このプロトコルは、(AY、HSG し)、免疫学者のアメリカの協会から免疫学フェローシップのキャリアおよび学者賞 (HSG) にボードの知事再生医学研究所からヒマラヤスギ シナイ医療センターで資金を使用して開発されました。(AY) に血液学のアメリカの社会。FACS の並べ替えと支援ありがとうヒマラヤスギ シナイ医療センターで流れ Cytometry コア。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ヒマラヤスギ シナイの医療センターによって承認されました。
1. 分離マウス骨髄と単一細胞懸濁液の調製
<ol><li>制度のガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。</li>
	<li>その裏に euthanized マウスを置き、70% エタノール (エタノール) をスプレーします。鋭い、先の尖ったはさみ、足から取り外して、筋肉や骨を公開の体に向かって皮膚を引き上げて使用して足首レベルで各後肢での (3 ~ 5 mm) の小切開を行います。</li>
	<li>はさみ、次の骨の方向でそれらをトリミングすることによって、骨から筋肉 (大腿四頭筋、膝腱など) を削除します。骨を傷つけないように注意します。</li>
	<li>股関節から大腿骨を脱臼し、結合組織と骨を切らないように注意しながら、足を切断する筋肉を切り取る。</li>
	<li>脛骨から足首を脱臼して足を削除、管内滅菌 PBS またはメディアの骨を配置、組織培養室に氷の上にそれらを輸送します。 注: いくつかの他のアプリケーション (例えば、全骨髄細胞からマクロファージの派生) それはしばらくの間、氷の上の骨を残すが、前駆細胞の分離のためのダウンレギュレーションを避けるためにできるだけ早く進めることが重要です。重要な表面マーカー (特に CD115)。</li>
	<li>バイオ セーフティ キャビネット、ティッシュ ペーパーでこすって骨から任意の残りの軟部組織を削除します。 注: プロトコルは滅菌サンプルがセルの文化や生体内での試金 FACS を並べ替えた後のため必要な場合、バイオ セーフティ キャビネットで実行必要があります。無菌細胞が必要ない場合は、研究室のベンチに全体のプロセスを実行できます。</li>
	<li>簡単に 70% の骨を浸し、それら、それらを洗浄する滅菌 PBS での消毒にエタノール。</li>
	<li>膝を通って切断によって両脚の腓骨と脛骨、大腿骨を分離し、両脚の腓骨を破棄します。</li>
	<li>鋭いハサミで骨の両端をカットします。</li>
	<li>骨が白く表示されてまで冷滅菌 PBS で骨髄をとおり収穫します。<ol>
<li>各骨鉗子、グリップ、1 つの端の骨軸に冷滅菌 PBS を含む 10 mL の注射器に接続されている 26 G 針を挿入します。</li>
		<li>50 mL の遠心管の上の骨を押し、骨、骨髄を収穫する 2-5 mL PBS をフラッシュします。</li>
		<li>マウス (2 大腿骨と脛骨 2) あたりのすべての 4 の骨から骨髄を収穫します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞懸濁液を形成する骨髄の分解および 1 mL ピペットでピペットの上下に優しく。</li>
	<li>骨の部分を排除し、セルの集計、単一細胞懸濁液を生成するために 30 μ m ナイロン メッシュの部分を介して骨髄懸濁液をフィルター処理します。</li>
	<li>5 分の滅菌染色バッファー (PBS 0.5 %fbs + 2 ミリメートルの EDTA)、細胞ペレットを再懸濁します 280 x g で単一細胞懸濁液を遠心分離機では、染色バッファー マウス (例えば、セルから大腿骨および脛骨 2 マウスのプールの 10 mL) あたり 5 mL を使用しています。</li>
	<li>10 μ L のサンプルの分注を取る、10 μ L を混ぜてトリパン ブルーと診断に結果トリパン ブルー ラベル サンプルのロード 10 μ L。光学顕微鏡を使用してセルをカウントします。 注: セルに信頼性の高いカウントのためあまりにも集中している場合は、トリパン ブルーを追加する前にサンプルを希釈します。</li>
</ol>2. 前駆濃縮磁気活性化細胞 (MAC) の並べ替えで
<ol><li>全体の単一細胞懸濁液を遠心分離 (または同数のセルとして、目的の収率を取得する必要) 40 細胞ペレットを再懸濁します、4 ° C で 5 分間 280 x g で μ 10 の7セルごとのバッファー (PBS + 0.5 %fbs + 2 ミリメートルの EDTA) を染色します。 注: それはまた血統の枯渇のキット メーカーから MAC バッファーを使用することが可能 (材料表参照) 染色バッファーの代わりに。</li>
	<li>血統の枯渇のキットに付属している指示に従って血統の枯渇を実行します。次の手順は、テーブルの材料で見られるキットです。別のキットを使用する場合、製造元の指示に従って、2.3 の手順に進みます。<ol>
<li>107細胞あたり 10 μ L ビオチン抗体カクテルを追加、ピペッティングで混ぜるし、4 ° C で 10 分間インキュベート</li>
