本研究では、博士イアングッドフェローに授与ウェルカムトラストシニア·フェローシップによって資金を供給された。

1。細胞株の生成：pMEP4トランスフェクション/式<ol><li> pMEP4発現ベクターで細胞をトランスフェクトすると、すべてのモックトランスフェクトした細胞がオフに殺されたまで、ハイグロマイシンB / mlの（Roche）を100μgのを選択します。特定のクローンを単離する必要はありませんので、プラスミドpMEP4はエピソーム維持されます。 </li><li> pMEP4ベクターを含む細胞は、16時間、10μMCDCL 2で処理することにより誘導することができる。の発現と誘導性は細胞株の増幅の前に小さな規模で確認されるべきである。プロテインGのドメインは、ほとんどすべての種からの抗体に結合するTAP-tagタンパク質は容易に検出することができます。大規模な精製の ​​ための細胞の一般的に10コンフルエント175cm 2のフラスコが必要となります。これは約2 X10 8を発現する細胞に相当します。 </li></ol> 2。細胞ライセートの調製<ol><li> PBSに細胞をこすり、単一の50 mlチューブに結合します。 1200倍GFを回転させるまたは5分（これは洗濯後約1.5 mlに減少して起動するにはパックされた細胞は2-3 mlのになる必要があります）。 </li><li>細胞を氷冷PBS（50 MLS各時間）で3回洗浄します。 </li><li> 5 mlの溶解バッファーで細胞を溶解液（50mM Tris-HCl（pH7.5）で、125 mM塩化ナトリウム、5％グリセロール、0.2％NP-40、1.5mMのMgCl 2、25mMのNaFを、1mMののNa 3 VO 4及びプロテアーゼ阻害剤。）注：フッ化ナトリウムは、Na ​​3 VO 4、およびプロテアーゼ阻害剤は、新鮮に追加する必要があります。氷上で5分間出る前に10回ピペッティングします。氷上で5分間氷上で再び出発前に鈍針を用いて注射器を上下に5〜10倍。 syringingを繰り返して、氷上でさらに5分間放置。 </li><li> （液体N 2 /またはドライアイスとエタノール）ライセートを二回凍結融解。サンプルは4℃以上に到達することはできません注：処理する時間があるまでは、-80°Cでこのサンプルを保存することができます。 </li><li> 1.5 mlチューブに小分けサンプルとunlysed細胞とDを削除遠心分離（4℃、10分°C、16,000 X g）でebris。 </li><li>上清を回収し、15mlファルコンチューブに結合し、（オプションで）タンパク質収量の定量化のために20μlのサンプルを取る前に0.45μmフィルターを通過します。その後の分析（サンプル1）さらに50μlのアリコートを削除します。 </li></ol> 3。ウサギIgG-アガロースに結合する （注：すべてのスピンが特に明記しない限り、1分間、4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） <ol><li>静かに瓶を渦巻くことでウサギIgG-アガロース溶液（Sigma-Aldrich社）を懸濁します。 IgGアガロース（カット1ミリリットルピペットチップを使用して）380μlを取り、1分間の遠心分離により出荷/保存液を除去します。明確にするために遠心分離を用いて冷却した溶解バッファーにアガロース三回（4°C）を洗浄します。アガロースの最終収率はパックされたビーズの約250μlのでなければなりません。 </li><li> 2.6（15mlファルコン浴槽内から消去細胞ライセートを追加します。e）は4℃で3時間洗浄したウサギ抗IgGアガロースとインキュベート（または一晩）℃まで回転ミキサーを使用します。 </li><li> 4°Cで5分間アガロースビーズの回転を停止し、その後の分析（サンプル2）の上清を除去します。注：タンパク質タグ付けされ、TAPは現在、ビーズに関連付ける必要があります。 </li></ol> 4。 TEVプロテアーゼ切断 （注：特に断りのない限り、すべてのスピンが、1分間4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） <ol><li>チルド溶解緩衝液中でウサギIgGアガロースビーズを3回洗浄（4℃）（注：溶解バッファーは、プロテアーゼ阻害剤を含むべきではありません）明確にするために遠心分離を使用します。ケアは洗浄ステップ中にビーズを削除したり、紛失しないように注意する必要があります。 </li><li>明確にするために遠心分離を用いたTEVプロテアーゼ切断緩衝液（10mMトリス-HCl（pH 7.5）を、100mMのNaCl、および0.2％NP-40）でビーズをさらに2回洗浄します。