このビデオでは、集団への影響を最小限に抑え、科学的価値を最大化することを目的として、人道的な方法でコウモリを収集するためのステップバイステップガイドを提供します。私たちのアプローチの利点は、各コウモリの潜在的な分子および形態データの量を最大化し、組織を保存して将来の価値を維持し、野生の個体の収穫を最小限に抑えるということです。解剖プロトコルは口頭で実証することは困難です。
私たちがここで提示する組織製剤技術の多くは、異なる臓器がどのように識別され、適切に解剖され、保存されているかを視覚化することで最もよく伝えられます。遅延を避けるために、すべての切り分けを開始する前にすべてのバイアルを準備します。RNAの場合は、各標本に必要なバイアルの数を確保します。
各チューブに、収集される組織タイプと、標準的な検体識別情報をラベル付けします。RNA安定化溶液のバイアルを50%満たし、摂氏4度まで冷やします。液体窒素に入れるとチューブが爆発する可能性があるため、バイアルをRNA安定化溶液で完全に満たさないように注意してください。
安楽死の直後に、テキストプロトコルに記載されているようにコウモリの標本の切断を行う。鼻の皮膚を含む髪、筋膜、頭蓋骨の筋肉から頭蓋骨を皮膚にする。鼻の前端を壊さないで注意してください。
視神経を切り離すのに十分な強い力を使って、鉗子で目を取り除きます。RNA安定化溶液の2ミリリットルバイアルに目を入れます。はさみを使用して、頭から始まる頭蓋骨の後部に矢状の切り傷を作り、脳に損傷を与えないように注意してください。
次に、鉗子を使用して頭蓋骨の両側を静かに引き戻し、脳を露出させるために開いて割れるまで使用します。鉗子が簡単に脳を削り取ることができるように、頭蓋末端の頭蓋骨が取り除かれていることを確認します。脳を鉗子で優しくこすります。
脳は非常に柔らかくなります。嗅球は頭蓋骨の内部の腹側部分に座って目に見えるようになります。嗅球を取り付け続けるようにしてください。
可能であれば、脳の形状をそのままにし、すぐにドライアイスの上に置くか、RNA安定化溶液の5ミリリットルバイアルに入れます。頭蓋骨の尾端で、コクレイは頭の両側に横に見えるはずです。鉗子を使ってコクレイをそっと引っ張ります。
次いで、RNA安定化溶液の2ミリリットルバイアル1つに入れます。上顎と下顎が結合する2つの切開を行い、下顎を取り除きます。クリブリフォームプレートが明らかになります。
これは研究者を重視し続ける重要な骨です。それは頭蓋骨の最も前部領域として識別することができ、複数の前置を有し、嗅球が置かれる2つの溝を有する。下顎骨を取り除いたら、頭蓋骨の残りの部分からロストラムを取り除きます。
顎にクリブリフォームプレートが含まれていることを確認します。RNA安定化溶液に鼻を入れ、一晩摂氏4度で保存します。下顎から舌をハサミで切り、RNA安定化溶液の2ミリリットルバイアルに入れる。
RNA安定化溶液に一晩浸した後、液体窒素に鼻バイアルを入れます。氷に浸かるか、冷蔵庫に24時間浸した後、液体窒素にサンプルを入れます。メスを使って腹腔を貫通し、肋骨まで縦切開を行います。
これは骨格フレームを没収します。皮膚を剥がして胸筋を明らかにし、筋肉の少なくとも2つのサンプルを採取する。RNAとDNAの両方の組織は、これらの切片の間に収集されます。
高分子量DNAの組織を乾燥した凍結に入れ、液体窒素中でフラッシュフリーズします。RNA安定化溶液にRNAの組織を配置します。胸骨を切り裂き、肋骨を引き離します。
さて、肺と心臓を取り出します。心臓を肺から分離するためにメスと鉗子を使用してください。メスを使って肺を分解し、RNA安定化溶液に入れます。
全体を取ることができるが、RNA安定化溶液が徹底的に浸るように、半分に分割する必要がある心臓を収集します。さて、肝臓からサンプルを取る。肝臓の少なくとも2つのサンプルを取る.