		<li>30 μ L を追加染色バッファー/マック 10 の7セルごとのバッファーし、ミックスします。</li>
		<li>10 の7セルあたり 20 μ L 抗ビオチン マイクロ ビーズを追加します。よく混合し、4 ° C でさらに 15 分間インキュベート 注: 渦マイクロ ビーズのセルにそれらを追加する前に完全に分散配置されていることを確認します。</li>
		<li>280 x g は 5 分、再懸濁します 500 μ L 染色バッファー/MAC で細胞ペレットを最大 10 の8セルのバッファーで細胞を遠心分離機、染色バッファー/MAC バッファー 107セルあたり 1 mL を追加します。以上 10 の8セルのバッファー/MAC バッファーをそれに応じて染色のボリュームをスケール アップします。</li>
		<li>製造元の指示に従って自動磁選機を準備します。</li>
		<li>区切り文字にラベル付きセルを含むチューブを置き、負の選択プログラムを選択します。</li>
		<li>リネージュ陰性 (Lin-) の前駆濃縮細胞が含まれている負の分数を収集します。磁気標識リネージュ陽性細胞が含まれている正の分数を破棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>林- 280 x g で 5 分で細胞を遠心し、染色バッファー/MAC バッファー マウス (例えば骨髄を 2 マウスからプールされた場合 4 mL) あたり 2 mL で細胞ペレットを再懸濁します。 注: ペレットはず赤ではなく白、赤血球が減ったためです。</li>
	<li>林-細胞分注 10 μ L を取る、10 μ L を混ぜてトリパン ブルーと診断に結果トリパン ブルー ラベル サンプルのロード 10 μ L。光学顕微鏡を使用してセルをカウントします。 注: セルに信頼性の高いカウントのためあまりにも集中している場合は、トリパン ブルーを追加する前にサンプルを希釈します。</li>
</ol>3. 骨髄前駆細胞の同定と分離によって蛍光活性化セル (FACS) を並べ替え
<ol><li>ラベル 9 遠心 (1.5 または 2 mL) チューブ: 1) 2-8 細胞の無染色) セル単一 FcγR (CD16/32)、蛍光標識抗体で染色 c キット、Sca 1、CD34、Flt3 (CD135)、Ly6C と電圧の選択と色の補正、および 9 の CD115)サンプル細胞前駆細胞の識別および並べ替えのためのすべての 7 抗体で染色されます。</li>
	<li>サンプル管 (管 9) に各コントロール チューブ (管 1-8)、100,000 セルと残りのすべてのセル (または少ない必要な場合) を配布します。 注: サンプル ボリュームが 1.5-2 mL よりも大きい場合は、必要があります 15 mL チューブにサンプル細胞を配布、遠心分離機のそれらと (以下ステップ 3.3) ペレットを再懸濁します、以降の染色手順微量遠心チューブにセルを転送します。</li>
	<li>1,500 × g で 5 分で細胞を遠心し、100 μ L で制御管ペレットを再懸濁します (例えば1 x 10 の7セル 200 μ L) を細胞 5 × 106ごとにバッファーを染色染色バッファー (PBS + 0.5 %fbs + 2 ミリメートルの EDTA)、100 μ L のサンプル チューブのペレット。</li>
	<li>FcγR 単一染色管、サンプル管に 2 μ g/mL 抗-CD16/CD32-APC-Cy7 を追加します。ミックス、および 4 ° C で 10 分間インキュベートする優しく渦 注: 非特異的 Fc を介した抗体の結合のための競争を防ぐために他の抗体を追加する前に FcγR (CD16/32) 抗体サンプル細胞を染色することが重要です。試薬をブロック、FcγR のセルを孵化しないで。</li>
	<li>他の抗体を追加し対応する単一染色チューブ (1 抗体)、サンプル チューブ (すべて 6 抗体): 10 G/ml c-キット-パシフィック ブルー、2 μ g/mL Sca 1-PE Cy7、25 μ g/mL CD34 FITC、10 μ g/mL Flt3 APC、2 μ g/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 4 μ g/mL CD115 PE。渦優しく、4 ° C で 15 分間インキュベートし、</li>
	<li>900 μ L 染色バッファー コントロール チューブと 1 mL のサンプル管に 10 の7セルごと染色バッファーを追加します。5 分間 1,500 × g 細胞を遠心し、バッファーを染色の細胞ペレットを再懸濁します: コントロール チューブあたり 200 μ L、サンプル チューブ内の 25 x 106セルあたり 500 μ L。5 mL FACS の管に再懸濁細胞を転送します。 注: サンプル ボリュームが 1.5-2 mL よりも大きい場合は、必要があります 15 mL 遠心チューブにセルを転送します。</li>
	<li>製造元の指示に従って流れの cytometer (アナライザーまたは選別機) を準備します。</li>
	<li>制御電圧と色補正を設定する流れの cytometer 細胞を染色無染色と 1 つを実行します。</li>
