Name: in vivo electrophysiological measurement of compound muscle action potential from the forelimbs in mouse models of motor neuron degeneration
Uploaded: 2018-06-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
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この研究は、ルーヴェンに支えられてきた (「未来を開く' と C1)、科学的なフランダース研究 (FWO フランデレン)、ティエリー Latran 財団、協会犬 contre レ病気神経 Musculaires (ABMM)、筋ジストロフィーための基金協会 (MDA)、ALS 協会と ALS リーガ (ベルギー)。PVD は FWO フランデレンの上級 investigatorship を保持します。RP 中央治療クリニック (CRC) アイルランドからの補助金に支えられ、現在サポートされているアイルランド (NUI) と、FWO の国立大学。

すべての動物は、標準条件のガイドラインに従って - ルーヴェンのルーヴェン大学と関連付けられたヨーロッパのガイドライン (欧州連合指令 2010年/63/EU 動物実験) の下で収容されました。すべての動物実験は、ルーヴェンのローカル倫理委員会で承認されました。
1. 動物の作製と麻酔
<ol><li>イソフルラン/酸素吸入とマウスの麻酔します。イソフルラン麻酔の誘導のための 4%、2-3% を 2.5 L/分の酸素の流れを維持するために使用します。すなわちマウスの条件によると麻酔の維持のためイソフルラン割合を調整、小さくて弱いマウスが少ない麻酔薬を必要とします。痛み逃避反射の有無をチェックするにはパッドを歩いて後肢に穏やかな圧力を適用することによって適切な麻酔などを確認します。</li>
	<li>37 ° C で麻酔中の体温の低下を防ぐためにサーモスタットのヒーター プレートを使用してマウスの体の温度を制御します。</li>
	<li>麻酔の維持のためノーズを持つマウスを合わせてください。動物がチェックされ、ノーズが気道をブロックしないし、動物が着実に呼吸は酸素の十分な配信をあることを確認します。</li>
	<li>、記録中にマウスが十分に呼吸率 (麻酔で約 1 Hz) と穏やかな圧力の逃避反射の有無を観察することによって麻酔かどうかを監視します。麻酔が十分に深くない場合は、手動でイソフルラン濃度を増やします。</li>
	<li>測定の後それは約 2-5 分のための胸骨の内股を維持するために十分な意識を取り戻したまで加熱板、赤外線ランプの暖かさを回復するためにマウスを残します。マウスは、無人と他のマウスの会社で、それは完全に麻酔から回復するまでには、放置しないでください。</li>
</ol>2、後肢、前肢で CMAP の計測
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig1.jpg"> 図 1。CMAP 計測用電極の位置決め。ハインド - (A) と (B) の前肢の電極の位置が表示されます。電極は次のように番号が付けられます: 1: アノードと 2: 陰極刺激電極、3: アクティブな記録電極、4: 参照電極と 5: 接地電極。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol><li>後肢、前肢の CMAP 測定用 27 G 針電極を使用します。電極位置の推奨される場所は、図 1を参照してください。</li>
	<li>とおり、後肢に電極を配置します。<ol>
<li>腹臥位で加熱パッドの上にマウスを置きます。膝で後肢を拡張し、粘着テープ (図 1 a) を使用して作業面に足を添付します。</li>
		<li>約 2 cm の距離で坐骨切痕の両側皮下刺激電極を配置 (1 = アノード、2 = カソード) 電極間。基になる筋肉を貫通せずに皮膚とプッシュ約 5 mm の皮膚の下に針を垂直に針を挿入するために皮膚を持ち上げます。</li>
		<li>同様に、皮下筋肉を合わせ記録電極 (3) を配置します。横に 30 度の角度でアキレス腱皮下参照電極 (4) を挿入し、2-5 mm の皮膚の下に針を残します。刺激電極と同様の方法で皮下マウス側に接地電極 (5) がこの電極の位置が測定のために重要ではありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>とおり前肢に電極を配置します。<ol>
<li>仰臥位で使用粘着テープ (図 1 b) 体の両側に両方の前肢を拡張する加熱パッドにマウスを配置します。</li>
