This work was supported by a California State University Program for Education and Research in Biotechnology (CSUPERB) New Investigator Grant (KAW), a grant from Pfizer (WS753098, SH), and an NIH MARC fellowship (#2T34GM008253-21, JAF). The authors would like to thank Michael Sawchuk, Anusha Allawala, Nina Bubalo, Remie Mandawe and Peter Nguyen for their technical support.

適切な国内および機関の倫理、動物実験を行う前に取得する必要があります。 EDL筋肉と神経の1の除去<ol><li>計量し、深く、5％イソフルランプラス1.5リットル/分の酸素流量や底面のイソフルオラン浸した綿でベルジャで気化器を使用して吸入イソフルオランで成体マウスを麻酔。 </li><li>マウスが深く麻酔をかけているとつま先のピンチに応答しないことを確認してください。すぐに大規模な、鋭利にハサミやギロチンを使用して首を切る。 </li><li>はさみを使用して、リブを介して腹側正中カットを作成し、内臓を取り除く。 </li><li>首のエリアから肌をつかみ、足を過ぎて、それを引っ張って動物スキン。 </li><li>腰の上に切断することによって脚を除去し、冷却した（4℃）で皿に肌の足を置く、carbogenated（95％O 2、5％CO 2）、低カルシウム、高マグネシウム、重炭酸緩衝生理食塩水contaimM単位寧：128のNaCl、1.9のKCl、1.2 KH 2 PO 4、26 NaHCO 3を、0.85のCaCl 2、6.5のMgSO 4、および10グルコース（7.4±0.05のpH）16。低カルシウムは、高マグネシウム溶液は、解剖時にシナプス伝達を阻害する。 </li><li>皿に脚の背側を上に置き、足をピンと膝と足首の関節が90°の角度になるように注射針や虫ピンを使ってヒップ。足の両端にピンを配置し、前部と後部のそれぞれに1ピンが所定の位置に組織を保持するために太もも。 </li><li>カストロ春のはさみを使用して、太ももに筋肉の最上層を持ち上げ、真下坐骨神経を露出させるために正中カットをする。坐骨神経はちょうどトップ筋層の下に位置しており、ちょうど膝関節の前に総腓骨と脛骨神経に分岐するまでの腰近くの出口から大腿骨の上に実行されます。 </li><li>経口まで坐骨神経上記の筋肉を削除するint型は、時趾屈長母（FHL）筋への深い腓骨神経枝ダイブが見える。 </li><li> ＃55鉗子を使用して、脛骨の内側にある腓腹筋とヒラメ筋、からそれを解放するために腓骨枝の周囲の結合組織を解剖。腓腹筋とヒラメ筋の腱を切って、慎重に神経の下から削除します。 </li><li>横する関節から内側足首に三つの異なる腱バンドルを露出させ、脛骨の側面に表面的な筋肉を削除します。FHL、EDL、および前脛骨（TA）、TAの下に隠されたEDLに。 </li><li>持ち上げてEDLからのTAを持ち上げ、足関節でのTA腱をカットし、それを除去するための膝の近くの筋肉を切った。 </li><li>足首でFHL腱を切り、神経がFHLに入る領域に到達するためにそれを戻って持ち上げます。ちょうどその点未満にカットし、FHL筋の〜2/3を削除します。 </li><li> POSなどの股関節に近い坐骨神経をカットsible、優しく深い腓骨ブランチを除くすべての神経枝を剥ぎ取る。 </li><li>大春のはさみを使用して、両方の足首と膝関節でのEDLの腱をカット。 </li><li>鋭いハサミを使用して、膝に脛骨骨を切断することにより、周囲の組織からEDL、残りのFHLと神経を除去し、太ももの途中。ただEDL、FHLの一部と神経が残るように、残りの脛骨を離れてカットします。 </li></ol>組織浴にEDL筋肉と神経の2。取り付け（図1A） <ol><li>実験開始前に、組織風呂を準備します。常に一緒にお風呂を灌流酸素化（100％O 2）の合成の間質液（SIF）123のNaCl、3.5塩化カリウム（単位：mm）を含む、0.7 硫酸マグネシウム、1.7のNaH 2 PO 4、2.0のCaCl 2、9.5 NAC 6 H 11 O（グルコン酸ナトリウム）、5.5グルコース、7.5スクロース、および10 N-2-hydroxyethylpiperazine- N &#39;-2·エhanesulfonic酸（HEPES）; pHが7.4±0.05 17。 