the pig brain while keeping the cortex and brainstem intact and reviews methods to dissect several commonly investigated brain regions including the brainstem, cerebellum, midbrain, hippocampus, striatum, thalamus, and medial prefrontal cortex. The purpose of this video is to provide researchers with the tools and knowledge necessary to consistently perform a brain extraction and dissection on the four-week-old pig.

This protocol details the technique for removal of the pig brain in its entirety and dissection of several brain regions commonly studied in neuroscience.

家畜豚脳の抽出と解剖

Use of the pig as a preclinical and translatable animal model has been well-documented and accepted by research fields investigating cardiovascular ...

Laser Microdissection-Based Protocol for the LC-MS/MS Analysis of the Proteomic Profile of Neuromelanin Granules

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. Besides neuromelanin, NMGs contain a variety of proteins, lipids, and metals. Although NMGs-containing dopaminergic neurons are preferentially lost in neurodegenerative diseases like Parkinson&#39;s disease and dementia with Lewy bodies, only little is known about the mechanism of NMG formation and the role of NMGs in health and disease. Thus, further research on the molecular characterization of NMGs is essential. Unfortunately, standard protocols for the isolation of proteins are based on density gradient ultracentrifugation and therefore require high amounts of human tissue. Thus, an automated laser microdissection (LMD)-based protocol is established here which allows the collection of NMGs and surrounding substantia nigra (SN) tissue using minimal amounts of tissue in an unbiased, automatized way. Excised samples are subsequently analyzed by mass spectrometry to decipher their proteomic composition. With this workflow, 2,079 proteins were identified of which 514 proteins were exclusively identified in NMGs and 181 in SN. The present results have been compared with a previous study using a similar LMD-based approach reaching an overlap of 87.6% for both proteomes, verifying the applicability of the revised and optimized protocol presented here. To validate current findings, proteins of interest were analyzed by targeted mass spectrometry, e.g., parallel reaction monitoring (PRM)-experiments.

A robust protocol is presented here for isolating neuromelanin granules from human post-mortem substantia nigra pars compacta tissue via laser microdissection. This revised and optimized protocol massively minimizes the required time for sample collection, reduces the required sample amount, and enhances the identification and quantification of proteins by LC-MS/MS analysis.

ニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析のためのレーザーマイクロダイセクションベースのプロトコル

Neuromelanin is a black-brownish pigment, present in so-called neuromelanin granules (NMGs) in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta. ...

fNIRS研究の革命:ニューラルカップリングへの新しいアプローチ

New Framework for Understanding Cross-Brain Coherence in Functional Near-Infrared Spectroscopy (fNIRS) Hyperscanning Studies

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals using wavelet transform coherence (WTC) seems to ignore the directionality of the interaction. The field is currently lacking a framework that allows researchers to determine whether a high coherence value obtained using a WTC function reflects in-phase synchronization (i.e., neural activation is seen in both members of the dyad at the same time), lagged synchronization (i.e., neural activation is seen in one member of the dyad prior to the other member), or anti-phase synchronization (i.e., neural activation is increased in one member of the dyad and decreased in the other). To address this need, a complementary and more sensitive approach for analyzing the phase coherence of two neural signals is proposed in this work. The toolbox allows investigators to estimate the coupling directionality by classifying the phase angle values obtained using traditional WTC into in-phase synchronization, lagged synchronization, and anti-phase synchronization. The toolbox also allows researchers to assess how the dynamics of interactions develop and change throughout the task. Using this novel WTC approach and the toolbox will advance our understanding of complex social interactions through their uses in fNIRS hyperscanning studies.

著者スポットライト:fNIRS研究における新たな洞察の解き放つ - 脳間同期分析のための新しいフレームワーク 

Wavelet transform coherence (WTC) is a common methodology for assessing the coupling between signals that is used in functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies. A toolbox for assessing the directionality of the signal interaction is presented in this work.

機能的近赤外分光法(fNIRS)ハイパースキャニング研究における脳間コヒーレンスを理解するための新しいフレームワーク

Despite the growing body of functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) hyperscanning studies, the assessment of coupling between two neural signals ...