		<li>刺激電極を配置 (1 = アノード、2 = カソード) に合わせて腕神経叢神経前肢の両側皮下。基になる筋肉を貫通せずに皮膚とプッシュ約 5 mm の皮膚の下に針を垂直に針を挿入するために皮膚を持ち上げます。</li>
		<li>上腕二頭筋の筋肉の上に皮下記録電極 (3) を配置するには、皮膚を持ち上げます。30 度の角度で 3 mm の深さで歩行のパッドに参照電極 (4) を配置します。マウス皮下側に接地電極 (5) を配置します。 注: 電極は、このセットアップで互いの近くです。これは録音を歪め、お互いに触れてから電極を防ぐ。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. データ集録
<ol><li>コント ローラー単位で再発刺激ボタンを押すことによって刺激を開始し、刺激を増やす強度コント ローラーのノブを回します。1 パルス/秒を用いた刺激の持続時間を 0.1 ms すべて軸索を刺激します。ソフトウェアのドロップ ダウン メニューから正しい頻度と期間を選択します。</li>
	<li>激刺激に到達する (5-20 mA; 脱髄における条件最大 60 mA)、CMAP の応答の振幅は増加を停止するまで輝度コント ローラーのノブを回して増加刺激を適用。そこから、さらに刺激 20% 増 CMAP 振幅が極大応答に達したことを確認します。再び再発刺激ボタンを押すことによって刺激を終了します。</li>
	<li>録音に次のポイントを示すマーカー ツールを使用: 刺激、応答、最大の正のピークに、最大の負のピーク (図 2) の開始の開始。</li>
	<li>刺激の開始から反応 (図 2) の開始への遅延として、待機時間 (ミリ秒) を決定します。振幅が増加し始める最も早いポイントとして反応の開始を定義します。待ち時間を使用すると、軸索の脱髄を評価できます。</li>
	<li>最大の正のピーク (図 2) を最大のネガから振幅 (mV) を測定します。振幅の大きさを使用して、機能軸索の数を関連付けます。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig2.jpg"> 図 2。CMAP 応答の代表的なイメージです。(A) 潜時や振幅を計算するために使用されるポイントを示すわかりやすい CMAP 応答。待ち時間は、CMAP 応答の発症に、刺激からの遅延によって決まります。ピーク-ピーク振幅は、二相性の波の最大の肯定的なピークに最大負から測定されます。健康な非遺伝子組換え動物 (B) および長時間の遅延と低振幅 (C) 病気にかかった動物の代表的な録音。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="6"><li>電極を交換し、3 回同じ神経を測定電極の正確な位置は記録の結果値に影響を与える、ので激刺激を使用して最大応答が得られることを確認します。録音の平均を使用します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+Lateral+Sclerosis.">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> N Engl J Med. 377 (2), 162-172 (2017).</li><li>Prior, R., Van Helleputte, L., Benoy, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+axonal+transport:+A+common+pathological+mechanism+in+inherited+and+acquired+peripheral+neuropathies.">Defective axonal transport: A common pathological mechanism in inherited and acquired peripheral neuropathies.</a> Neurobiol Dis. , 300-320 (2017).</li><li>de Carvalho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrodiagnostic+criteria+for+diagnosis+of+ALS.">Electrodiagnostic criteria for diagnosis of ALS.</a> Clin Neurophysiol. 119 (3), 497-503 (2008).</li><li>Krajewski, K. 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著者が明らかに何もありません。