15〜30ミリリットル/分の流量を推奨します。力と長コントローラ（概算風呂寸法8.5センチメートル×3センチ×1センチメートルための槽の底、マウントされた組織ポストとマウントに固定された2つの刺激電極との25ミリリットルの容量の市販の入浴も示されている。仕様）材料/機器の表を参照してください。 </li><li>孤立筋肉神経を処理し、組織浴にそれを配置するために、残りのFHL組織を使用してください。皿の底にSYLGARDの小片を置き、筋肉を安定させるために、残りのFHL組織を通して虫ピンを使用します。 </li><li> （仕様のための材料/機器の表を参照のこと）力と長制御部のレバーアームの両方に腱を結ぶ組織ポストに一端を固定し、他のために6-0絹縫合糸を使用してください。実用的で最小の縫合糸の長さを使用してください。あなたは腱を縛られた後虫ピンとSYLGARDを削除します。注：簡単に促進するために、レバーへの接続は、ワイヤの小片は、エポキシでレバーアームに「J」字形フックに曲げて固定することができるアーム。縫合糸は、ワイヤに接続された代わりに、レバーアームの小さな穴に通すことができる。 </li><li>第一のガラスマイクロピペットプラー（ヒート= 286、プル= 0、速度= 150、時間= 200）を使用して、SA 16ガラス吸引電極を作る; 3ミリメートルテーパー程度があるまで研ぎ石でそれを挽くバックし、手動で先端を破る。 （製品の詳細は、電極回路図について図1B-1C参照マテリアル/機器の表）1からサ ​​ンプルを希望する神経の面積に応じて以下10から100の間の所望の先端内径にマイクロフォージを使用して先端部を溶融。 </li><li> SIF内側銀線にあらかじめ作られたガラス吸引電極を埋める。 </li><li>電極中に神経の切断端を吸引し、差動増幅器の正のポートに接続します。塩素化銀電極を包みヘッドステージの負のポートに接続するワイヤ。グラウンドヘッドステージの接地ポートにバスからの第塩素化銀線を実行することにより、SIF風呂。また、灌流ポンプを介して導入された電気的ノイズを軽減するために、複数の点でのファラデーケージに灌流チューブを接地してください。 </li><li>単収縮を誘発する組織浴中の筋肉のいずれかの側に取り付けられた電極を介して筋肉を刺激する。あるいは、神経の切断端に刺激電極を配置します。ピーク収縮力が観察されるまで刺激電圧を増加させ、その後、最大上電圧（0.5ミリ秒パルス幅）に到達するために追加の15％の電圧を増加させる。中間の10秒の残りの部分と、最大上電圧で筋収縮を続けますが、ピーク収縮力が筋肉の最適な長さ（L o を ）見つけることが達成されるまで、筋肉の長さを変える。すべての長さのスロープや振動はこのLENGで筋肉始まります目。 </li><li>筋神経調製物は組織浴温度に到達するために、正常なシナプス伝達のための低カルシウム溶液中で解離下記回復できるように、その後のデータ収集の前に少なくとも1時間、浴中に留まることを可能にする。 </li><li>室温以外の温度でデータを収集するには、筋肉に近い組織浴に温度プローブを配置します。ゆっくり組織浴ベースプレートを介して加熱された水をポンプで温度に風呂を上に持って来る。定常温度を維持するのを助けるために、SIF貯水池の周りに粘土電子レンジ加熱用のパッドを包みます。 </li></ol> 3。データ収集<ol><li>スピンドル求心としての求心性を識別するために、秒ごと配信0.5ミリ最大上電圧刺激により生成繰り返さ筋収縮時の神経活動を記録します。注：筋紡錘求心性は、攣縮18,19（ 図2）中に一時停止する必要があります。 </li><li>ダを使用してくださいtaの取得ソフトウェアは、異なる速度で異なる長さに、長さ変更を適用します。 （与えられたストレッチをカスタマイズする方法上のスクリプトや方向のスクリーンショットのための補足情報を参照）、この作業を自動化するカスタムスクリプトを使用してください。 2.5％、5％、7.5％L o のストレッチの長さおよび/ ​​秒15 20、40、または60％のL o の延伸速度で4秒のランプ·アンド·ホールド·ストレッチを適用する。注：必要な電圧 - ミリメートル換算係数の具体的な力と長コントローラのマニュアルを参照してください。 </li><li>実験の最後に、最大の等尺性強縮性収縮（500ミリ列車、120 Hzの列車の周​​波数、0.5ミリ秒パルス幅、最大上電圧）を用いて24℃で筋肉の状態を判断する。以前に報告された値にピーク収縮力の比較（〜24 N / cm 2の9,20）。 </li></ol>