	<li>サンプル細胞を実行、下記の図 2に要約として前駆細胞サブセットのゲートおよび必要な場合実行 FACS 関連前駆細胞サブセットを分離する並べ替え。 注: それは通常約 200,000 セル前駆門ごとに少なくとも 1,000 イベントを取得するを取得する必要です。<ol>
<li>FSC A (x 軸) と SSC A (y 軸) に表示するすべてのセルのドット プロットを作成して、ゲートの破片や死んだ細胞を除外する = >「ライブ」のセル。</li>
		<li>FSC H (x 軸) と FSC W (y 軸) に表示する、「ライブ」のセルのドット プロットを作成および二重項を除外するゲート = > (FSC) のライブ/一重項ゲート。</li>
		<li>ライブ/一重項のドット プロット (FSC) 細胞、SSC H (x 軸) と SSC W (y 軸) の表示を作成し、ダブレットを除外するゲート = > (FSC) のライブ/一重項/一重項 (SSC) ゲート。</li>
		<li>(FSC) のライブ/一重項のドット プロットを作成/Sca 1 (x 軸) と c キット (y 軸) に表示する、一重項 (SSC) 細胞と c キット+ Sca 1-のセルを選択するゲート = > LKS-細胞。</li>
		<li>LKS-セル、CD34 を表示のドット プロットを作成 (x 軸) FcγR (y 軸) と門のと CD34 を選択する+ FcγRloセル = >「Cmp」と CD34+ FcγRこんにちはセル = >"適性"。 注: 可能な限りゲート"Cmp"および「省」として正確にすることが重要です。正確なゲート pseudocolor 密度プロットとコンター プロットを使用することをお勧めします。</li>
		<li>CD115 を表示する"Cmp"のドット プロットを作成 (x 軸) および Flt3 (y 軸) とゲートを選択します。 Flt3+ CD115loセル = > CMP Flt3+ CD115lo細胞、 Flt3- CD115loセル = > CMP-Flt3-セル、 Flt3+ CD115こんにちはセル = > MDPs 。
</li>
		<li>Ly6C を表示する「省」のドット プロットを作成 (x 軸) FcγR (y 軸) と門のと Ly6C を選択する-セル = >「GMP-Ly6C-セル」, と Ly6C+セル = >「GMP Ly6C+細胞」。</li>
		<li>「GMP-Ly6C-セル」, CD115 の表示のドット プロットを作成 (x 軸) および Flt3 (y 軸) とゲートを選択します。 Flt3- CD115loセル = >適性。
</li>
		<li>「GMP Ly6C+セル」, CD115 の表示のドット プロットを作成 (x 軸) および Flt3 (y 軸) とゲートを選択します。 Flt3- CD115loセル = > GPs、 Flt3- CD115こんにちはセル = > MPs + cMoPs.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages.">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production.">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1++CD115++CD135++common+macrophage/DC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation.">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li><li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells.">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li><li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor.">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes.">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li><li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice.">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li><li>Y&#225;&#241;ez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil,+monocyte,+and+dendritic+cell+production.">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li><li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors.">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