敏感な記録方法には病気の進行と特に神経疾患の動物モデルで治療の有効性を評価するために不可欠です。決定する、概念地図は、定期的に診療所と実験のセットアップを使用神経、神経因性疾患3,18で神経伝導を評価する低侵襲電気生理学的テクニックです。ここでは、CMAP の前肢の腕神経叢の神経の神経伝導を測定するためにマウスの記録のための新たな応用について述べる。提案手法は、神経変性疾患のモデル マウスで神経機能のより汎用性と詳細な縦断的評価をできます。
針の電極はリング電極よりもわずかにより侵襲的な組織の損傷を最小限に抑えるための注意縦断研究に特にする必要があります。メソッドの 1 つの可能な欠点は、神経や筋肉のピアスから傷害の結果です。ただし、慎重に電極の皮下配置後、けがや筋肉や神経の破壊を防止できます。リング電極を使用してのメソッドと異なり、ここで紹介した方法では体の大きい部分から毛皮のシェービングの操作は不要です。その結果、動物の体温調節に及ぼす影響や不快感はありません。
電極の位置決めは、CMAP 振幅と待ち時間の正しいと一貫して記録するため重要です。電極の位置を変更して、最大の刺激のことを確認する各サイトで 2 ~ 3 測定を実行することをお勧めだし、レスポンスを実現します。正しい録音相性カーブは図 2に示すようになります必要があります。方法を標準化するために神経損傷なし非トランスジェニック マウスは適切かつ一貫性のある電極の最適な刺激のためのポジショニングを確立する最高のモデルです。再利用可能な針の電極は、彼らが定期的に殺菌する、例えば動物の間 20 分、グルタルアルデヒドは、繰り返しの使用に適した、シャープネスのため検査します。
健康な大人のマウスに、提案手法で記録された CMAP 振幅は、通常、坐骨神経、腕神経叢を刺激後の 80-100 mV です。結果は 20-40 mV8,19,20のリング電極の皮膚によって引き起こされるより高いインピー ダンスがあるので、これはリング電極と測定された応答よりもさらに大きな。ALS マウス モデル、坐骨神経や腕神経叢麻痺肢の刺激後 CMAP 振幅は 10-30 mV に減少します。CMAP 振幅開発21中に増加するので、CMAP の振幅の大きさは若い動物で小さいです。
ここで説明するメソッドは前13前肢よりも後肢の神経とその後の運動障害が発生する ALS のマウス ・ モデルで特に役立ちます。除、に加えてメソッドは CMAP 振幅で阻止または遅延の減少として決定される抜歯を検出できます。発症の年齢で既に、後肢の筋肉の CMAP 振幅の劇的な減少を妨げるさらに疾患進行のフォロー アップCMAP 振幅病気の初期の段階で非常に低い値に達するとさらに小さく病気プロセス中に。対照的に、軸索損失は、前肢の腕神経叢の神経の遅いペースで進行し、病気の長い期間にわたって病気の進行を測定するためのより敏感なオプションを提示します。さらより少なく退化した前肢は、軸索機能の強化を目的と治療のアプローチを評価するためのより強力なサイトを提供できます。
紹介したテクニックは、神経筋疾患のモデル マウスの解析に新たな可能性を提供するは明らかです。坐骨神経、腕神経叢から針電極と CMAP の録音は、軸索の損失を評価し、ハインド-も前肢のように脱髄迅速かつ再現性のある方法です。方法の感度著しい運動障害が記録することができますこれらの欠陥の早期の定量化できるように前にも軸索障害の検出が可能にします。また、繰り返しテストの可能性は必要な動物の数が減る、個々 の動物の異なるサイトで神経、神経因性の病気の進行の詳細な概要を提供します。

