Name: an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents
Uploaded: 2014-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
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This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

適切な国内および機関の倫理、動物実験を行う前に取得する必要があります。 EDL筋肉と神経の1の除去<ol><li>計量し、深く、5％イソフルランプラス1.5リットル/分の酸素流量や底面のイソフルオラン浸した綿でベルジャで気化器を使用して吸入イソフルオランで成体マウスを麻酔。 </li><li>マウスが深く麻酔をかけているとつま先のピンチに応答しないことを確認してください。すぐに大規模な、鋭利にハサミやギロチンを使用して首を切る。 </li><li>はさみを使用して、リブを介して腹側正中カットを作成し、内臓を取り除く。 </li><li>首のエリアから肌をつかみ、足を過ぎて、それを引っ張って動物スキン。 </li><li>腰の上に切断することによって脚を除去し、冷却した（4℃）で皿に肌の足を置く、carbogenated（95％O 2、5％CO 2）、低カルシウム、高マグネシウム、重炭酸緩衝生理食塩水contaimM単位寧：128のNaCl、1.9のKCl、1.2 KH 2 PO 4、26 NaHCO 3を、0.85のCaCl 2、6.5のMgSO 4、および10グルコース（7.4±0.05のpH）16。低カルシウムは、高マグネシウム溶液は、解剖時にシナプス伝達を阻害する。 </li><li>皿に脚の背側を上に置き、足をピンと膝と足首の関節が90°の角度になるように注射針や虫ピンを使ってヒップ。足の両端にピンを配置し、前部と後部のそれぞれに1ピンが所定の位置に組織を保持するために太もも。 </li><li>カストロ春のはさみを使用して、太ももに筋肉の最上層を持ち上げ、真下坐骨神経を露出させるために正中カットをする。坐骨神経はちょうどトップ筋層の下に位置しており、ちょうど膝関節の前に総腓骨と脛骨神経に分岐するまでの腰近くの出口から大腿骨の上に実行されます。 </li><li>経口まで坐骨神経上記の筋肉を削除するint型は、時趾屈長母（FHL）筋への深い腓骨神経枝ダイブが見える。 </li><li> ＃55鉗子を使用して、脛骨の内側にある腓腹筋とヒラメ筋、からそれを解放するために腓骨枝の周囲の結合組織を解剖。腓腹筋とヒラメ筋の腱を切って、慎重に神経の下から削除します。 </li><li>横する関節から内側足首に三つの異なる腱バンドルを露出させ、脛骨の側面に表面的な筋肉を削除します。FHL、EDL、および前脛骨（TA）、TAの下に隠されたEDLに。 </li><li>持ち上げてEDLからのTAを持ち上げ、足関節でのTA腱をカットし、それを除去するための膝の近くの筋肉を切った。 </li><li>足首でFHL腱を切り、神経がFHLに入る領域に到達するためにそれを戻って持ち上げます。ちょうどその点未満にカットし、FHL筋の〜2/3を削除します。 </li><li> POSなどの股関節に近い坐骨神経をカットsible、優しく深い腓骨ブランチを除くすべての神経枝を剥ぎ取る。 </li><li>大春のはさみを使用して、両方の足首と膝関節でのEDLの腱をカット。 </li><li>鋭いハサミを使用して、膝に脛骨骨を切断することにより、周囲の組織からEDL、残りのFHLと神経を除去し、太ももの途中。ただEDL、FHLの一部と神経が残るように、残りの脛骨を離れてカットします。 </li></ol>組織浴にEDL筋肉と神経の2。取り付け（図1A） <ol><li>実験開始前に、組織風呂を準備します。常に一緒にお風呂を灌流酸素化（100％O 2）の合成の間質液（SIF）123のNaCl、3.5塩化カリウム（単位：mm）を含む、0.7 硫酸マグネシウム、1.7のNaH 2 PO 4、2.0のCaCl 2、9.5 NAC 6 H 11 O（グルコン酸ナトリウム）、5.5グルコース、7.5スクロース、および10 N-2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2·エhanesulfonic酸（HEPES）; pHが7.4±0.05 17。 15〜30ミリリットル/分の流量を推奨します。