<ol>
	<li>Matthews, P. B. C., Brookes, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Section+1,+The+Nervous+System,+Motor+Control.">Section 1, The Nervous System, Motor Control.</a> Handbook of Physiology. , 189-228 (1981).</li><li>Houk, J., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+Golgi+tendon+organs+to+forces+applied+to+muscle+tendon.">Responses of Golgi tendon organs to forces applied to muscle tendon.</a> J Neurophysiol. 30, 1466-1481 (1967).</li><li>Jankowski, M. P., Rau, K. K., Ekmann, K. M., Anderson, C. E., Koerber, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotyping+of+group+III+and+IV+muscle+afferents+in+mouse.">Comprehensive phenotyping of group III and IV muscle afferents in mouse.</a> J Neurophysiol. 109, 2374-2381 (2013).</li><li>Nichols, T. R., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-bridge+mechanisms+underlying+the+history-dependent+properties+of+muscle+spindles+and+stretch+reflexes.">Cross-bridge mechanisms underlying the history-dependent properties of muscle spindles and stretch reflexes.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82, 569-576 (2004).</li><li>Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociception+from+skeletal+muscle+in+relation+to+clinical+muscle+pain.">Nociception from skeletal muscle in relation to clinical muscle pain.</a> Pain. 54, 241-289 (1993).</li><li>Proske, U., Gandevia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proprioceptive+Senses:+Their+Roles+in+Signaling+Body+Shape,+Body+Position+and+Movement,+and+Muscle+Force.">The Proprioceptive Senses: Their Roles in Signaling Body Shape, Body Position and Movement, and Muscle Force.</a> Physiol Rev. 92, 1651-1697 (2012).</li><li>Close, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force:+velocity+properties+of+mouse+muscles.">Force: velocity properties of mouse muscles.</a> Nature. 206, 718-719 (1965).</li><li>McCully, K. K., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injury+to+skeletal+muscle+fibers+of+mice+following+lengthening+contractions.">Injury to skeletal muscle fibers of mice following lengthening contractions.</a> J Appl Physiol. 59, 119-126 (1985).</li><li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young,+adult+and+aged+mice.">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J Physiol. 404, 71-82 (1988).</li><li>Barclay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+diffusive+O(2)+supply+to+isolated+preparations+of+mammalian+skeletal+and+cardiac+muscle.">Modelling diffusive O(2) supply to isolated preparations of mammalian skeletal and cardiac muscle.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 26 (2), 225-235 (2005).</li><li>Taguchi, T., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscular+thin-fiber+receptors+in+aged+rats+recorded+in+vitro.">Augmented mechanical response of muscular thin-fiber receptors in aged rats recorded in vitro.</a> European Journal of Pain. 15, 351-358 (2011).</li><li>Simon, A., Shenton, F., Hunter, I., Banks, R. W., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride-sensitive+channels+are+a+major+contributor+to+mechanotransduction+in+mammalian+muscle+spindles.">Amiloride-sensitive channels are a major contributor to mechanotransduction in mammalian muscle spindles.</a> J Physiol. 588, 171-185 (2010).</li><li>Wenk, H. N., McCleskey, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mouse+skeletal+muscle-nerve+preparation+and+in+vitro+model+of+ischemia.">A novel mouse skeletal muscle-nerve preparation and in vitro model of ischemia.</a> J Neurosci Methods. 159, 244-251 (2007).</li><li>Bullinger, K. L., Nardelli, P., Wang, Q., Rich, M. M., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxaliplatin+neurotoxicity+of+sensory+transduction+in+rat+proprioceptors.">Oxaliplatin neurotoxicity of sensory transduction in rat proprioceptors.</a> J Neurophysiol. 106, 704-709 (2011).</li><li>Wilkinson, K. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+muscle+spindle+afferents+in+the+adult+mouse+using+an+in+vitro+muscle-nerve+preparation.">Characterization of muscle spindle afferents in the adult mouse using an in vitro muscle-nerve preparation.</a> PLoS One. 7, e39140 (2012).</li><li>Shreckengost, J., Calvo, J., Quevedo, J., Hochman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicuculline-sensitive+primary+afferent+depolarization+remains+after+greatly+restricting+synaptic+transmission+in+the+mammalian+spinal+cord.">Bicuculline-sensitive primary afferent depolarization remains after greatly restricting synaptic transmission in the mammalian spinal cord.</a> J Neurosci. 30, 5283-5288 (2010).</li><li>Koltzenburg, M., Stucky, C. L., Lewin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptive+properties+of+mouse+sensory+neurons+innervating+hairy+skin.">Receptive properties of mouse sensory neurons innervating hairy skin.</a> J Neurophysiol. 78, 1841-1850 (1997).</li><li>Matthews, B. H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+muscle.">Nerve endings in mammalian muscle.</a> J Physiol. 78, 1-53 (1933).</li><li>Hunt, C. C., Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+receptor+discharges+during+muscle+contraction.">Stretch receptor discharges during muscle contraction.</a> J Physiol. 113, 298-315 (1951).</li><li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myo-mechanical+analysis+of+isolated+skeletal+muscle.">Myo-mechanical analysis of isolated skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Hoheisel, U., Rein&#246;hl, J., Unger, T., Mense, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+pH+and+capsaicin+activate+mechanosensitive+group+IV+muscle+receptors+in+the+rat.">Acidic pH and capsaicin activate mechanosensitive group IV muscle receptors in the rat.</a> Pain. 110, 149-157 (2004).</li><li>Taguchi, T., Sato, J., Mizumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmented+mechanical+response+of+muscle+thin-fiber+sensory+receptors+recorded+from+rat+muscle-nerve+preparations+in+vitro+after+eccentric+contraction.">Augmented mechanical response of muscle thin-fiber sensory receptors recorded from rat muscle-nerve preparations in vitro after eccentric contraction.</a> J Neurophysiol. 94, 2822-2831 (2005).</li><li>Xu, J., Gu, H., Brennan, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensitivity+of+group+III+and+group+IV+afferents+from+incised+muscle+in+vitro.">Increased sensitivity of group III and group IV afferents from incised muscle in vitro.</a> Pain. 151, 744-755 (2010).</li></ol>