電気生理学は、運動ニューロン疾患、plexopathies、ニューロパシー、神経筋接合部の障害、ミオパシーなど神経筋疾患の診断ツールとして使用されます。筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、運動ニューロンを主に、影響を受ける軸索損傷や筋麻痺1が、減らされた CMAP 振幅の神経伝導検査 (NCS) に反映されます。シャルコー ・ マリー ・ トゥース病 (CMT) NCS2を使用して末梢神経の軸索変性と脱髄を推定できます。この手法は、疾患進行3,4の評価に関して同様の診断を確認するため使用できます。NCS は活動電位振幅5の大きさから推測して、軸索の病理学の評価を有効にして、遠位の遅延または伝導ブロック - 減らされた伝導速度の結果、脱髄の程度が長期化6。
CMAP 測定は、神経伝導の人間とマウスの両方を評価するため高速で機密性の高い方法です。患者も、NCS はマウスで別の神経と筋肉を記録する様々 なサイトで定期的に実行されるに対し、CMAP の測定は通常、後肢の神経機能を評価するために坐骨神経のためにだけ行われます。ただし、いくつかの動物実験であろうレコード CMAP 前面と後肢の両方に有利であるたとえば、前面と ALS モデルマウス後肢間差分の病気の進行に従うこと。
針電極を用いたマウスの前肢から概念地図を記録するためのメソッドを紹介します。さらに、針電極と同様に、後肢から概念地図を測定するためのアプローチを提供します。リング電極と後肢から概念地図の測定は、以前の7、8を提示されています。針電極を用いた概念地図の記録は迅速測定法、毛皮のシェービングを必要としない、ハインド - と前肢の両方を測定するための手順は、経験豊富な研究員動物あたりわずか 10 分。また、この低侵襲アプローチは動物の複数の神経の縦フォロー アップできるように繰り返し測定可能です。

<table><tbody><tr><td>Resuable subdermal needle electrode, Pl/Ir</td><td>Technomed</td><td>TE/S61-434</td><td>The Needle is 13 mm (0.51&quot;) in length, 0.4 mm (27G) in diameter</td></tr><tr><td>Natus electrodiagnostic system</td><td>Natus Neurology</td><td>UltraPro S100</td><td>EMG device</td></tr><tr><td>Synergy</td><td>Natus Neurology</td><td>version 20.1.0.100</td><td>EMG software for UltraPro S100</td></tr><tr><td>Physitem Controller</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td>Heating pad</td></tr><tr><td>combi-vet Base Anesthesia System Digital Flowmeter with TEC 3 Vaporize</td><td>Rothacher &amp;amp; Partner</td><td>CV 30-301-D</td><td>Isoflurane Vaporizer and flowmeter</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000 mg/g&amp;nbsp;</td><td>Piramal Healthcare UK Limited</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>SOD1-G93A mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#002726</td><td>ALS tg and non-tg control littermates, only females</td></tr><tr><td>PrP-hFUS-WT3 mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#017916&amp;nbsp;</td><td>ALS tg and non-tg control littermates, all groups balanced for males and females</td></tr><tr><td>C57BL/6Jax mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>Non-tg mice for axotomy, male and female</td></tr><tr><td>C61-PMP22 mice</td><td>Mouse line was generously donated&amp;nbsp; by Prof. M. Sereda (The Max Planck Institute of Experimental Medicine, G&amp;ouml;ttingen, Germany).</td><td></td><td>CMT tg and non-tg control littermates, all groups balanced for males and females</td></tr></tbody></table>

in vivo electrophysiological measurement of compound muscle action potential from the forelimbs in mouse models of motor neuron degeneration

神経軸索の機能を評価する神経筋疾患の進行の詳細情報を提供します。電気生理学的記録は、人間と齧歯動物モデルにおける神経伝導を測定する敏感なアプローチを提供します。マウスにおける筋電図計測のための技術的な可能性を広げる、針電極を用いた前肢の腕神経叢神経からの複合筋活動電位 (概念地図) の測定が記載されています。CMAP 録音後後肢の坐骨神経を刺激することが報告されています。新たに導入されたメソッドは、ここで追加のサイトで神経伝導性の評価は、し、したがって神経筋機能のより深遠な概要を提供します。技術は、機能軸索の相対的な数および髄鞘化レベルの両方の情報を提供します。これにより、このメソッドは、軸索の疾患だけでなく、脱髄性の条件の両方を評価するために適用できます。この低侵襲法は神経の抽出を必要としない、したがって同じ動物で縦方向のフォロー アップのための繰り返しの測定に適しています。同じような録音は、メソッドの並進運動の関連性を強調するため臨床設定で実行されます。