力と長コントローラ（概算風呂寸法8.5センチメートル×3センチ×1センチメートルための槽の底、マウントされた組織ポストとマウントに固定された2つの刺激電極との25ミリリットルの容量の市販の入浴も示されている。仕様）材料/機器の表を参照してください。 </li><li>孤立筋肉神経を処理し、組織浴にそれを配置するために、残りのFHL組織を使用してください。皿の底にSYLGARDの小片を置き、筋肉を安定させるために、残りのFHL組織を通して虫ピンを使用します。 </li><li> （仕様のための材料/機器の表を参照のこと）力と長制御部のレバーアームの両方に腱を結ぶ組織ポストに一端を固定し、他のために6-0絹縫合糸を使用してください。実用的で最小の縫合糸の長さを使用してください。あなたは腱を縛られた後虫ピンとSYLGARDを削除します。注：簡単に促進するために、レバーへの接続は、ワイヤの小片は、エポキシでレバーアームに「J」字形フックに曲げて固定することができるアーム。縫合糸は、ワイヤに接続された代わりに、レバーアームの小さな穴に通すことができる。 </li><li>第一のガラスマイクロピペットプラー（ヒート= 286、プル= 0、速度= 150、時間= 200）を使用して、SA 16ガラス吸引電極を作る; 3ミリメートルテーパー程度があるまで研ぎ石でそれを挽くバックし、手動で先端を破る。 （製品の詳細は、電極回路図について図1B-1C参照マテリアル/機器の表）1からサ ​​ンプルを希望する神経の面積に応じて以下10から100の間の所望の先端内径にマイクロフォージを使用して先端部を溶融。 </li><li> SIF内側銀線にあらかじめ作られたガラス吸引電極を埋める。 </li><li>電極中に神経の切断端を吸引し、差動増幅器の正のポートに接続します。塩素化銀電極を包みヘッドステージの負のポートに接続するワイヤ。グラウンドヘッドステージの接地ポートにバスからの第塩素化銀線を実行することにより、SIF風呂。また、灌流ポンプを介して導入された電気的ノイズを軽減するために、複数の点でのファラデーケージに灌流チューブを接地してください。 </li><li>単収縮を誘発する組織浴中の筋肉のいずれかの側に取り付けられた電極を介して筋肉を刺激する。あるいは、神経の切断端に刺激電極を配置します。ピーク収縮力が観察されるまで刺激電圧を増加させ、その後、最大上電圧（0.5ミリ秒パルス幅）に到達するために追加の15％の電圧を増加させる。中間の10秒の残りの部分と、最大上電圧で筋収縮を続けますが、ピーク収縮力が筋肉の最適な長さ（L o を ）見つけることが達成されるまで、筋肉の長さを変える。すべての長さのスロープや振動はこのLENGで筋肉始まります目。 </li><li>筋神経調製物は組織浴温度に到達するために、正常なシナプス伝達のための低カルシウム溶液中で解離下記回復できるように、その後のデータ収集の前に少なくとも1時間、浴中に留まることを可能にする。 </li><li>室温以外の温度でデータを収集するには、筋肉に近い組織浴に温度プローブを配置します。ゆっくり組織浴ベースプレートを介して加熱された水をポンプで温度に風呂を上に持って来る。定常温度を維持するのを助けるために、SIF貯水池の周りに粘土電子レンジ加熱用のパッドを包みます。 </li></ol> 3。データ収集<ol><li>スピンドル求心としての求心性を識別するために、秒ごと配信0.5ミリ最大上電圧刺激により生成繰り返さ筋収縮時の神経活動を記録します。注：筋紡錘求心性は、攣縮18,19（ 図2）中に一時停止する必要があります。 </li><li>ダを使用してくださいtaの取得ソフトウェアは、異なる速度で異なる長さに、長さ変更を適用します。 （与えられたストレッチをカスタマイズする方法上のスクリプトや方向のスクリーンショットのための補足情報を参照）、この作業を自動化するカスタムスクリプトを使用してください。 2.5％、5％、7.5％L o のストレッチの長さおよび/ ​​秒15 20、40、または60％のL o の延伸速度で4秒のランプ·アンド·ホールド·ストレッチを適用する。注：必要な電圧 - ミリメートル換算係数の具体的な力と長コントローラのマニュアルを参照してください。 </li><li>実験の最後に、最大の等尺性強縮性収縮（500ミリ列車、120 Hzの列車の周​​波数、0.5ミリ秒パルス幅、最大上電圧）を用いて24℃で筋肉の状態を判断する。以前に報告された値にピーク収縮力の比較（〜24 N / cm 2の9,20）。 </li></ol>