The open access charges for this manuscript have been paid by Aurora Scientific, Inc., the company that makes the force and length controller and in vitro bath plate used in this manuscript.

この記事の目的は、単離したマウスの筋肉の神経に備えて筋紡錘求心性神経から記録するための方法を説明することでした。私たちは、マウスのスピンドル求心性神経は、ラット、ネコとヒト15からのもののように伸ばすことも同様に応答することを見出し、他の研究室は、in vitroで 、筋肉と皮膚の両方で感覚ニューロンを研究するためのモデル生物としてマウスを使用していた（例えば、3,13用） 。 筋肉感覚求心性は、24℃と34℃の両方で少なくとも6-8時間記録することができる。 EDLや神経を扱う最小限に抑えるために、可能な限り、組織を処理するためにFHLの残りの部分を使用しています。解剖後、組織浴温度にし、回復するための正常なシナプス伝達のために平衡化させるためにデータ収集を開始するために、少なくとも1時間待つ。以前は、筋肉の健康は最大の強縮コントラことを決定することによって、この調製に用いられる筋肉のサブセット上で検証した筋肉によって生成されたctile力は、実験15の最初と最後に他者によって報告されたものと同様である。 筋紡錘の求心性は、（ 図3）（図2）収縮をけいれんに応じて、焼成中に特徴的なポーズを探しているだけでなく、長さの変化に応じて、予想される瞬間的な周波数が増加することによって、この準備として、機能的に同定された。われわれの経験では、制御条件に火災最も求心性は、筋紡錘求心性はある。この調製物（約7ミリメートル最大）に保持神経の長さは、筋求心性亜型13を識別するために求心性伝導速度の違いを利用するのに十分な長さではない。また、猫と人間とは異なり、動的な感度の指標は明らかにマウスではIa族およびII求心性を区別することができませんでした（さらなる議論のためにウィルキンソンらを参照してください。15）。求心性神経の他のサブタイプ（ すなわち、グループIIIおよびIV） など 、カプサイシン、ATP、またはブラジキニンのような物質を添加浴pHの低下、虚血筋肉を露出することによって、例えば、この製剤中の追加の機能テストを用いて同定することができる3,13,21-23吸引電極を使用すると、単一の筋から採取することができるデータ量を増加させる、複数の感覚ニューロンからの活動を一度に記録することができる。この調製物は、感覚ニューロン群の応答または識別された求心性神経の応答に対する摂動の全体的な効果を評価するために使用することができる。スパイク形状が十分に一意である場合、最大4感覚ニューロンは（Spike2（ケンブリッジ電子設計）とLabChartのプロ（のAD·インスツルメンツ）の両方が同様に行われている）ソフトウェアによって判別することができる。ニューロンが判別できない場合において、電極配置や先端径の変化を容易に実現することができる。 体外 prepar における要約すると、マウスの筋肉神経ationは、さまざまな物理化学的摂動、傷害および疾病モデルに筋肉感覚求心性神経の応答特性を調べるために使用することができる簡単な実験的アプローチである。さらに、この製剤は、理想的にトランスジェニック動物および光遺伝学的ツールを含むマウスで利用できる強力な遺伝子ツール、を活用するために適しています。