針電極を用いた概念地図の電気生理学的測定は、時間の経過とともに神経筋機能に従う低侵襲と非常に敏感な方法です。説明する手法はマウスの前肢神経伝導の評価をここでことができます、したがって、神経の機能に洞察力を提供します。
ALS、SOD1 G93A9と PrP hFUS WT310 (図 3) の 2 つのマウス モデルと CMT、C61 PMP2211,12 のマウスモデルの病コース中に後肢、前肢から CMAP 振幅と待機時間を測定しました。(図 4)。ALS 関連人間の遺伝子、すなわち、変異SOD1または野生型FUSの過剰発現による ALS マウス モデルを作成しました。両方のモデルでは、マウスは麻痺に至る進行性運動ニューロン変性に似た ALS を開発します。非遺伝子組換えの濾胞ハインド - と前肢の CMAP の振幅が時間 (図 3 a) をかけて変わらなかったと。その一方で、後肢から坐骨神経 CMAP 振幅が激減し 60 日頃発症前であってもに、、SOD1 G93A マウス (最初の運動症状は通常、3 ヶ月の年齢で観察される) に対し13.振幅は 90 非トランスジェニック (tg 以外) 祖父にその歳で mV SOD1 G93A マウス 30 のみだったに対し mV。のみ最小限のさらなる低下にあった振幅病気が 150 日の年齢で症候性後期に進むにつれて。CMAP の振幅の減少と前肢、後肢から坐骨神経と比較しての腕神経叢の神経の軸索の変性に遅れたしたがって。、前肢で病気の進行も CMAP としてはそれほど振幅減少 70 から 30 mV mV これらのマウスの運動障害の症状の前後に測定したとき。
ALS の PrP hFUS WT3 マウス モデルで運動障害の発症を約 28 日10CMAP の振幅の低下の開始と一致する年齢で開始します。これはマウス約 65 日間の年齢で終末期に達すると加速性が高い病気モデルです。CMAP 振幅の減少は、前肢、後肢 (3 D の図) で、以前の軸索変性を示す腕神経叢神経に比べて後肢の坐骨神経により急速に発生しました。この観察はこれらのマウス モデルの両方で特に病気プロセスの後期まで機能を維持前肢より前、後肢が麻痺しているの臨床的観察をサポートします。
一般に、刺激から活動電位の開始の遅延は前肢に比べて後肢 (図 3 b, E) で短かった。これは単に刺激と記録電極との間の短い距離です。待ち時間は、軸索の髄鞘化レベルの指標を提供します。着眼点は CMAP 待ち時間が、ALS のマウス ・ モデルにおける疾患進行中に長期化する ALS は脱髄性疾患ではないです。これは高速モータ軸索を行って、大きいの損失可能性があります。
人間 PMP22 の 3-4 のコピーを過剰発現する C61 PMP22 マウスとヘテロ マウスは、非常に穏やかな CMT1A 疾患表現型軽度の脱髄と削減の概念地図がない目に見える表現型11,12を要約します。1.5-2 年年齢 C61 PMP22 マウスの CMAP の振幅が減少し、待ち時間延長両方後肢で前肢 (図 4)。振幅の減少と健康な主題からの録音と比較して遅延応答を表示する代表的な録音はそれぞれ図 2bはで表示されます。前肢で CMAP 待ち時間は、後肢に限り、影響はありません。これは CMT1A 患者患者多い長さ依存障害14として CMT の病態生理学的性質のため下肢で深刻な減少または検出不可能な概念地図を持って.また、病気の重症度の程度と相関している遅延または伝導の速度よりもむしろ CMAP 振幅軸索整合性14,15度振幅を相互に関連付ける。それにもかかわらず、このメソッドは CMT1A で観察などのプロセスを脱髄性検出に十分に敏感な示唆されました。
潜時や振幅の変動は非組み換えグループで最下位 (係数変化の 2-15% と 1 ~ 13%、それぞれ)。遺伝子組み換えの場合、動物の間で病気の進行の違いによって引き起こされる可能性が最も高い測定 (振幅 8 51%、待機時間 1-21% の変動係数) より多くの変化があった。すべてのケースで、変化は、後肢、前肢に似ていた。針と表面電極の使用の変化は、16と同様に報告されています。
必要な刺激強度は非組み換え間大幅に変わらないと ALS モデル (図 3, F)。同様に、これらのケースで激刺激に到達するための必要な刺激と後肢に類似していた、5-12 mA の間で変化します。CMT の増加刺激強度の必要性は、認識された17をされており、C61 PMP22 マウス (図 4) に同じ表現が見られました。現象は、肥大 endoneurial 変更17から電気インピー ダンス増加によって説明されています。
