このプロトコルにより、骨髄や脾臓などの採取したばかりのマウス組織から直接、BFU-EおよびCFU-E赤血球前駆細胞を同定および分離することができます。この技術を使用すると、以前のフロープロトコルでは不可能だった赤血球前駆細胞の純粋な集団を分離できます。この方法は、多くの下流実験で前駆細胞を分離できるようにすることで、赤血球疾患マウスモデルの研究能力を大幅に向上させます。
まず、解剖したての大腿骨と脛骨を冷染色バッファーまたはSB-5に直接入れ、骨髄を抽出する準備ができるまでチューブを氷上に置いておきます。きれいな滅菌モルタルをバケツの氷の上に置き、骨をモルタルに移します。解剖ハサミを使用して、各骨の約1ミリメートルの端を切り取ります。
SB-5を含む26ゲージの針を備えた3ミリリットルの注射器を使用して、骨髄を骨から洗い流して乳鉢に集め、骨が無色になるまで毎回新鮮なバッファーを使用して3〜5回このプロセスを繰り返します。洗い流された骨髄を100マイクロメートルのメッシュでろ過し、氷の上に置いた50ミリリットルの遠沈管に細胞を集めます。次に、乳鉢と乳棒を使用して、洗い流された骨を5〜10ミリリットルのSB-5で粉砕します。
砕いた骨とバッファーの混合物を100マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、以前に収集した細胞とプールします。氷の上に置かれた空の50ミリリットルの遠沈管に100マイクロメートルのメッシュフィルターを設置します。メッシュフィルターに単一の脾臓を置き、0.5〜1ミリリットルのSB-5を脾臓に加えて、乾燥しないようにします。
3または5ミリリットルのシリンジプランジャーのゴム側を使用して、メッシュを通して脾臓をマッシュします。一度に5ミリリットルのSB-5を追加し、すべての細胞がチューブに集められるまでマッシュを続けます。大きなオリフィスチップを使用して、収集した細胞を2ミリリットルのSB-5で上下にピペッティングすることにより、単一細胞懸濁液を調製します。
FMOの同名の抗体を除くすべての抗体をFACSチューブ内の細胞懸濁液に追加することにより、蛍光マイナス1またはFMOコントロールを染色します。単色コントロールを染色するには、FACSチューブ内の細胞懸濁液に単一の抗体を追加します。各コントロールチューブを2 RPMで3〜3秒間ボルテックスし、摂氏4度で暗闇で2.5時間揺らしながらインキュベートします。
インキュベーション後、細胞をSB-5で洗浄し、細胞懸濁液の容量をSB-5で4ミリリットルに構成する。細胞を摂氏4度で10分間900gで回転させ、上清を吸引します。染色されていないすべての単色コントロールを300マイクロリットルのSB-5に再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターメッシュを通して新しいFACSチューブにろ過します。
SB-5でDAPIストックを1〜10, 000の比率で希釈して、DAPI SB-5ソリューションを作成します。1.8ミリリットルのDAPI SB-5でFMOSを再懸濁し、300マイクロリットルのDAPI SB-5でDAPI単色コントロールを再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターメッシュを通して新しいFACSチューブにろ過します。抗体マスターミックスを各サンプルに加えた後、チューブを3000 rpmで2〜3秒間ボルテックスした後、摂氏4度で暗所で2.5時間ロッキング状態でインキュベートします。
前述のように細胞を洗浄した後、サンプルを1.8ミリリットルのDAPI SB-5に再懸濁し、40マイクロメートルのフィルターメッシュを通して新しいFACSチューブにろ過し、膀胱計を使用してサンプルを分析します。前方散乱を使用してサイズに基づいて破片を除去し、次に前方散乱高さと前方散乱領域のヒストグラムを使用してセル凝集体を除外し、単一セルを選択します。側面散布高さと側方散乱領域のヒストグラムを使用して除外を繰り返します。
DAPI の陽性細胞をゲーティングして、死んだ細胞を除外します。系統陰性TUR19陰性キット陽性細胞を選択する。そしてこれらからCD 55を発現する部分集団を選択する。
系統を陰性TUR一19、陰性キット、陽性、CD55陽性細胞を2つの主要集団に細分化し、 CD 49 FおよびCD 1 0 5の発現に基づいてP6およびP7を細分する。今度はCD150およびCD41の式に基づいて、P6をさらにP3、P4およびP5に細分する。同様に、CD 150およびCD 71の発現に基づいて、P 7をさらにBFUE、初期CFUEおよび後期CFUEに細分する。
本研究では、採取したばかりの骨髄細胞と脾臓細胞からバーストおよびコロニー形成ユニットが同定されました。エリスロポエチンの72時間後、またはマウスにおけるビヒクル注射により、エリスロポエチン刺激は、採取された骨髄および脾臓細胞において初期および後期コロニー形成単位集団P1低およびP1高の拡大を示した。インビボでのエリスロポエチンに対する骨髄および脾臓前駆細胞の応答はまた、ビヒクル対照と比較して、初期および後期コロニー形成単位集団P1低およびP1高においてより高い細胞数を示した。
細胞を抗体で標識する前に、単一細胞懸濁液を生成することが最も重要です。これは、ピペッティングを繰り返し上下し、バッファにEDTAを含めることで実現できます。精製された前駆細胞は、あらゆる下流の細胞および分子分析に使用できます。
例えば、シングルセルトランスクリプトミクス、アテスク、コロニーアッセイおよび生化学が挙げられる。この手法は、シングルセルRNA-seq実験からの予測をテストするのに役立ちました。