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The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

この記事の目的は、単離したマウスの筋肉の神経に備えて筋紡錘求心性神経から記録するための方法を説明することでした。私たちは、マウスのスピンドル求心性神経は、ラット、ネコとヒト15からのもののように伸ばすことも同様に応答することを見出し、他の研究室は、in vitroで 、筋肉と皮膚の両方で感覚ニューロンを研究するためのモデル生物としてマウスを使用していた（例えば、3,13用） 。 筋肉感覚求心性は、24℃と34℃の両方で少なくとも6-8時間記録することができる。 EDLや神経を扱う最小限に抑えるために、可能な限り、組織を処理するためにFHLの残りの部分を使用しています。解剖後、組織浴温度にし、回復するための正常なシナプス伝達のために平衡化させるためにデータ収集を開始するために、少なくとも1時間待つ。以前は、筋肉の健康は最大の強縮コントラことを決定することによって、この調製に用いられる筋肉のサブセット上で検証した筋肉によって生成されたctile力は、実験15の最初と最後に他者によって報告されたものと同様である。 筋紡錘の求心性は、（ 図3）（図2）収縮をけいれんに応じて、焼成中に特徴的なポーズを探しているだけでなく、長さの変化に応じて、予想される瞬間的な周波数が増加することによって、この準備として、機能的に同定された。われわれの経験では、制御条件に火災最も求心性は、筋紡錘求心性はある。この調製物（約7ミリメートル最大）に保持神経の長さは、筋求心性亜型13を識別するために求心性伝導速度の違いを利用するのに十分な長さではない。また、猫と人間とは異なり、動的な感度の指標は明らかにマウスではIa族およびII求心性を区別することができませんでした（さらなる議論のためにウィルキンソンらを参照してください。15）。求心性神経の他のサブタイプ（ すなわち、グループIIIおよびIV） など 、カプサイシン、ATP、またはブラジキニンのような物質を添加浴pHの低下、虚血筋肉を露出することによって、例えば、この製剤中の追加の機能テストを用いて同定することができる3,13,21-23吸引電極を使用すると、単一の筋から採取することができるデータ量を増加させる、複数の感覚ニューロンからの活動を一度に記録することができる。この調製物は、感覚ニューロン群の応答または識別された求心性神経の応答に対する摂動の全体的な効果を評価するために使用することができる。スパイク形状が十分に一意である場合、最大4感覚ニューロンは（Spike2（ケンブリッジ電子設計）とLabChartのプロ（のAD·インスツルメンツ）の両方が同様に行われている）ソフトウェアによって判別することができる。ニューロンが判別できない場合において、電極配置や先端径の変化を容易に実現することができる。 体外 prepar における要約すると、マウスの筋肉神経ationは、さまざまな物理化学的摂動、傷害および疾病モデルに筋肉感覚求心性神経の応答特性を調べるために使用することができる簡単な実験的アプローチである。さらに、この製剤は、理想的にトランスジェニック動物および光遺伝学的ツールを含むマウスで利用できる強力な遺伝子ツール、を活用するために適しています。