1つのサンプルをバイアルに入れ、高分子量DNAのために凍結したままにし、もう一方のサンプルをRNA安定化溶液に入れる。肝管に従って膵臓と胆嚢を見つけます。胆嚢をRNA安定化溶液のバイアルに移す。
胃を見つけ、そのベースに羽のような脾臓は、紫色の異なる色合いとして表示されます。膵臓はまた、重量構造としてここで見る必要があります。RNA安定化溶液のバイアルに、胃、脾臓、膵臓をそれぞれ集める。
小腸と大腸の小さなサンプルを収集します。RNA安定化溶液のバイアルをそれぞれ入れる。腎臓の1つを取り、膀胱に彼らのダクトに従って、RNA安定化溶液のそれぞれのバイアルに置きます。
他の腎臓をガイドとして使用して、男性の場合は精巣を見つけ、女性の場合は子宮と卵巣を見つけてください。可能であれば、一方または両方の生殖腺を収集します。また、翼の皮膚の様々な部分のサンプルを採取し、別々のバイアルに保管してください。
私たちのアプローチの主な利点は、ゲノム研究だけでなく、機能的な分子研究のための十分な材料を生成しながら、非致死的な方法で動物をサンプリングすることができるということです。私達の議定書は翼のティッシュからの一次線維芽細胞の準備を可能にする。細胞は、貴重な再生可能な遺伝物質の供給源であり、コウモリの機能的および分子探査のモデルを表しています。
書かれたプロトコルのセクション6に従って成長媒体に保存されている翼クリップは、組織培養施設に移すべきである。チューブの内容物を15ミリリットルの円錐型遠心分離管に移します。このデモンストレーションには、翼膜生検が用いられます。
慎重に成長培地を取り除きます.500マイクロリットルの無菌PBSで生検を2回静かに洗います。チューブに1ミリグラム1ミリグラムの500マイクロリットルを4ミリリットル加えます。
これは、個々の細胞に組織の消化を引き起こす.攪拌することなく摂氏37度で一晩インキュベートします。2日目には、新鮮な成長培地を作り、摂氏37度に予熱します。
使用するプレートの各ウェルに新鮮な前温化成長培地を2ミリリットル加えることによって、6つのウェル組織培養プレートを準備します。必要になるまで、このプレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターに保管してください。培養器から細胞を含む15ミリリットルのチューブを取り出し、新鮮な成長培地を1ミリリットル加えて消化反応を焼き付ける。
P1000ピペットチップで溶液を慎重にトリチュールして細胞を再懸濁し、単一の細胞懸濁液を達成する。卓上遠心分離機の細胞を300倍のGで3分間そっと回転させ、P1000ピペットで80~90%の液体をそっと取り除いて上澄み物を捨てます。ペレットを500マイクロリットルの前温成長培地で再懸濁する。
ペレットが見えなくなり、細胞が十分に懸濁されるように懸濁液を穏やかに三分し、壁にまだ見える小さな組織を避けるようにします。細胞懸濁液の全容を、前に調製した6つのウェルプレートの単一のウェルに穏やかにピペットし、プリウォーム成長培地を含む。プレートを左右に左右にゆっくりと揺らし、2~3回前後に揺れ、細胞が単一の層のウェルサーフェス上に分散するのを助けます。
顕微鏡下でめっきされた細胞を確認してください。彼らはボールアップして浮かんでいるように見える単一の細胞であるべきですが、非常に密度が高いです。プレートを37°Cと5%の二酸化炭素にプリセットインキュベーターに慎重に置きます。
約24時間後、顕微鏡下で細胞を観察し、培養の健康を判断する。これで、セルがプレートサーフェスにアタッチされ、平坦に表示されます。加湿インキュベーターで細胞を37°Cと5%の二酸化炭素にプリセットします。
細胞は、定期的に顕微鏡下で観察して、メディアのリフレッシュまたは分割の必要性を判断する必要があります。必要に応じて、培地の約50%をウェルから慎重に吸引し、細胞を乱さないように、温めの側面に1ミリリットルの前温化成長培地を加えて穏やかに加える。細胞を通過させる必要がある場合には、約90%の増殖培地を慎重に吸引する。
細胞を邪魔しないように、ウェルの壁に1ミリリットルの無菌PBSを加えることによって、細胞を非常に穏やかに洗います。プレートを前後にゆっくりと揺らし、左右に2~3回揺らします。慎重に再び細胞を洗浄する前にプレートからPBSのすべてを吸引します。