マウス骨髄前駆識別1のための戦略をゲート ワイスマン教授は免疫のゴールド スタンダードと約 20 年間、血液をされているが、それは今"の CMP"と"GMP"ゲート、非常に異質かつ精確であることが明らかゲートの戦略が必要です。我々 はここで記述したプロトコルが特定の骨髄前駆細胞のより正確な定量のイエウサギ経路のマッピングだけでなく、調査の c57bl/6 j マウスの寡能?...

単球、好中球、樹状細胞 (Dc) は、イエウサギと呼ばれるプロセスによって主に骨髄での造血前駆細胞から生じる骨髄系の細胞です。一般的な骨髄前駆細胞 (Cmp の) 骨髄細胞と同様に巨核球、赤血球、ないリンパ様細胞を生成する可能性があります。顆粒球単球前駆細胞 (適性) Cmp から派生した、顆粒球、単球が巨核球と潜在的な赤血球を失っています。単球および古典的な樹状 (cDCs/Pdc) も Cmp 徐々 に分化能の制限の血統で、コミット結果最終的によって作り出される球 DC 前駆細胞 (MDPs) として知られている共通の前駆細胞から生じると考えられている。前駆細胞: 顆粒球前駆細胞、単球前駆細胞、樹状細胞前駆細胞 (図 1)。
ワイズマンと同僚の報告林- c-キットに+ Sca-1- (-以下 LKS) CD34 既に報告がある+ FcγRloの一部マウス骨髄、省は、LKS- CD34 に含まれている間+ FcγRこんにちは分数1。しかし、これらの"の CMP"と"GMP"分数が非常に異質です。たとえば、"GMP"分数には、リネージュ コミット顆粒球前駆細胞と単球前駆細胞1,2も含まれています。CX3CR1 をこと MDPs が別々 に報告された+ Flt3+ CD115+前駆細胞 CD34 と FcγR3、4を表す。MDPs は、cDC/pDC 生産共通 DC 前駆細胞 (Cdp)、c-Kit (CD117) のより低いレベルを表現する報告されてきたを生じ、LKS-一部5には含まれません。
それは従来の単一経路 (CMP-GMP-民主党-単球) 単球が発生する予想。(単球前駆細胞、MPs の名前) 省によって生成されるこのモデル, 単球コミット前駆細胞と一貫性のある2と (一般的な単球前駆細胞、cMoPs の名前) MDPs6共有表面マーカー式に基づいて同一の細胞のように見える.しかし、我々 は最近単球によって生産されているいない独立して省と MDPs、実証、単一細胞 RNA シーケンス7MPs と cMoPs を区別することができた。
最近、c57bl/6 j マウス骨髄異なる寡能性と系統コミットの myeloid 祖先のサブセットを含む 6 亜分画を識別するワイズマン"の CMP"と"GMP"ゲート戦略を変更しました。寡能性省と同様、顆粒球前駆細胞 (GPs) と単球前駆細胞 (MPs および cMoPs は、我々 は現在を区切ることができない) の隔離を可能に Ly6C と CD115 のために汚れることをまず報告"GMP"分数2 (LKS から-CD34+ FcγRこんにちはゲート;図 1)。我々 はその後 MDPs は"の CMP"の割合で主に見られることを実証 (LKS- CD34+ FcγRloゲート)、Flt3 が含まれている+ CD115lo Flt3-サブセット7 (図 1).CMP Flt3+ CD115lo分数は、養子の転送時に適性と MDPs を生成します。CMP Flt3-のサブセットには、CMP Flt3+ CD115lo細胞と省の間の中間体のように見える前駆細胞が含まれています。MDPs とは異なり両方、CMP Flt3+ CD115loおよび CMP Flt3-分数も所有している球および赤血球の潜在的です。
ただし、"の CMP"分数に寡能性 (例えば、個々 のセル CMP Flt3+ CD115lo分数内好中球を所有していることは、本当に前駆細胞が含まれているかどうかは現在のところ明確のことにそれが重要です。単球、DC、巨核球、および潜在的な赤血球)、または、代わりより制限されている血統で、潜在的な前駆細胞の混合物を構成します。コロニー形成アッセイ (セルロース文化) 明らかに細胞顆粒球 (好中球)、赤血球、単球、巨核球潜在的な (ジェム細胞)"CMP"の CMP Flt3+ CD115loと CMP Flt3- 1 、7、直流電位の評価を許可しないが。対照的に、コロニー形成アッセイ"GMP"分数1、2、寡能性適性 (好中球と単球の潜在的な前駆細胞) の存在とこれは最近単一セルによってサポートされてトランスクリプトーム解析8。それは現在知られていない、しかし、これらの寡能性適性はまた他の顆粒球 (好酸球、好塩基球、肥満細胞) を生成するかどうか。
今を示すこれらの研究に基づいて 7 表面のマーカー (cd34 陽性、FcγR、Flt3、Ly6C と CD115 の c キット、Sca-1) 使用でき、寡能性と系列拘束された骨髄前駆細胞のこれらの 6 のサブセットを分離します。体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化) のここで説明されているプロトコルを適用ことができますマウス、および分子解析 (バルクで単一細胞の RNA シーケンス、西部にしみが付くこと、の生体内で養子転送実験など)。
プロトコルは 3 つの段階で構成されています: 1) 骨髄の単一細胞懸濁液調製された細胞、2) (磁気活性化細胞ソーティング)、造血前駆細胞、3) 識別、および分離の流れによって前駆細胞サブセットの望まれた場合の濃縮フローサイトメトリー (適切なアナライザーまたは、ソーターを使用)。最初のステップは、大腿骨から骨骨髄細胞の分離と安楽死させたマウスの脛骨、9その他の前述のプロトコルに似ています。次に、サンプルは、幹・前駆細胞の赤血球、好中球、単球、リンパ球などの細胞表面マーカーに対する抗体のカクテルを使用して分化した細胞を破壊するために濃縮されています。これは必須、前駆細胞のサブセットの検出を最適化し、前駆細胞の識別に必要な抗体とフローサイトメトリーに必要な時間の量を低減する強くお勧めします。以下の血統の枯渇プロトコル説明 Magnetic-Activated セルの並べ替え (MAC) のいずれもマウス系統の細胞枯渇キットを使用して (CD5、CD45R ビオチン化抗体が含まれている (B220) テル-119、Gr-1 (Ly6G/C)、7-4、CD11b 反ビオチン プラスマイクロ ビーズ) と自動磁選機。最後のステップは、識別 (と必要な場合、並べ替え) フローサイトメトリーによる前駆細胞サブセットの。抗体パネルが下記 4 レーザーで流れの cytometer (アナライザーまたは選別機) で使用する設計されています (テーブル 1を参照してください) (405 488 nm nm、561 nm、640 nm)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> 図 1: 好中球、単球および DC 前駆細胞と分化経路。"Cmp"(青)、「適性」(グリーン)1オーバーレイ ワイズマン ゲート イエウサギ7の最近改正されたモデルを示します。この図は、ヤーニェスら20177から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="945">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2)</td>
			<td style="width:177px;">The Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:172px;">Cat#JAX:000664</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">Cat#130-090-858</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#553733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD16/CD32 (Fc&#947;R; clone 93) APC-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#101327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#108114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:357px;">Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#105820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#128012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE</td>
			<td style="width:177px;">BioLegend</td>
			<td style="width:172px;">Cat#135506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">Cat#560718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td style="width:177px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:172px;">Cat#C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">AutoMACS Separator</td>
			<td style="width:177px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>Use the &#34;deplete&#34; program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 15 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">BD FACS Aria III cell sorter</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;">N/A</td>
			<td>5 lasers, 13 colors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:357px;">FlowJo</td>
			<td style="width:177px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:172px;">https://www.flowjo.com</td>
			<td>For further analysis of the .fcs files</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification and isolation of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from mouse bone marrow