骨格筋は、筋肉環境に関する重要な情報を中枢神経系を提供する感覚ニューロンにより神経支配されています。筋紡錘は、高度extrafusal筋線維と平行に配置されている錘内筋線維から構成されるカプセル化された構造を特化されます。スピンドルは、Ia族によって支配され、筋肉の長さと錘内繊維のトーンの変化をエンコードII求心性神経支配が動的ガンマ運動ニューロン1によって調節される。 Ib族求心性神経は、筋収縮の2中に筋線維とその腱の挿入の間に配置され、筋力の変化に敏感である、例えばれている。 Ia族、IbおよびIIの求心性は、適切なモータ制御に役立つ固有受容フィードバックを提供する。筋肉全体に配置筋求心性神経の追加の集団（群IIIおよびIV）代謝産物の蓄積、侵害刺激の存在、および筋肉の温度を通知するために役立つ<sup&gt; 3。この筋肉感覚情報は、恒常性を維持する筋肉損傷を防止し、動きを調節するために重要である。筋肉求心性は、以前の経験4に基づいて発火パターンを変更することができます。侵害受容器の活性化は、バランスや動き6で問題につながる可能性の筋自己受容器からの慢性疼痛状態5と異常なシグナル伝達の誘導につながることができます。私たちは、（図示2-4月齢のC57BL / 6マウスからの応答である）両方の性別の成体マウスから筋肉感覚神経受容体終末の応答を研究するために体外に備えて孤立筋肉神経を使う。マウスは、哺乳類での研究のためのモデルの遺伝種である。この準備は、坐骨神経の深い腓骨枝と長指伸筋（EDL）筋、下腿の外側部で見つかった腓骨グループの速筋の筋肉の単離を必要とする。 EDLは、多くの場合、筋肉の収縮特性7-9を研究するために使用され、TEを持ってい隔離し、安静時および合理的な収縮のデューティ·サイクル10で十分な拡散性の酸素供給を可能にするのに十分に小さいが容易であるndons。 （インスタンスヒラメと前脛骨用）このエリアの他の筋肉が同様の大きさのものであり、この準備は簡単にこれらの筋肉からの求心性神経から記録するように修正することができる。吸引電極は、筋肉感覚求心性発火を記録するために、神経の切断端上に配置される。個別のニューロンを識別し、スパイクソーティングソフトウェアを使用してスパイク形状に基づいて分析することができる。浴中または神経に刺激電極は、筋収縮を誘発するために使用することができる。筋肉の長さおよび力が制御され、市販のシステムを用いて測定することができる。同様のin vitro調製物は、ラットのEDL 11、Ia族およびラットの第四虫様つま先筋12とtにおけるグループIIIおよびIV筋求心性神経のII紡錘求心性神経でのグループIIIおよびIV筋求心性神経を研究するためにげっ歯類で使用されてきた彼のマウス足底筋13。 in vitroの系では、薬理学的ア ​​クセシビリティと温度およびpHなどの灌流液および生理化学的変数を直接制御の利点を有している。 in vitroでのアプローチは、麻酔や筋肉灌流状態の潜在的なin vivoでの交絡を排除します。筋肉神経準備が求心上の摂動の直接的な反応の研究を可能にするが、in vivoで14またはex 3の製剤のように犠牲にされている生体内で可能な主軸感度および他の集積反応のガンマ遠心性変調を研究する能力この準備には神経細胞体は存在しない。 この調製は、以前のランプの電池に対するマウス筋紡錘求心性神経の応答を特徴付けストレッチや振動を保持するために使用し、これをマウススピンドル求心性RESPONSことが決定されたエスは、ラット、ネコ、及びヒトのような他の種で報告されたものと同様であった。マウススピンドル求心性応答は、34℃、絶対発火率で速かったものの、24℃と34℃の浴温の両方で類似していることが判明し、求心性は、15を変えるより速く長さに対応することがよりできたました。私たちは、この準備が筋紡錘求心性神経を特定し、研究するために使用する方法を下に説明します。さらに、この調製物は、容易に薬物または疾患状態または各種他の変数（ 例えば 、年齢、性別、遺伝子ノックアウト）に応答して、感覚求心性神経の特性を比較するために、他の筋肉の求心性亜型13の応答を研究するために修飾することができる。