トリプシンEDTAを井戸に加え、プレートを優しく揺らし、トリプシンEDTAでウェルの全面を覆い、室温で1分半インキュベートします。新鮮なプリウォーム成長培地を1ミリリットル添加して反応を焼き付けた。ピペットはプレートの表面から細胞を洗浄するために約5回上下し、細胞が懸濁していることを確認した。
細胞懸濁液を15ミリリットルチューブに入れ、セルを卓上遠心分離機の中で3分間G.300倍にして回転させ、P1000ピペットで液体の80~90%を静かに取り除いて上清を捨てます。ペレットを生育前培地の1ミリリットルに再懸濁し、懸濁液を穏やかにトリチュレートする。ペレットまたは大きなペレットの断片が見えなくなり、細胞が単一細胞懸濁液に含まれるようにします。
自動化された細胞カウンターを使用して細胞を数えるために、浮遊細胞の10マイクロリットルアリコートをトリパンブルーと1対1で混合して生存細胞を検出する。1分間インキュベートし、溶液のピペット10マイクロリットルを計数スライドに入れ替えます。自動セル カウンターに計数スライドを挿入し、適切な設定を使用してセルをカウントします。
DMSOと成長培地を組み合わせて凍結培地を調製し、10%DMSOの最終濃度を得る。ペレットは、6つのウェルプレートの80〜90%コンフルエントウェルから調製する必要があります。凍結培地の1.5ミリリットルにペレットを再懸濁します。
2つの別々のクライオビアルのそれぞれに約750マイクロリットルの細胞懸濁液を入れる。バイアルを極低温凍結容器に入れ、細胞の活力を維持するためにゆっくりと凍結するようにします。すぐにマイナス80度に置きます。
凍結細胞を解凍するには、使用される各ウェルに2ミリリットルの前温化成長培地を含む6つのウェルプレートを調製する。必要になるまで、37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターでプレートを維持します。液体窒素から細胞のバイアルを1本取り出し、温かい水浴に入れて細胞を急速に解凍します。
これには2~3分かかります。バイアル内の溶液が解凍されるとすぐに、ピペットを上下に軽くして溶液を均質化し、すぐに溶液全体を6つのウェルプレートの1つのウェルに入れます。プレートを左右に左右にゆっくりと揺らし、2~3回前後に揺れ、細胞が単一の層のウェルサーフェス上に分散するのを助けます。
細胞をインキュベーターに摂氏37度、炭酸ガス5%を24~48時間置きます。デモンストレーションのようにセルを監視し、通過させます。DNA抽出の代表的な結果は、3つのコウモリ種からの標準的なDNA分析のために示されている。
単一の大きなバンドは、最小の断片化を示し、それぞれの抽出からDNAの同様のサイズの断片を示します。RNA抽出の成功の一般的な指標は、RNA完全性数(RIN)であり、8を超える値はタクトRNAの高品質を表します。ここに示されているのは、4つの異なる局所でサンプリングされた13種類の新熱帯コウモリ種からのRNA抽出のRIN値である。
アンデス、コスタリカ、ドミニカ共和国の種からサンプリングされた組織は、RNA安定化溶液に一晩で4°Cで浸漬した後、液体窒素に直接入れました。アマゾンの種から採取した組織は、RNA安定化溶液を入れてから約1週間後に液体窒素に入れ、摂氏4度で連続的に保った。そのような場合でも、RIN値は、RNA安定化溶液に直ちに入れられたものと比較し、液体窒素に直接入れられました。
組織培養後、コウモリ細胞培養はプレート表面の80〜90%を覆い、元の形態を維持する必要があります。これは、分割に最適なステージを表します。6回以上の経過の後、細胞は形態を大きく、より長く変化させ、細胞は老化に入ります。
明るいボールアップセルは死んだ細胞を表します。培養中の細胞は、DNA、RNA、タンパク質などの再生可能な材料源を表します。これらの細胞株は凍結することができ、従って研究の多くの年にわたって使用することができる資源を提供する。
これは、ゲノム、転写、および主要組織を使用して挑戦される機能研究を可能にします。例えば、細胞は、細胞の型に対する影響を観察するために、遺伝子や化学的に改変することができる。