最後の洗浄の後を慎重にすべてのliを削除するビーズから一口分。 </li><li> TEVプロテアーゼ切断ミックスを調製する。各サンプルについては、467.5μlのH 2 O、25μlの20倍TEVバッファー（Invitrogen）を、5μlの0.1M DTTおよび2.5μL（25 U）TEVプロテアーゼ（Invitrogen）を含む。パックされたビーズの各サンプルにこのTEV切断ミックス500μlのを追加し、1.7ミリリットルプレ給油管（コスター社）にミックス全体を転送します。インキュベーションの前にその後の分析（サンプル3）30μlのアリコートを削除します。 </li><li> 4℃で一晩TEVプロテアーゼ反応をインキュベート°C回転ミキサーを使用します。短いインキュベーション時間は経験的に決定されるべきであるbaitタンパク質とTEVプロテアーゼ切断部位が最小限のインキュベーション時間のアクセシビリティの性質に応じて使用することができないことに注意してください。 </li></ol> 5。固定化ストレプトアビジンビーズをプラスULTRALINKに結合 （注：すべてのスピンが特に明記しない限り、1分間、4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） </P&gt; <ol><li> 1200倍G（4°C）で5分間ウサギIgGアガロースビーズを含むTEV切断反応を遠心します。分析のために明らかにし、上清の20μlのアリコートを取り外します（サンプル4） </li><li>新鮮1.5ミリリットルプレ給油管（コスター社）に、残りの上清（約480μl）を転送し、氷上でこのままにしておきます。この上清を捨ててはいけない - これはあなたのTEV切断されたbaitタンパク質と関連するすべての結合タンパク質を含んでいます。 </li><li>残りのウサギIgGアガロースビーズを再懸濁してチルドの溶解緩衝液を500μl（2.3節）を追加します。上清を除去し、ステップ5.2からそれと組み合わせる前に、ビーズを明確にするために、この混合物を遠心分離します。 （それは現在のサンプル〜980μlを含む必要があります）氷の上で、このチューブのままにしておきます。 </li><li>その後の分析のためにウサギIgGアガロースビーズ（サンプル5）を保持します。注：SDS-PAGEゲル（またはウェスタンブロット）でこのサンプルを実行する場合、それが原因で、重鎖および軽IgGの存在の背景の多くを与えるチェーン。 </li><li>一方、優しくULTRALINKボトルを渦巻くことでストレプトアビジンプラスアガロースビーズ（Pierce）を固定化に再懸濁します。無給油1.5 mlのチューブに、サンプルあたりのストレプトアビジンビーズのアリコートを70μlのエンドカットで200μlのピペットチップを使用して、遠心分離によって出荷/保存液を除去します。注：これらのビーズは非常に小さいので、 &quot;アヒルのくちばし&quot;や平坦である/ナローエンドのヒントは、洗濯中にビーズの損失を最小限にするために使用することができます。 </li><li>ストレプトアビジンビーズを明確にするために遠心分離を用いて冷却した溶解用緩衝液で3回（4°C）を洗浄します。これは、チューブあたりパックビーズの約45から50μlを残す必要があります。 </li><li> °C回転ミキサーを用いて4℃で3時間（または一晩）洗浄し、ストレプトアビジンビーズとインキュベートを含むチューブにTEVプロテアーゼ切断上清（すなわち、ステップ5.3からのサンプル980μl）を転送します。 </li><li> 4℃で5分間ストレプトアビジンビーズの回転を停止し、（その後の分析のために上清を除去サムPLE 6）。ストレプトアビジンビーズを明確にするために遠心分離を用いて冷却した溶解用緩衝液で3回（4°C）を洗浄します。最終洗浄後、慎重に残りのすべての洗浄バッファーを削除します。 </li></ol> 6。ストレプトアビジン結合ペプチドとbaitタンパク質のビオチン溶出 （注：すべてのスピンが特に明記しない限り、1分間、4℃で冷却遠心機で1200倍gで実施する必要があります） <ol><li>ビオチン（1 mMのD-ビオチン）、回転ミキサーを使用して3時間（または一晩）を4℃でインキュベートした：PBS 500μLを加えることにより、ストレプトアビジンビーズからのHisタグ融合タンパク質を溶出します。 </li><li> 4℃で5分間ストレプトアビジンビーズの回転を停止し、1.5ミリリットルプレ給油管（注に上清を除去：これはあなたの最終的なサンプル/溶出（サンプル7）です。 </li><li>残りのストレプトアビジンビーズをPBS、回転ミキサーを使用して2-3時間（または一晩）を4℃でインキュベートする：別の500μlのビオチンを追加します。 </li><li>投稿泥炭は、ステップ6.2および2溶出（サンプル7）を組み合わせる。この最後の溶出は-80℃で保存することができます</li><li> 、ビオチン溶出の効率性を評価し、残りのストレプトアビジンビーズを凍結し、SDSサンプルバッファー（サンプル8）（推奨：フィッシャーからLaneMarker 5倍削減するサンプル緩衝液）の後で沸騰します。 </li></ol> 7。タンパク質濃度<ol><li>最後の溶出液（サンプル7）が低いため、タンパク質濃度と相対的に高いボリュームの分析の前に集中する必要があります。これは、低分子量（&lt;5 kDa）のVivaspinスピンカラム（Vivascience）を使用して達成することができます。未満100μlに音量を下げ集中することを目指しています。この最後のサンプルは、煮沸し、タンパク質試料バッファー（推奨：フィッシャーからLaneMarker 5倍削減するサンプル·バッファ）に格納することができます。 </li></ol> 8。分析<ol><li>サンプル1-8プルダウンの効率を決定するためにウェスタンブロットで分析することができます。注：する最も二次抗体融合タンパク質のプロテインGドメインと交差反応するが、これは、TEVプロテアーゼ切断後に削除されます。 </li><li>サンプル7は、1Dまたは2D SDS-PAGEで分析することができます。染色は銀またはクマシー（：SilverQuest銀染色およびInvitrogenからコロイダルブルークマシー染色キット推奨）を使用して実行することができます。タンパク質同定は質量分析を用いて行うことができる。 </li></ol> 9。代表的な結果 TAPタグ付けeIF4Eの結合パートナーを識別するには、このプロトコルからの最終的な溶出（サンプル7）の1D SDS-PAGE分析の例を図2に記載されています。この代表的なゲルは、セル内の他のタンパク質とeIF4E相互作用の複雑で豊かな自然を反映しています。また、唯一のTAPタグを発現する細胞株から生成され、図2に示すように、陰性対照との比較は、プルダウン餌このeIF4Eの特異性を示しています。このインスタンス内で濃縮された最終的な溶出の15％（サンプル7）はInvitrogenからSilverquest銀染色キットを用いて染色される前に、市販のプレキャスト勾配ゲルを使用して、1D SDS-PAGEにより分析した。 一般的に残りの濃縮された最終的な溶出の百分の50から85（サンプル7）染色コロイドクマシー（Invitrogen社製）で分析されています。全体の車線からのサンプル（ゲルスライス/バンド）を質量分析によって抽出されたと分析した。 プルダウンeIF4Eに同定されたタンパク質は、非特異的結合パートナーを識別するために、ネガティブコントロールから結合パートナーに対して、ろ過した。 TAPタグ付けeIF4Eのこのプロセスを用いて同定し、最終的なタンパク質は、この手法を用いて同定し、通常のタンパク質の代表である、図2に見ることができます。さらに、eIF3サブユニットの数も（データは示さず）が同定された。 <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。の模式図タンデムアフィニティー精製の ​​手順は6段階のタンデムアフィニティー精製（TAP）プロトコルは、細胞株の生成、細胞溶解、ウサギIgGアガロース免疫沈降、TEVプロテアーゼ切断、ストレプトアビジンビーズアフィニティ精製し、最後にビオチン溶出が含まれます。 <img src="/files/ftp_upload/3643/3643fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。マウスeIF4Eタンパク質のタンデムアフィニティー精製、Nの対話パートナー末端タグ付きのeIF4Eのタップが接続されたプロトコルを使用して、真核HEK293細胞から精製した。最後の溶出（サンプル7）の20％の画分は、プレキャスト4-12％勾配ゲル（TAP-eIF4Eレーン）をSDS-PAGEにより分析した。同等の分析が単独でタグ（TAPレーン）を行った。タンパク質は銀染色を用いて同定した。その後、同じ試料の質量分析法によって同定されたタンパク質は、このゲル上で強調表示されます。 略語：eIF4G、真核生物の翻訳開始F俳優4ガンマ、PABP、ポリA結合タンパク質、eIF4A：真核生物翻訳開始因子4α、SBP-eIF4e、真核生物翻訳開始因子4E結合、真核生物翻訳開始因子4Eに融合し、4EBPsストレプトアビジン結合ペプチドを含む、残りのTAPのbaitタンパク質タンパク質、eIF4eNiF1l真核生物翻訳開始因子4E核インポート因子1、SBP、TEV融合していないTAPのペプチドから残りのストレプトアビジン結合ペプチド。