好中球、単球や樹状細胞 (Dc) をもたらす骨髄前駆細胞はで識別でき、血液学的および免疫学的解析のためのマウスの骨髄から分離しました。たとえば、骨髄前駆細胞集団の細胞・分子物性研究は白血病変換のメカニズムを明らかにしたり免疫系が病原体に応答する方法を示します。以前の myeloid 祖先識別のため説明流れ cytometry 戦略は、多くの分野で重要な進歩を有効にしているが、彼らを識別する分数は非常に異質。最も一般的に使用されるゲートの戦略目的の集団に濃縮されているもが多数「汚染」の前駆細胞の骨髄分数を定義します。私たちの最近の研究は、この不均一性の多くを解決したし、ここでは提示プロトコル寡能性 6 集団の隔離を可能に前述の 2 系列コミット骨髄前駆細胞骨髄分数。プロトコルは 3 つの段階を記述: 1) 分離骨髄の細胞、2) 磁気活性化細胞ソーティング (MAC で血統の枯渇)、および 3) (を含むフローサイトメトリーによる骨髄系前駆細胞サブセットの識別によって造血前駆細胞の濃縮蛍光活性化細胞選別、FACS、必要な場合)。このアプローチは、前駆の定量化と様々 なin vitroとin vivoのアプリケーションの分離が可能、既に経路と好中球、単球、および DC 分化のメカニズムに新しい洞察力をもたらした。