5 ヶ月非組み換え C57BL/6Jax マウス (男性と女性) (の腕神経叢の神経の前肢から記録された CMAP 振幅が神経刺激と筋刺激がないことが原因だったことを確認するため行った一方的な部分的な膠図 5)。膠は、90 から CMAP 振幅を減少 20 mV mV、操作で軸索のほとんどが切断されたことを示します。対側の前肢、後肢の振幅で変化はないです。この結果強くことを示します上腕二頭筋の検出応答だった神経刺激による筋肉刺激起因しなかった。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig3.jpg"> 図 3。CMAP 振幅、遅延、および必要な刺激でハインド - 病気のコースと ALS の前肢をマウス モデル。非トランスジェニック (tg 以外) 同腹子と PrP-hFUS-WT3 (D-F) トランスジェニック (tg) マウス SOD1 G93A (A-C) の症状の段階で、運動症状の発症で測定した、病気の後期症状段階処理、年齢 57、91、147 日 (d)、または SOD1 G93A と PrP hFUS WT3 マウス、29、38、53 日でそれぞれ。黒: 非組み換え後肢、黒い破線: 非組み換え前肢、灰色: トランスジェニック後肢、灰色の破線: トランスジェニック前肢。± SD. 振幅を意味するように結果が表示されます (A, D) は、非遺伝子組換え動物後肢、前肢の両方で時間をかけて安定していた。トランスジェニック動物の病気プロセスの間に振幅が減少しました。待ち時間 (B, E) は病気によって受ける影響が小さく、後肢、前肢、遺伝子型に関係なく間の主な違いが認められました。すべてのグループ (C, F) の必要な刺激の変化が少なかった。SOD1 G93A N = tg 147 d、N を除くすべてのグループ 4 3 を =。年齢 29、38、および 53 の PrP hFUS WT3 マウス、N は 4、5、および 4、tg 以外の tg 7、5、3、それぞれ。シンボルは次のようにグループ間の差を意味: *: tg 後肢、# 対非 tg 後肢: tg 前肢対非 tg 前肢 ¤: 非 tg 前肢、灰色対非 tg 後肢 *: tg tg 前肢と後肢。テューキーの二元の多重比較検定 *: p < 0.05 * *: p < 0.01 * * *: p < 0.001 * * *: p < 0.0001 #: p < 0.05、##: p < 0.01 ###: p < 0.001 ###。: p < 0.0001。 ¤: p < 0.05 埋: p < 0.01 ¤¤¤: p < 0.001 ¤¤¤: p < 0.0001。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig4.jpg"> 図 4。CMAP 振幅、遅延、および後肢-必要な刺激と CMT1A マウスの前肢。C61 PMP22 トランスジェニック (tg) マウスと非トランスジェニック (tg 以外) 同腹子を 1.5-2 歳で測定しました。振幅 (A) は、ハインドとトランスジェニック マウスの前肢の両方を減少しました。待ち時間 (B) の延長を認めたすべての CMT のマウスの手足と前肢にも微妙な変化がこの測定で検出されました。刺激強度 (C) の要件は CMT1A 患者で検出された表現型に似ている C61 PMP22 マウスで増加しました。結果を示す平均 ± SD 以外 tg N = 4 と tg N = 3。Sidak で双方向の分散分析の多重比較検定 * *: p < 0.01 * * *: p < 0.0001。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig5.jpg"> 図 5。前肢活動電位は神経刺激によって引き起こされます。観測された CMAP は筋肉刺激によって引き起こされた可能性を除外するには、(部分的な) 膠は腕神経叢の神経で実行されました。CMAP 振幅 (A) と (B) の遅延は、(前に) 前に記録された 4 日後 (ポスト) 腕神経叢の膠大人非トランスジェニック マウスと。膠は、神経刺激による応答があったことを示す CMAP 振幅を減少しました。黒: 後肢、灰色: 対側の前肢、灰色点線: 同側の前肢。結果は、平均 ± SD、N として表示 = 2。<a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