<ol>
	<li>Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions.">Protein-protein interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).</li><li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Blackwell, C., Brown, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+application+of+tandem-affinity+purification+to+Candida+albicans.">The application of tandem-affinity purification to Candida albicans.</a> Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).</li><li>Cochrane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+complex+formation+between+HIV+Rev+and+the+nucleosome+assembly+protein,+NAP1,+affects+Rev+function.">Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function.</a> Virology. 388 (1), 103-111 (2009).</li><li>Fernandez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+tandem+affinity+purification+of+PSD-95+recovers+core+postsynaptic+complexes+and+schizophrenia+susceptibility+proteins.">Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins.</a> Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+of+protein+complexes+from+mammalian+cells+by+the+Strep&#47;FLAG+(SF)-TAP+tag.">Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep&#47;FLAG (SF)-TAP tag.</a> Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).</li><li>Holowaty, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+profiling+with+Epstein-Barr+nuclear+antigen-1+reveals+an+interaction+with+the+herpesvirus-associated+ubiquitin-specific+protease+HAUSP/USP7.">Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7.</a> J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).</li><li>Burckstummer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+tandem+affinity+purification+procedure+for+interaction+proteomics+in+mammalian+cells.">An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4+E.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E.</a> EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).</li><li>Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+initiation+factor+4E.">Eukaryotic initiation factor 4E.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここに示すTAPタギング技術は、真核細胞内でベイトタンパク質の結合パートナーを単離するための高度に特異的かつ厳格な方法を示しています。このアプローチは、細胞とウイルス両方のタンパク質に適用することができます。我々の知る限り、このような手法は翻訳開始因子eIF4Eに適用されたのは今回が初めてです。このテクニックを使用して既知のeIF4E結合タンパク質のeIF4Gと4EBPsの同定は、このようなアプローチの有効性を確認します。さらに、eIF4F複合体の残りのコンポーネントの識別、すなわちeIF4Aと、PABPは、間接的な相互作用および第三複合体が精製プロセス中にそのまま残っていることを確認します。標準的なeIF4e結合タンパク質の複数のアイソフォームの同定にも明らかであった。これらは、図2で詳細に説明されています。 アプローチの限界に関しては、一定の注意が選択肢に関しては注意が必要ですbaitタンパク質およびN末端またはC末端タグtagを配置するか否かを判定する。それは機能的アッセイを実施またはタグ誘導体の機能であることを確認する前に、フルスケールの精製に顕微鏡により融合タンパク質の局在を調べることをお勧めかもしれません。内在性膜や核タンパク質は必ずしも溶解ステップで説明されて相対的に中性洗剤を条件によって解放されない場合があります。すべての免疫沈降と同様のプルダウンアッセイと同様に、変更は溶解の効率を高めるために溶解バッファー中で自然と洗剤の濃度に作ることができる。溶解および洗浄バッファーのイオン濃度はまた、精製のストリンジェンシーを増加または減少するように変更されることがあります。それは、標準的な温和な条件（上記）で初期精製を行うことも可能ですが、その後に続いて増加するイオンの消費で洗浄することができます4月5日のアリコートにストレプトアビジンビーズ（セクション5.8）、分割ditions。これにより、ユーザーは、非特定の相互作用するタンパク質を除去する最適な条件を識別するために有効にすることができます。全体のプロセスは、相互作用パートナーが知られており、それらの有無だけで、その後のウェスタンブロットによって決定される一過性トランスフェクションを使用して実行することができます。このケースでは、発現プラスミド8μgのトランスフェクションした細胞の2 100センチメートル2皿ずつお勧めします。既知の結合パートナーと相互作用するTAP-融合タンパク質の変異体の誘導体の能力を調べるときにこの変更されたプロシージャは、特定の使用である。 テクニックは許容可能な結果を​​生成するために失敗した銀染色SDS-PAGEゲル（またはウェスタンブロットによる抗体が使用可能な場合）に8を介してサンプル1を分析することで、トラブルシューティングの優れた方法です。それぞれの親和性に基づく降水量と特定の溶出の効率が、この体系的なサンプリング手法を用いて分析することができます。サンプル八から一はoptim中に撮影されるべきそれぞれの新しい餌のためのプロトコルの化。 TAPタグ付け技術は、GSTのような他のアプローチはプルダウンなどの二重アフィニティー精製および特定の溶出ステップ（TEV切断部位とビオチン溶出）で維持する特異性と厳しさを提供して酵母ツーハイブリッドアッセイをに強力かつ堅牢な代替手段を提供精製工程を通して高いレベル。批判的にこの手法は、任意のタンパク質に適用することができるので、目的のタンパク質ターゲットの結合パートナーを同定するための優れた方法を表しています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>ロシュ社</td><td> 10843555001 </td></tr><tr><td>ウサギIgGアガロース</td><td>シグマ</td><td> A2909 </td></tr><tr><td> AC-TEVプロテアーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 12575-015 </td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>カルビオケム</td><td> 539134 </td></tr><tr><td> UltraLinkは、ストレプトアビジンプラスビーズ固定化</td><td>ピアース</td><td> 53116 </td></tr><tr><td> Vivaspin 500遠心濃縮機（5KDa） </td><td> Vivaspin </td><td> V50112 </td></tr><tr><td> SilverQuest銀染色キット</td><td>インビトロジェン</td><td> LC6070 </td></tr><tr><td> NOVEXコロイドブルークマシー染色キット</td><td>インビトロジェン</td><td> LC6025 </td></tr><tr><td> 1.7ミリリットル封入管</td><td>共演者</td><td> 3207 </td></tr><tr><td>マイクロキャピラリーピペットチップ</td><td> VWR </td><td> 37001-150 </td></tr><tr><td> NuPage 4から12パーセントビス - トリス勾配ゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> NP0322BOX </td></tr><tr><td> CDCL 2 </td><td>シグマ</td><td> 202908 </td></tr><tr><td> 5X SDSサンプルバッファー</td><td>フィッシャー</td><td> PN39000 </td></tr></tbody></table>