上記プロトコルを使用して、それは大腿骨から脛骨 (2 脚) 1 つの c57bl/6 j マウス (6-8 週古い、男性または女性) の 1 億の細胞 (赤血球、または 5000 万の有核細胞を含む) を取得することが可能です。1-200 万林-細胞は、Lin+細胞の枯渇を MAC でマウスあたりに分離できます。
6 骨髄前駆細胞サブセットのそれぞれ...

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Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・ タンパク質解析に使用できます。

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

identification-isolation-oligopotent-lineage-committed-myeloid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.4K ビュー.  Cedars-Sinai Medical Center. 識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・ タンパク質解析に使用できます。

ビデオ: Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

免疫・感染学

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

骨髄由来マクロファージの生産

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

単離とマウス骨髄由来の単球の静脈注射

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly motile parasite not only reaches the liver to invade hepatocytes and transform into erythrocyte-infective form. It also migrates into the skin and to the proximal lymph node draining the injection site, where it can be recognized and degraded by resident and/or recruited myeloid cells. Intravital imaging reported the early recruitment of brightly fluorescent Lys-GFP positive leukocytes in the skin and the interactions between sporozoites and CD11c+ cells in the draining lymph node. We present here an efficient procedure to recover, identify and enumerate the myeloid cell subsets that are recruited to the mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of immunizing doses of sporozoites in a murine model. Phenotypic characterization using multi-parametric flow cytometry provides a reliable assay to assess early dynamic cellular changes during inflammatory response to Plasmodium infection.

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.

弱毒で皮内免疫後のマウスの皮膚及び排出リンパノードから骨髄性細胞の単離<em&gt;マラリア原虫</em&gt;スポロゾイト

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...