<table><tbody><tr><td>Force and Length Controller &amp;amp; Tissue Bath</td><td>Aurora Scientific, Inc.</td><td>300C-LR &amp;amp; 809B-IV&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &amp;amp; Easy Load II Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07523-80 &amp;amp; EW-77200-60</td><td></td></tr><tr><td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &amp;amp; Headstage Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 1800; 700000 &amp;amp; 700500</td><td></td></tr><tr><td>Simulator</td><td>Grass&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; Aurora Scientific, Inc.</td><td>S88&lt;br/&gt; OR&lt;br/&gt; 701 C</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Swift</td><td>892070</td><td></td></tr><tr><td>Fiber Optic Light Source</td><td>Fiberlite</td><td>Model 190</td><td></td></tr><tr><td>Analog to Digital Board</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition &amp;amp; Analysis Software</td><td>AD Instruments</td><td>LabChart Pro 7</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>A-M Systems</td><td>672445</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Glass</td><td>Dagan</td><td>SA16</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td></td></tr><tr><td>Isoflourane</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>18627</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Surgical Tools&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Large Dissecting Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14014-17</td><td></td></tr><tr><td>Large Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Large Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>#55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharp Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Silk Suture</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF&lt;br/&gt; (Low Calcium solution is equilibriated with 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05; SIF is equilibriated with 100% O2 gas and pH of 7.4 &amp;plusmn; 0.05)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium gluconate</td><td>Sigma</td><td>S2054-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S8282-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

筋肉感覚ニューロンは筋紡錘やゴルジ腱器官は固有感覚に不可欠な長さと力の変化をエンコード支配。追加の求心性線維は、代謝産物の蓄積、温度、および侵害刺激を含む筋肉の環境の他の特性を、監視する。全体的に、感覚ニューロンの異常な活性化は、運動障害または慢性疼痛症候群につながることができます。私たちは、成体マウスでのストレッチ誘発求心性応答のin vitro研究のため長指伸筋（EDL）筋肉と神経の単離を記載している。感覚活動は吸引電極で神経から記録され、個別の求心性は、スパイクソーティングソフトウェアを用いて解析することができる。 インビトロ製剤は、麻酔の潜在的な交絡または変更された筋肉の灌流のない感覚求心性神経上の十分に制御された研究を可能にします。ここでは、識別してストレッチする筋紡錘求心性神経の応答を試験するためのプロトコルを記述します。重要なことは、この製剤はまた、薬物のアプリケーションおよびマウスでの強力な遺伝的アプローチと疾患モデルの取り込み後の筋求心性神経、応答特性の他のサブタイプの研究をサポートしています。