identification of protein interacting partners using tandem affinity purification

ホストとウイルスタンパク質の機能を理解する上で重要かつしばしば律速段階は、細胞またはウイルスタンパク質パートナー相互作用の識別です。酵母ツーハイブリッドシステムと同様に、組換えタンパク質および質量分析同定続く1内因性タンパク質の免疫沈降を用いたアッセイをプルダウンを含む相互作用パートナーの同定を可能にする多くのアプローチがあります。最近の研究では、相互作用するタンパク質の同定つの特定の溶出ステップで結合し、ダブルアフィニティータグ媒介精製の有用性を強調している。このアプローチでは、と呼ばれるタンデムアフィニティー精製（TAP）は、最初に酵母2,3で使用されていたが、最近哺乳動物細胞で4-8を使用するように適応されています。 概念実証として、私たちは十分に特徴付けられた真核生物の翻訳開始FACを使用してタンデムアフィニティー精製（TAP）法を確立していますTorのeIF4E 9,10。携帯翻訳因子eIF4Eはキャップ依存性翻訳開始10に関与する細胞eIF4F複合体の重要なコンポーネントです。現在の研究で使用されているのTAPタグが2つのプロテインGユニットから構成され、ストレプトアビジン結合ペプチドは、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ切断配列で区切られています。現在の研究で使用されているのTAPタグが2つのプロテインGユニットから構成され、タバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ切断配列8で区切られたストレプトアビジン結合ペプチドである。クローン細胞株を生成するための必要性をあきらめるために、我々はpMEP4（Invitrogen社）に基づいて、エピソームに保持するプラスミドから、TAPタグ付きベイト蛋白質の発現に依存して迅速なシステムを開発しました。このプラスミドからのタグ付きマウスeIF4Eの発現は、塩化カドミウム誘導性メタロチオネインプロモーターを用いて制御されていました。 Rへの結合を介して発現する細胞とそれに続くアフィニティ精製の溶解abbit IgGアガロース、TEVプロテアーゼ切断は、ストレプトアビジン架橋アガロースに結合して（単独TAPタグを発現する細胞株を制御する場合と比較して）、その後のビオチンの溶出は、プルダウンeIF4Eに明らかに特定の多くのタンパク質を同定した。タンパク質の同定は、1D SDS-PAGEからのバンドの切除とその後のタンデム質量分析により得られた。識別されるコンポーネントは、eIF4Gと4EBP-1の既知のeIF4E結合タンパク質が含まれています。さらに、eIF4EがコンポーネントであるeIF4F複合体の他の成分は、eIF4Aとポリ-結合タンパク質すなわち、同定された。知られている直接の結合パートナーとしてだけでなく、二次相互作用するタンパク質だけでなく、を識別する能力は、さらに、機能未知のタンパク質の特性評価では、このアプローチの有用性を強調しています。