骨格筋は、筋肉環境に関する重要な情報を中枢神経系を提供する感覚ニューロンにより神経支配されています。筋紡錘は、高度extrafusal筋線維と平行に配置されている錘内筋線維から構成されるカプセル化された構造を特化されます。スピンドルは、Ia族によって支配され、筋肉の長さと錘内繊維のトーンの変化をエンコードII求心性神経支配が動的ガンマ運動ニューロン1によって調節される。 Ib族求心性神経は、筋収縮の2中に筋線維とその腱の挿入の間に配置され、筋力の変化に敏感である、例えばれている。 Ia族、IbおよびIIの求心性は、適切なモータ制御に役立つ固有受容フィードバックを提供する。筋肉全体に配置筋求心性神経の追加の集団（群IIIおよびIV）代謝産物の蓄積、侵害刺激の存在、および筋肉の温度を通知するために役立つ<sup&gt; 3。この筋肉感覚情報は、恒常性を維持する筋肉損傷を防止し、動きを調節するために重要である。筋肉求心性は、以前の経験4に基づいて発火パターンを変更することができます。侵害受容器の活性化は、バランスや動き6で問題につながる可能性の筋自己受容器からの慢性疼痛状態5と異常なシグナル伝達の誘導につながることができます。私たちは、（図示2-4月齢のC57BL / 6マウスからの応答である）両方の性別の成体マウスから筋肉感覚神経受容体終末の応答を研究するために体外に備えて孤立筋肉神経を使う。マウスは、哺乳類での研究のためのモデルの遺伝種である。この準備は、坐骨神経の深い腓骨枝と長指伸筋（EDL）筋、下腿の外側部で見つかった腓骨グループの速筋の筋肉の単離を必要とする。 EDLは、多くの場合、筋肉の収縮特性7-9を研究するために使用され、TEを持ってい隔離し、安静時および合理的な収縮のデューティ·サイクル10で十分な拡散性の酸素供給を可能にするのに十分に小さいが容易であるndons。 （インスタンスヒラメと前脛骨用）このエリアの他の筋肉が同様の大きさのものであり、この準備は簡単にこれらの筋肉からの求心性神経から記録するように修正することができる。吸引電極は、筋肉感覚求心性発火を記録するために、神経の切断端上に配置される。個別のニューロンを識別し、スパイクソーティングソフトウェアを使用してスパイク形状に基づいて分析することができる。浴中または神経に刺激電極は、筋収縮を誘発するために使用することができる。筋肉の長さおよび力が制御され、市販のシステムを用いて測定することができる。同様のin vitro調製物は、ラットのEDL 11、Ia族およびラットの第四虫様つま先筋12とtにおけるグループIIIおよびIV筋求心性神経のII紡錘求心性神経でのグループIIIおよびIV筋求心性神経を研究するためにげっ歯類で使用されてきた彼のマウス足底筋13。 in vitroの系では、薬理学的ア ​​クセシビリティと温度およびpHなどの灌流液および生理化学的変数を直接制御の利点を有している。 in vitroでのアプローチは、麻酔や筋肉灌流状態の潜在的なin vivoでの交絡を排除します。筋肉神経準備が求心上の摂動の直接的な反応の研究を可能にするが、in vivoで14またはex 3の製剤のように犠牲にされている生体内で可能な主軸感度および他の集積反応のガンマ遠心性変調を研究する能力この準備には神経細胞体は存在しない。 この調製は、以前のランプの電池に対するマウス筋紡錘求心性神経の応答を特徴付けストレッチや振動を保持するために使用し、これをマウススピンドル求心性RESPONSことが決定されたエスは、ラット、ネコ、及びヒトのような他の種で報告されたものと同様であった。マウススピンドル求心性応答は、34℃、絶対発火率で速かったものの、24℃と34℃の浴温の両方で類似していることが判明し、求心性は、15を変えるより速く長さに対応することがよりできたました。私たちは、この準備が筋紡錘求心性神経を特定し、研究するために使用する方法を下に説明します。さらに、この調製物は、容易に薬物または疾患状態または各種他の変数（ 例えば 、年齢、性別、遺伝子ノックアウト）に応答して、感覚求心性神経の特性を比較するために、他の筋肉の求心性亜型13の応答を研究するために修飾することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Force and Length Controller &#38; Tissue Bath</td>
			<td>Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>300C-LR &#38; 809B-IV&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S Digital Drive Perfusion Pump &#38; Easy Load II Pump Head</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-07523-80 &#38; EW-77200-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Channel Microelectrode AC Differential Amplifier &#38; Headstage Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 1800; 700000 &#38; 700500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Simulator</td>
			<td>Grass 
			OR 
			Aurora Scientific, Inc.</td>
			<td>S88 
			OR 
			701 C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>892070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Light Source</td>
			<td>Fiberlite</td>
			<td>Model 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog to Digital Board</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>PL3508/P (PowerLab 8/35)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Acquisition &#38; Analysis Software</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>LabChart Pro 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Holder</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>672445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Glass</td>
			<td>Dagan</td>
			<td>SA16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-80/PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflourane</td>
			<td>MWI Veterinary Supply</td>
			<td>18627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Surgical Tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Dissecting Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14014-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14059-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals for Low Calcium- High Magnesium aCSF and SIF 
			(Low Calcium solution is equilibriated with 95% 02/5% C02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05; SIF is equilibriated with 100% 02 gas and pH of 7.4 &#177; 0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>230391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2054-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8282-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents

筋肉感覚ニューロンは筋紡錘やゴルジ腱器官は固有感覚に不可欠な長さと力の変化をエンコード支配。追加の求心性線維は、代謝産物の蓄積、温度、および侵害刺激を含む筋肉の環境の他の特性を、監視する。全体的に、感覚ニューロンの異常な活性化は、運動障害または慢性疼痛症候群につながることができます。私たちは、成体マウスでのストレッチ誘発求心性応答のin vitro研究のため長指伸筋（EDL）筋肉と神経の単離を記載している。感覚活動は吸引電極で神経から記録され、個別の求心性は、スパイクソーティングソフトウェアを用いて解析することができる。 インビトロ製剤は、麻酔の潜在的な交絡または変更された筋肉の灌流のない感覚求心性神経上の十分に制御された研究を可能にします。ここでは、識別してストレッチする筋紡錘求心性神経の応答を試験するためのプロトコルを記述します。重要なことは、この製剤はまた、薬物のアプリケーションおよびマウスでの強力な遺伝的アプローチと疾患モデルの取り込み後の筋求心性神経、応答特性の他のサブタイプの研究をサポートしています。

筋求心性神経の応答が研究されている求心性サブタイプに応じて、摂動の多様以下を記録することができる。筋収縮とランプやストレッチを保持するために筋紡錘求心性神経の代表的な応答がここに示されています。スピンドル求心としての求心性を識別するために、単収縮収縮は収縮18,19の間に発射の一時停止があるかどうかを確認するために一度毎秒（0.5ミリ秒パルス幅）が与えられる。 図2に、中に代表的神経活動のトレースと筋肉の緊張を示していますこれらの筋収縮。スピンドル求心性のために予想されるように無神経活動は、筋収縮時に観察されない。記録された求心性はIb族ゴルジ腱器官の求心性だった場合、収縮中に発火率の増加が予想されるであろう。 34℃での規則的な発火パターン（24℃、〜12インパルス/秒〜32インパルス/秒を備えた制御条件の下で、ほとんどの求心）筋紡錘求心です。スピンドル求心性のサブセットは、ストレッチ中のみの火災（スピンドル求心性神経の私たちの手の中に〜11％）15。 図3Aは、ランプへの対応2筋紡錘求心性神経の代表生の痕跡を示しており、力と長コントローラによって生成されるストレッチを開催します。 LabChartののスパイクヒストグラム機能は個別に（ 図3B-3C）二つの個別のニューロンの瞬時発火頻度を特定し、分析するために使用される。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" width="500" /> 図1の単離された筋肉の調製A）長指伸筋（EDL）および神経支配坐骨神経を含酸素合成の間質液（SIF）で灌流単離された組織浴中に取り付けられている。 suctiに接続され、細胞外アンプ電極上に神経活動を記録します。適切なソフトウェア·コントロールと対策筋力と長コントローラを備えたデュアル力と長さ。組織浴電極は、けいれんや強直収縮を生成するために刺激を提供します。 。Cは、マイクロフォージを使用して生成された吸引電極のための理想的な先端形状の描写に拡大））のB。内槽プレートチャネルを通じて加熱された水を〜3ミリメートルで先細り先端をガラス吸引電極を引っ張った組織浴温度を制御するポンプ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51948/51948fig1highres.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig2highres.jpg" width="500" /> 収縮を痙攣させる図2スピンドル求心性応答。神経たアクティビティY（上のトレース）および30筋の収縮からの筋肉の緊張（下のトレース）は、黒のトップ重なり合うトレースが重畳されている。求心性活動は、筋紡錘求心性神経の応答特性である収縮誘発性の張力増加、中に一時停止します。上のトレース上のブラケットと矢印は活動を一時停止している収縮の間の時間を示している。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51948/51948fig3highres.jpg" width="600" /> 図3スピンドル求心性応答は、ランプやストレッチAホールド）2求心性（上のトレース）の生の神経活動をランプ中およびEDL（下のトレースに示す筋長）。B）瞬時発火頻度（INSTに適用されるストレッチを保持する 。 A（青色で表示）からoを Lの活性を示す単位の神父、毎秒インパルス）。C）Instantane唯一の火災ストレッチ中に（オレンジ色で表示）より小さな単位のOUは発火頻度。両ユニットは、筋紡錘求心1の特徴であるストレッチ中にスパイク頻度順応を示す。

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents at JoVE.com

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。

アン<em&gt;体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための&gt;成体マウス筋肉神経の準備

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