神経伝導測定神経変性のマウス ・ モデルを評価するために有用なツールだけど、よく後肢で坐骨神経を刺激するためにのみ適用されます。ここでは、複合筋活動電位 (CMAP)生体内で腕神経叢によって支配されているマウスの前肢筋を測定する手法について述べる。

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

19.2K ビュー.  KU Leuven - University of Leuven. 神経伝導測定神経変性のマウス ・ モデルを評価するために有用なツールだけど、よく後肢で坐骨神経を刺激するためにのみ適用されます。ここでは、複合筋活動電位 (CMAP)生体内で腕神経叢によって支配されているマウスの前肢筋を測定する手法について述べる。

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Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles

Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the functional status of a motor unit pool in vivo. These measures can provide insight into the normal development and degeneration of the neuromuscular system. These measures have clear translational potential because they are routinely applied in diagnostic and clinical human studies. We present electrophysiological techniques similar to those employed in humans to allow recordings of mouse sciatic nerve function. The CMAP response represents the electrophysiological output from a muscle or group of muscles following supramaximal stimulation of a peripheral nerve. MUNE is an electrophysiological technique that is based on modifications of the CMAP response. MUNE is a calculated value that represents the estimated number of motor neurons or axons (motor control input) supplying the muscle or group of muscles being tested. We present methods for recording CMAP responses from the proximal leg muscles using surface recording electrodes following the stimulation of the sciatic nerve in mice. An incremental MUNE technique is described using submaximal stimuli to determine the average single motor unit potential (SMUP) size. MUNE is calculated by dividing the CMAP amplitude (peak-to-peak) by the SMUP amplitude (peak-to-peak). These electrophysiological techniques allow repeated measures in both neonatal and adult mice in such a manner that facilitates rapid analysis and data collection while reducing the number of animals required for experimental testing. Furthermore, these measures are similar to those recorded in human studies allowing more direct comparisons.

Electrophysiological Motor Unit Number Estimation MUNE Measuring Compound Muscle Action Potential CMAP in Mouse Hindlimb Muscles

We present refined protocols that allow in vivo monitoring of motor unit function in the mouse. Techniques to measure compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) in the mouse hind limb muscles innervated by the sciatic nerve are described.

電気生理学的運動単位数の推定（MUNE）マウス後肢の筋肉に複合筋活動電位（CMAP）の測定

Compound muscle action potential (CMAP) and motor unit number estimation (MUNE) are electrophysiological techniques that can be used to monitor the ...