筋求心性神経の応答が研究されている求心性サブタイプに応じて、摂動の多様以下を記録することができる。筋収縮とランプやストレッチを保持するために筋紡錘求心性神経の代表的な応答がここに示されています。スピンドル求心としての求心性を識別するために、単収縮収縮は収縮18,19の間に発射の一時停止があるかどうかを確認するために一度毎秒（0.5ミリ秒パルス幅）が与えられる。 図2に、中に代表的神経活動のトレースと筋肉の緊張を示していますこれらの筋収縮。スピンドル求心性のために予想されるように無神経活動は、筋収縮時に観察されない。記録された求心性はIb族ゴルジ腱器官の求心性だった場合、収縮中に発火率の増加が予想されるであろう。 34℃での規則的な発火パターン（24℃、〜12インパルス/秒〜32インパルス/秒を備えた制御条件の下で、ほとんどの求心）筋紡錘求心です。スピンドル求心性のサブセットは、ストレッチ中のみの火災（スピンドル求心性神経の私たちの手の中に〜11％）15。 図3Aは、ランプへの対応2筋紡錘求心性神経の代表生の痕跡を示しており、力と長コントローラによって生成されるストレッチを開催します。 LabChartののスパイクヒストグラム機能は個別に（ 図3B-3C）二つの個別のニューロンの瞬時発火頻度を特定し、分析するために使用される。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> 図1の単離された筋肉の調製A）長指伸筋（EDL）および神経支配坐骨神経を含酸素合成の間質液（SIF）で灌流単離された組織浴中に取り付けられている。 suctiに接続され、細胞外アンプ電極上に神経活動を記録します。適切なソフトウェア·コントロールと対策筋力と長コントローラを備えたデュアル力と長さ。組織浴電極は、けいれんや強直収縮を生成するために刺激を提供します。 。Cは、マイクロフォージを使用して生成された吸引電極のための理想的な先端形状の描写に拡大））のB。内槽プレートチャネルを通じて加熱された水を〜3ミリメートルで先細り先端をガラス吸引電極を引っ張った組織浴温度を制御するポンプ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> 収縮を痙攣させる図2スピンドル求心性応答。神経たアクティビティY（上のトレース）および30筋の収縮からの筋肉の緊張（下のトレース）は、黒のトップ重なり合うトレースが重畳されている。求心性活動は、筋紡錘求心性神経の応答特性である収縮誘発性の張力増加、中に一時停止します。上のトレース上のブラケットと矢印は活動を一時停止している収縮の間の時間を示している。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> 図3スピンドル求心性応答は、ランプやストレッチAホールド）2求心性（上のトレース）の生の神経活動をランプ中およびEDL（下のトレースに示す筋長）。B）瞬時発火頻度（INSTに適用されるストレッチを保持する 。 A（青色で表示）からoを Lの活性を示す単位の神父、毎秒インパルス）。C）Instantane唯一の火災ストレッチ中に（オレンジ色で表示）より小さな単位のOUは発火頻度。両ユニットは、筋紡錘求心1の特徴であるストレッチ中にスパイク頻度順応を示す。

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An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。

アン<em&gt;体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための&gt;成体マウス筋肉神経の準備

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

17.0K ビュー.  San José State University. 筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。 

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in animals and humans. These peripheral sensory nerve fibers express a plethora of receptors and ion channel proteins which detect and initiate specific sensory stimuli. Methods are available to characterize the electrical properties of peripheral sensory nerve fibers innervating the skin, which can also be utilized to identify the functional expression of specific ion channel proteins in these fibers. However, similar electrophysiological methods are not available (and are also difficult to develop) for the detection of the functional expression of receptors and ion channel proteins in peripheral sensory nerve fibers innervating other visceral organs, including the most challenging tissues such as bone. Moreover, such electrophysiological methods cannot be utilized to determine the expression of non-excitable proteins in peripheral sensory nerve fibers. Therefore, immunostaining of peripheral/visceral tissue samples for sensory nerve fivers provides the best possible way to determine the expression of specific proteins of interest in these nerve fibers. So far, most of the protein expression studies in sensory neurons have utilized immunostaining procedures in sensory ganglia, where the information is limited to the expression of specific proteins in the cell body of specific types or subsets of sensory neurons. Here we report detailed methods/protocols for the preparation of peripheral/visceral tissue samples for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. We specifically detail methods for the preparation of skin or plantar punch biopsy and bone (femur) sections from mice for immunostaining of peripheral sensory nerve fibers. These methods are not only key to the qualitative determination of protein expression in peripheral sensory neurons, but also provide a quantitative assay method for determining changes in protein expression levels in specific types or subsets of sensory fibers, as well as for determining the morphological and/or anatomical changes in the number and density of sensory fibers during various pathological states. Further, these methods are not confined to the staining of only sensory nerve fibers, but can also be used for staining any types of nerve fibers in the skin, bones and other visceral tissue.

