この方法は、葉葉芽細胞の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます, 例えば, 葉葉芽細胞のインポート機械の組成.これは、緑化と光合成のために不可欠であり、したがって、地球上の食糧生産のために不可欠です。分子機械は、TOCとTICと呼ばれる葉ロプラスの外側と内側のメンバーの2つの別々の複合体で構成されていますが、組成は完全には知られていません。
この技術の主な利点は、シロイヌナズナシスTOC/TIC複合体の精製は、単一ステップ精製法、TAP-TOC精製法で達成することができるということです。これは、特定の効率的な方法です。一般的に、この方法に新しい研究者は、葉緑体膜分の分離、洗剤、可溶化、または親和性精製に精通していないため、苦労する可能性があります。
シロイヌナズナズの植物を準備した後、冷たいモルタルと砂の害虫を使用して、液体窒素で3週間齢の苗の10グラムを粉砕します。地盤組織に20ミリリットルの冷たい粉砕バッファーを加えます。よく混ぜて、氷の上で解凍します。
次に、粉砕バッファーで 2 層の素早い濾過材料を浸します。ろ過材料の2つの層を通してホモゲネートを50ミリリットル円錐形遠心分離管にろ過します。濾液を摂氏4度で1,500倍に10分間遠心し、上清を新鮮な冷蔵50ミリリットル円錐形遠心管に移します。
同じ条件でもう一度遠心分離を繰り返します。上清を冷たい38.50ミリリットルの超遠心チューブに移し、冷たい粉砕バッファーで最大35ミリリットルを上に置きます。超遠心分離機を使用して、サンプルを100,000倍g、摂氏4度で1時間遠心分離します。
ガラスのテフロンホモジナイザーを使用して、粉砕バッファー内のグリーンペレットを再懸濁します。100,000倍gと摂氏4度で1時間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。ガラスのテフロンホモジナイザーを使用して、1 x粉砕バッファーの 18.75 ミリリットルのグリーンペレットを再懸濁します。
その後、1つのx粉砕バッファーの別の9.375ミリリットルを追加します。9.375ミリリットルの4つのx可溶化溶液を加えて、最終体積を37.5ミリリットルにし、回転シェーカーを摂氏4度で30分間インキュベートします。この後、超遠心分離機を使用してサンプルを100,000グラム、摂氏4度で1時間遠心分離します。
可溶化した膜を含む上清を新鮮な50ミリリットル円錐形遠心分離管に移す。IGGアガロース樹脂を調製した後、可溶化膜の37.5ミリリットルを含む50ミリリットルの円錐管に、先に洗浄したIGGアガロース樹脂を移す。摂氏4度で回転するシェーカーで一晩インキュベートします。
翌日、IGGアガロース樹脂を100g、摂氏4度で5分間沈下する。上清を取り除くためにピペットを使用してください。IGGアガロース樹脂を37.5ミリリットルの緩衝Aで、室温で回転シェーカーに10分間インキュベートした。
テキストプロトコルで概説されているように、沈み込みと樹脂の洗浄を続けます。この後、IGGアガロース樹脂を35ミクロンフィルター付きの500マイクロリットルスピンカラムに移します。平衡のために300マイクロリットルのTEV溶出バッファーでビーズを2回洗います。
次に、TEV溶出バッファーの300マイクロリットルを加え、10マイクロリットルのTEVプロテアーゼを含有する。16°C、350 rpmで2時間、サーモミキサーにビーズを使用してスピンカラムをインキュベートします。次に、スピンカラムを開き、新しいクリーンな1.5ミリリットルチューブに入れます。
このチューブを100回gと摂氏4度で5分間回転させ、溶出物を採取します。本研究では、トランスジェニックA.thaliana植物由来のTAPタグ付き葉膜エンベロープタンパク質複合体が精製される。イムノブロット分析は、TAP-TOC159を単離してTOC複合体のTOC75およびTOC33と相互作用することを確認する。
この葉膜外膜キナーゼ(KOC1)は、TOC159をリン酸化することが知られており、同時単離も行われる。TIC110の存在は、単離されたTAP-TOC159複合体がTIC複合体の成分も含まれていることを明らかにする。FBN1A抗体は、TAP-TOC159複合体を認識せず、汚染がないことを示した。
陰性対照において、免疫沈降NTAPタンパク質は、いずれのTOC、TICタンパク質とも共単離しておらず、TAP-TOC159精製の特異性を確認する。この方法は葉芽細胞タンパク質のインポートに関する洞察を提供することができますが、シロイヌナズナ・サリアナ・ボトルシステムの他の複合体に適用される可能性があります。この手順に従って、ウェスタンブロッティングや質量分析などの他の方法を適用して、既知の成分の存在を実証するか、TOCおよびTIC複合体の新しい成分を同定することができます。
この技術は、塩素細胞タンパク質のインポート分野での研究の道を開き、TOCおよびTIC複合体の新しい成分の機能を探求する道を開いた。