an-vitro-adult-mouse-muscle-nerve-preparation-for-studying-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

16.8K ビュー.  San José State University. 筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。 

ビデオ: An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

アダルト生まれのニューロンの統合を検討し

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

神経科学

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

アン<em&gt; in vitroで</em生理的動きと送りモータプログラムを引き出すと録音用&gt;準備<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls gastrointestinal motility. A procedure for the isolation and culture of a mixed population of neurons and glia from the myenteric plexus is described. The primary cultures can be maintained for over 7 days, with connections developing among the neurons and glia. The longitudinal muscle strip with the attached myenteric plexus is stripped from the underlying circular muscle of the mouse ileum or colon and subjected to enzymatic digestion. In sterile conditions, the isolated neuronal and glia population are preserved within the pellet following centrifugation and plated on coverslips. Within 24-48 hr, neurite outgrowth occurs and neurons can be identified by pan-neuronal markers. After two days in culture, isolated neurons fire action potentials as observed by patch clamp studies. Furthermore, enteric glia can also be identified by GFAP staining. A network of neurons and glia in close apposition forms within 5 - 7 days. Enteric neurons can be individually and directly studied using methods such as immunohistochemistry, electrophysiology, calcium imaging, and single-cell PCR. Furthermore, this procedure can be performed in genetically modified animals. This methodology is simple to perform and inexpensive. Overall, this protocol exposes the components of the enteric nervous system in an easily manipulated manner so that we may better discover the functionality of the ENS in normal and disease states.

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

We demonstrate a cell culture protocol for the direct study of neuronal and glial components of the enteric nervous system. A neuron/glia mixed culture on coverslips is prepared from the myenteric plexus of adult mouse providing the ability to examine individual neuron and glia function by electrophysiology, immunohistochemical, etc.