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Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

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Research

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Biology

37.3K ビュー.  Imperial College London. タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

GST-His purification: A Two-step Affinity Purification Protocol Yielding Full-length Purified Proteins

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. Protein purification protocols should combine efficiency, simplicity and cost effectiveness1. Here, we describe the GST-His method as a new small-scale affinity purification system for recombinant proteins, based on a N-terminal Glutathione Sepharose Tag (GST)2,3 and a C-terminal 10xHis tag4, which are both fused to the protein of interest. The latter construct is used to generate baculoviruses, for infection of Sf9 infected cells for protein expression5. GST is a rather long tag (29 kDa) which serves to ensure purification efficiency. However, it might influence physiological properties of the protein. Hence, it is subsequently cleaved off the protein using the PreScission enzyme6. In order to ensure maximum purity and to remove the cleaved GST, we added a second affinity purification step based on the comparatively small His-Tag. Importantly, our technique is based on two different tags flanking the two ends of the protein, which is an efficient tool to remove degraded proteins and, therefore, enriches full-length proteins. The method presented here does not require an expensive instrumental setup, such as FPLC. Additionally, we incorporated MgCl2 and ATP washes to remove heat shock protein impurities and nuclease treatment to abolish contaminating nucleic acids. In summary, the combination of two different tags flanking the N- and the C-terminal and the capability to cleave off one of the tags, guaranties the recovery of a highly purified and full-length protein of interest.

In the present protocol, we demonstrate a highly efficient and cost-effective small-scale protein purification method, which allows purification of recombinant proteins by uniquely combining a cleavable GST-tag and a small His-tag.

GST-Hisの精製：全長精製タンパク質を降伏二段階アフィニティー精製プロトコル

Key assays in enzymology for the biochemical characterization of proteins in vitro necessitate high concentrations of the purified protein of interest. ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...