行動学

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

神経科学

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する<em&gt;インビボ</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

アン<em&gt;体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための&gt;成体マウス筋肉神経の準備

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

神経筋接合部機能を測定

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and latency detect chronic axon loss and demyelination, respectively. Axonal excitability techniques &#34;by threshold tracking&#34; expand upon these measures by providing information regarding the activity of ion channels, pumps and exchangers that relate to acute function and may precede degenerative events. As such, the use of axonal excitability in animal models of neurological disorders may provide a useful in vivo measure to assess novel therapeutic interventions. Here we describe an experimental setup for multiple measures of motor axonal excitability techniques in the rat ulnar nerve.
The animals are anesthetized with isoflurane and carefully monitored to ensure constant and adequate depth of anesthesia. Body temperature, respiration rate, heart rate and saturation of oxygen in the blood are continuously monitored. Axonal excitability studies are performed using percutaneous stimulation of the ulnar nerve and recording from the hypothenar muscles of the forelimb paw. With correct electrode placement, a clear compound muscle action potential that increases in amplitude with increasing stimulus intensity is recorded. An automated program is then utilized to deliver a series of electrical pulses which generate 5 specific excitability measures in the following sequence: stimulus response behavior, strength duration time constant, threshold electrotonus, current-threshold relationship and the recovery cycle.
Data presented here indicate that these measures are repeatable and show similarity between left and right ulnar nerves when assessed on the same day. A limitation of these techniques in this setting is the effect of dose and time under anesthesia. Careful monitoring and recording of these variables should be undertaken for consideration at the time of analysis.

In Vivo Electrophysiological Measurement of the Rat Ulnar Nerve with Axonal Excitability Testing

Axonal excitability techniques provide a powerful tool to examine pathophysiology and biophysical changes that precede irreversible degenerative events. This manuscript demonstrates the use of these techniques on the ulnar nerve of anesthetized rats.

生体内で軸索興奮性のテストでラットの尺骨神経の電気生理学的測定

Electrophysiology enables the objective assessment of peripheral nerve function in vivo. Traditional nerve conduction measures such as amplitude and ...

<meta charset="utf8"></head><body>マウス長耳挙筋におけるエレクトロポレーションと神経損傷

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many organisms. At the NMJ, a presynaptic motor axon terminal contacts a muscle postsynaptic domain and is covered by terminal Schwann cells. The integrity and function of the NMJ is compromised under several conditions, including aging, neuromuscular diseases, and traumatic injuries. To analyze the potential contribution of muscle-derived proteins to NMJ maintenance and regeneration, an in vivo gene transfer strategy has been combined with the denervation of the cranial levator auris longus (LAL) muscle after mechanical nerve injury. Previous findings showed that the forced expression of control fluorescent proteins does not alter NMJ organization or neurotransmission. This procedure aims to describe a detailed method of in vivo electroporation of the LAL muscle followed by transection or crushing of the specific branch of the facial nerve innervating cranial muscles, leading to NMJ denervation and reinnervation, respectively. The combination of these experimental strategies in the convenient LAL muscle constitutes an efficient method to study the potential contribution of muscle protein overexpression or silencing in the context of short-term NMJ reinnervation.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:神経損傷後の神経筋接合部における筋タンパク質の再生的役割

Here, we present a protocol that combines in vivo electroporation and denervation of the cranial levator auris longus (LAL) muscle. This procedure enables the study of the potential role of muscle-derived proteins in the regeneration of the neuromuscular synapse.

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

要約

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電気生理学的運動単位数の推定（MUNE）マウス後肢の筋肉に複合筋活動電位（CMAP）の測定

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録

マウス坐骨神経に生体内電気生理学的測定値の

後根潜在的記録によりマウスにおける脊髄シナプス前抑制を測定する

アン

神経筋接合部機能を測定

生体内で軸索興奮性のテストでラットの尺骨神経の電気生理学的測定

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ

頭蓋挙筋長耳骨格筋の In vivo エレクトロポレーションと短期再神経支配の組み合わせ