不定冠詞<em&gt;インビトロ</em成体マウスの筋層間神経叢から分離腸ニューロンとグリアの&gt;準備

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in these preparations is perpendicular to the retinal surface, making it ideal for the study of radially oriented neurons like photoreceptors and bipolar cells. However, the large dendritic arbors of horizontal cells, wide-field amacrine cells, and ganglion cells are mostly truncated, leaving markedly reduced synaptic activity in these cells. Whereas ganglion cells and displaced amacrine cells can be studied in a whole-mounted preparation of the retina, horizontal cells and amacrine cells located in the inner nuclear layer are only poorly accessible for electrodes in whole retina tissue.
To achieve maximum accessibility and synaptic integrity, we developed a horizontal slice preparation of the mouse retina, and studied signal transmission at the synapse between photoreceptors and horizontal cells. Horizontal sectioning allows&#160;(1) easy and unambiguous visual identification of horizontal cell bodies for electrode targeting, and (2) preservation of the extended horizontal cell dendritic fields, as a prerequisite for intact and functional cone synaptic input to horizontal cell dendrites.
Horizontal cells from horizontal slices exhibited tonic synaptic activity in the dark, and they responded to brief flashes of light with a reduction of inward current and diminished synaptic activity. Immunocytochemical evidence indicates that almost all cones within the dendritic field of a horizontal cell establish synapses with its peripheral dendrites. The horizontal slice preparation is therefore well suited to study the physiological properties of horizontally extended retinal neurons as well as sensory signal transmission and integration across selected synapses.

We developed a horizontal slice preparation of the adult mammalian retina with the plane of sectioning parallel to the retinal surface. Dendritic fields of nonradially oriented retinal neurons were not truncated, allowing the study of signal processing with patch-clamp and imaging techniques.

電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory bowel diseases and diabetes. Here, we describe a protocol for the in vitro characterization of the electrophysiological properties of colonic afferents in rats. The colorectum, with the intact pelvic ganglion (PG) attached, is removed from the rat; superfused with carbogenated Krebs solution in the recording chamber; and cannulated at the oral and anal ends to allow for distension. A fine nerve bundle emanating from the PG is identified, and the multiunit afferent nerve activity is recorded using a suction electrode. Distension of the colonic segment elicits gradual increases in multiunit discharge. A principal component analysis is conducted to differentiate the low-threshold, the high-threshold, and the wide-dynamic range afferent fibers. Chemical sensitivity of colonic afferents can be studied through the bath or intraluminal administration of test compounds. This protocol can be modified for application to other species, such as mice and guinea pigs, and to study the differences in the electrophysiological properties of thoracolumbar/hypogastric and lumbosacral/pelvic afferents of the descending colon in normal and pathological conditions.

In Vitro Characterization of the Electrophysiological Properties of Colonic Afferent Fibers in Rats

Abnormal sensory function underlies visceral pain and other symptoms of functional and inflammatory bowel diseases. A protocol for the electrophysiological recording of the colonic afferent nerves in an ex vivo rat colorectum preparation is presented here.

体外ラットの結腸求心性線維の電気生理学的特性の評価

Dysfunction of the colonic sensory nerves has been implicated in the pathophysiology of several common conditions, including functional and inflammatory ...

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other proteins associated with neurodegenerative diseases, the reported in vitro aggregation kinetics for tau protein are less consistent presenting a relatively high variability. Here we describe the development of an in vitro aggregation assay that mimics the expected steps associated with tau misfolding and aggregation in vivo. The assay uses the longest tau isoform (huTau441) which contains both N-terminal acidic inserts as well as four microtubule binding domains (MBD). The in vitro aggregation is triggered by addition of heparin and followed continuously by thioflavin T fluorescence in a 96 well microplate format. The tau aggregation assay is highly reproducible between different wells, experimental runs and batches of the protein. The aggregation leads to tau PHF-like morphology which is very efficient in seeding the formation of de novo fibrillar structures. In addition to its application in studying the mechanism of tau misfolding and aggregation, the current assay is a robust tool for screening drugs that could interfere with the pathogenesis of tau.

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

The tau aggregation assay described in this manuscript mimics the anticipated features of in vivo tau misfolding and aggregation.

体外タウ蛋白と創薬スクリーニングの集計を勉強するための試金

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

リズミカルにアクティブな準備体外新生児齧歯動物脳幹-脊髄損傷で薄くスライス

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...