Immunocytochemical identification of peripheral sensory nerve fiber subtypes (and detection of protein expression therein) are key to the understanding of molecular mechanisms underlying peripheral sensation. Here we describe methods for preparation of peripheral/visceral tissue samples, such as skin and limb bones, for specific immunostaining of peripheral sensory nerve fibers.

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

神経科学

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

培養皿内の機能モーターユニット：脊髄外植片と筋細胞の共培養

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

The spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural function because it is a neuron of the central nervous system with the unique properties of (1) having readily identifiable targets (the muscle fibers) and therefore having a very well-known function (to control muscle contraction); (2) being the convergent target of many spinal and descending networks, hence the name of "final common pathway"; and (3) having a large soma which makes it possible to penetrate them with sharp intracellular electrodes. Furthermore, when studied in vivo, it is possible to record simultaneously the electrical activity of the motoneurons and the force developed by their muscle targets. Performing intracellular recordings of motoneurons in vivo therefore put the experimentalist in the unique position of being able to study, at the same time, all the compartments of the "motor unit" (the name given to the motoneuron, its axon, and the muscle fibers it innervates1): the inputs impinging on the motoneuron, the electrophysiological properties of the motoneuron, and the impact of these properties on the physiological function of the motoneurons, i.e. the force produced by its motor unit. However, this approach is very challenging because the preparation cannot be paralyzed and thus the mechanical stability for the intracellular recording is reduced. Thus, this kind of experiments has only been achieved in cats and in rats. However, the study of spinal motor systems could make a formidable leap if it was possible to perform similar experiments in normal and genetically modified mice.
For technical reasons, the study of the spinal networks in mice has mostly been limited to neonatal in vitro preparations, where the motoneurons and the spinal networks are immature, the motoneurons are separated from their targets, and when studied in slices, the motoneurons are separated from most of their inputs. Until recently, only a few groups had managed to perform intracellular recordings of motoneurons in vivo2-4 , including our team who published a new preparation which allowed us to obtain very stable recordings of motoneurons in vivo in adult mice5,6. However, these recordings were obtained in paralyzed animals, i.e. without the possibility to record the force output of these motoneurons. Here we present an extension of this original preparation in which we were able to obtain simultaneous recordings of the electrophysiological properties of the motoneurons and of the force developed by their motor unit. This is an important achievement, as it allows us to identify the different types of motoneurons based on their force profile, and thereby revealing their function. Coupled with genetic models disturbing spinal segmental circuitry7-9, or reproducting human disease10,11, we expect this technique to be an essential tool for the study of spinal motor system.

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

This new method permits the simultaneous intracellular recording of a single adult mouse motoneuron and the measurement of the force produced by its muscle fibers. The combined investigation of the electrical and mechanical properties of motor units in normal and genetically modified animals is a breakthrough for the study of the neuromuscular system.

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

The  spinal motoneuron has long been a good model system for studying neural  function because it is a neuron of the central nervous system with the ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</em成体マウスの筋層間神経叢から分離腸ニューロンとグリアの&gt;準備

