このプロトコルは、メタボロミクス、プロテオミクスおよびリピドミクス、および核磁気共鳴分光法プラットフォームを用いて、質量分析法を用いた単一サンプルの包括的で公平な分子特性解析法について説明する。このアプローチの意義は、異なる種類の分子を同定することで、ゲノムの下流にある生物学的システムを特徴付けることができ、代謝および分解経路を推測できることです。シーケンシャル抽出技術は、生物利用可能な極性化合物を水を用いて抽出し、続いてMPLExが1つのサンプルからタンパク質および脂質と同様に任意の追加の極性化合物または代謝産物を捕捉することを可能にする。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、2番目の抽出ステップで3つの層を分離し、抽出物を異なる分析機器間で分割することを科学者に導くので重要です。統合的なマルチオミック解析は、より効果的な調査と複雑な生物学的システムの完全な理解を可能にします。この堅牢な方法は、分子の広い多様性を抽出し、多様なサンプルタイプに適用可能です。
テキスト プロトコルで説明されているように、サンプルの収集と準備を行い、この手順を開始します。洗浄されたエタノールを用いて、ステンレス製の器具、各乾燥試料のアリコート50ミリグラムを個々の2ミリリットルガラスチューブに入れた。各サンプルに蒸留された脱気水を1ミリリットル加えます。
その後、バイアルをキャップし、シェーカーテーブルの上に2時間振ります。30分間重力の15,000倍のサンプルを遠心分離します。そして、溶液を室温で20分間放置します。
デカントし、各サンプルから上清を保存します。これらの抽出ステップを繰り返して、現在水抽出残渣にMPLEx抽出を行います。蒸留された脱気水に対してメタノール混合物にマイナス20度の摂氏4〜3クロロホルムを置換することを除く。
慎重にピペット処理によって最上層を除去することによって視覚的に区別可能である2つの得られた溶媒層を分離します。凍結乾燥機の下の非極性層を乾燥させます。乾燥するとすぐに、次の数日以内に分析する場合は、クロロホルム5マイクロリットルとメタノール195マイクロリットルを加えます。
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法に対するエレクトロスプレーイオン化効率を向上させるために、直接噴射によりFTICR-MSを省略した。クロロホルムエキスをメタノールで1対1で希釈し、水をメタノールで2対1で抽出します。FTICR分光計は、約100~1,300ダルトンの質量範囲に及ぶ100マイクロリットルのチューニング溶液をFTICR-MSに直接注入して校正します。
Suwanneeリバーフルビック酸標準の100マイクロリットルをエレクトロスプレーイオン化源に直接注入します。1分間に3.0マイクロリットルの流量に設定されたシリンジポンプを介してFTICR分光計に結合される。針の電圧を正の4.4キロボルトに設定します。
1~100質量対充電比、ガラスキャピラリーを180°Cで待ちます。解析ソフトウェアを使用して得られたスペクトルを検査し、データの品質を確認します。次に、エレクトロスプレーイオン化源への直接注入を介して各抽出物の100マイクロリットルを導入し、毎分3.0マイクロリットルの流量に設定されたシリンジポンプを介してFTICR分光計に結合する。
パラメータを前と同じに設定します。炭素濃度の変動を考慮して、各サンプルまたはサンプル群のイオン蓄積時間を調整します。各サンプルの144スキャンを収集し、スキャンを平均化し、相同CH2シリーズを使用して内部キャリブレーションを行います。
濃縮器を使用して抽出物を乾燥し、その後のガスクロマトグラフィー質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析、核磁気共鳴分光分析のために残りの抽出物を保存します。GC-MS の準備をするには、まずテキスト プロトコルで説明されているように、空のコントロール サンプルを準備します。カルビノール基を保護するために、メタノール抽出物、水抽出物、ブランク、FAMEキャリブレーションサンプルを含む各サンプルに、パラダインの1ミリリットルのメトキサミン塩酸塩あたり30ミリグラムの20マイクロリットルを追加します。
バイアルをキャップで密封します。20秒間抽出物を渦液にし、60秒間抽出物を超音波処理します。100倍の重力で90分間摂氏37度で抽出物を遠心分離します。
各サンプルに1%トリメチルクロロシランを含むMSTFAの80マイクロリットルを加えます。以前のように抽出物をボルテックスして超音波処理した後、100倍の重力で30分間摂氏37度で再び抽出物を遠心分離します。抽出物を室温まで冷却した後、GC-MSオートサンプラーバイアルに移します。
テキストプロトコルで説明されているように、GC-MS分析とデータ処理に進みます。液体状態の NMR 分析の準備をするために、残りの水抽出物を 5 ミリモル DSS 内部標準で 10% 希釈します。混合物を高品質の3ミリメートルの外径ホウケイ酸ガラスNMRチューブに移します。
テキストプロトコルで説明されているように、NMR分析とデータ処理に進みます。LC-MSリピドミクス分析を行うために、各抽出物の10マイクロリットルを超高性能液体クロマトグラフィーシステムに注入し、逆相帯電表面ハイブリッドカラムを使用してOrbitrap質量分析計に結合します。テキストプロトコルにリストされている34分のグラデーションを、1分あたり250マイクロリットルの流量で設定します。
エネルギー衝突解離と衝突による解離性が高い負イオン化モードと正イオン化モードの両方を使用します。プロテオミクス解析を行うために、まず、テキストプロトコルで概説されているように、メタノール相の残りの部分に対するMPLExプロトコルに従ってタンパク質を抽出する。ピートは、米国ミネソタ州の環境やSPRUCEサイトの下でスプルースとピートランド応答でS1泥沼の深さと比較されました。
3,312酵素をプロテオミクス分析で同定した。深度の酵素活性を分析した結果、SPRUCEボグでは15センチメートルから45センチメートルの間で酵素の数が急激に減少する。代謝産物および酵素活性の部位がどのように変化するかを示すために、SPRUCEの結果はスウェーデン北部の永久凍土ボグおよびフェンの結果と比較される。
全体の67,040代謝産物は、FTICR-MS、NMR、GC-MSおよびLC-MS分析の組み合わせからすべてのSPRUCE泥炭サンプルで同定された。ここに示されているのは、異なる深さの様々な技術によって同定された異なる化学クラスの相対的な割合である。アミノ酸と糖は深度に減少しますが、これは脂質には認められていません。
KEGG Databaseに対するすべての分析で同定された代謝産物を交差検証することによって、同定された化合物がトリカルボン酸サイクル、解糖および糖代謝などの一般的な代謝経路に関与していると判断された。この手順を通じて、潜在的な汚染源を認識することが重要です。分析を通じてサンプル収集から始まり、サンプルはイオン化に悪影響を及ぼす可能性のあるペギングプラスチックと接触してはいけません。
抽出手順中に使用される溶媒の多くは、危険または可燃性です。皮膚や目の接触を避けるだけでなく、サンプルを汚染しないように、常に適切なPPEを着用してください。