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The approach allows unbiased identification and functional characterization of individual colorectal afferents. Extracellular recordings of propagated action potentials (APs) that originate from one or a few afferent (i.e., single-fiber) receptive fields (RFs) in the colorectum are made from teased nerve fiber fascicles. The colorectum is removed with either the pelvic (PN) or lumbar splanchnic (LSN) nerve attached and opened longitudinally. The tissue is placed in a recording chamber, pinned flat and perfused with oxygenated Krebs solution. Focal electrical stimulation is used to locate the colorectal afferent endings, which are further tested by three distinct mechanical stimuli (blunt probing, mucosal stroking and circumferential stretch) to functionally categorize the afferents into five mechanosensitive classes. Endings responding to none of these mechanical stimuli are categorized as mechanically-insensitive afferents (MIAs). Both mechanosensitive and MIAs can be assessed for sensitization (i.e., enhanced response, reduced threshold, and/or acquisition of mechanosensitivity) by localized exposure of RFs to chemicals (e.g., inflammatory soup (IS), capsaicin, adenosine triphosphate (ATP)). We describe the equipment and colorectum&#8211;nerve recording preparation, harvest of colorectum with attached PN or LSN, identification of RFs in the colorectum, single-fiber recording from nerve fascicles, and localized application of chemicals to the RF. In addition, challenges of the preparation and application of standardized mechanical stimulation are also discussed.

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

医学

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative to understand the cellular and molecular changes involved in maintaining and repairing NMJs. For this purpose, we have developed a method to reliably and consistently examine regenerating NMJs in mice. This nerve injury method involves crushing the common fibular nerve as it passes over the lateral head of the gastrocnemius muscle tendon near the knee. Using 70 day old female mice, we demonstrate that motor axons begin to reinnervate previous postsynaptic targets within 7 days post-crush. They completely reoccupy their previous synaptic areas by 12 days. To determine the reliability of this injury method, we compared reinnervation rates between individual 70 day old female mice. We found that the number of reinnervated postsynaptic sites was similar between mice at 7, 9, and 12 days post-crush. To determine if this injury assay can also be used to compare molecular changes in muscles, we examined levels of the gamma-subunit of the muscle nicotinic receptor (gamma-AChR) and the muscle-specific kinase (MuSK). The gamma-AChR subunit and MuSK to are highly upregulated following denervation and return to normal levels following reinnervation of NMJs. We found a close relationship between transcript levels for these genes and innervation status of muscles. We believe that this method will accelerate our understanding of the cellular and molecular changes involved in repairing the NMJ and other synapses.

We have developed a nerve injury method to reliably examine muscle reinnervation, and thus regeneration of neuromuscular junctions in mice. This technique involves injuring the common fibular nerve via a simple and highly reproducible surgery. Muscle reinnervation in then assessed by whole-mounting the extensor digitorum longus muscle.

腓骨神経損傷方法：神経筋接合部を修復信頼性の高い同定するためのアッセイおよびテスト要因

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

神経筋接合部機能を測定

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

生体内で運動ニューロンの変性症のマウスモデルの前肢からの複合筋活動電位の電気生理学的測定

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the transmission of molecules from the nervous system to voluntary muscles, leading to contraction. They are affected in many human diseases, including inherited neuromuscular disorders such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), congenital myasthenic syndromes (CMS), spinal muscular atrophy (SMA), and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Therefore, monitoring the morphology of neuromuscular junctions and their alterations in disease mouse models represents a valuable tool for pathological studies and preclinical assessment of therapeutic approaches. Here, methods for labeling and analyzing the three-dimensional (3D) morphology of the pre- and postsynaptic parts of motor endplates from murine teased muscle fibers are described. The procedures to prepare samples and measure NMJ volume, area, tortuosity and axon terminal morphology/occupancy by confocal imaging, and the distance between postsynaptic junctional folds and acetylcholine receptor (AChR) stripe width by super-resolution stimulated emission depletion (STED) microscopy are detailed. Alterations in these NMJ parameters are illustrated in mutant mice affected by SMA and CMS.

This protocol describes a method for morphometric analysis of neuromuscular junctions by combined confocal and STED microscopy that is used to quantify pathological changes in mouse models of SMA and ColQ-related CMS.

共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡の組み合わせによるマウスの神経筋接合部のキャラクタリゼーション

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

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