クーBKとMustata RCは医学研究審議会（MRC）でサポートされているウェルカムトラストとアンダーソン·ロルフAからのサー·ヘンリー·デール·フェローシップでサポートされています。フィンクJはウェルカムトラスト4年間の博士課程 - プログラムによってサポートされています。

以下のプロトコールで使用される全てのマウスは、特定病原体を含まない条件下で維持し、全ての手順は、英国内務省の規制に従って行った。 の調製<ol><li>使用に先立ってメディア1時間を準備し、少なくとも10分間、使用前に37℃の水浴中および前加温（ 表1および材料のリスト詳細は参照）。 </li></ol> 2培養小腸（SI）オルガノイド注：特に明記しない限り、全てのインキュベーションは、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO 2で行われる。生きている細胞と接触する機器および試薬は、無菌でなければならない。 それは地下マトリックス（マトリゲルまたはBME）は播種時に広がるから落下防ぐように組織培養プレートを事前に温めることが重要です。また、基底行列は常に氷上で維持されるべきである。 -20℃と融解で保存使用前に氷上で。 <ol><li>陰窩の分離<ol><li>小腸を単離するために、その後、国の規則および規制に従って、マウスを犠牲にし、その裏に動物を配置し、70％エタノールで腹部を洗う。胸骨に足の付け根から縦正中切開を行います。まず、皮膚、次に皮下組織を切断する。胃に盲腸から小腸を取り出します。十二指腸、空腸および回腸から単離された陰窩はオルガノイド培養のために使用することができる。 </li><li>カルシウムやマグネシウム（PBS0）することなく、予め冷却したリン酸緩衝生理食塩水と分離され、小腸を洗ってください。 </li><li> 3〜5センチメートル長い断片に組織を切断し、縦に開いて、それをカットするはさみを使用しています。鉗子を使用して組織を広げる。 </li><li>カバーガラスを使用した絨毛を削り取る。注意、あまりにも多くの力が組織を引き裂くことになりますし、手順に従ってに陰窩の収量が減少します。 </li><li>予備冷却PBS0を使うを含む50mlチューブに組織を移すグラム鉗子。激しく振盪を通して組織片を洗浄しPBS0を変更してください。 2〜3倍を繰り返したりPBS0はあまり濁って変わるまで。 </li><li>チューブローラー上で4℃で30分間、1mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）でPBS0を30 mlを含む50mlチューブ中で組織をインキュベートする。 </li><li>激しくチューブを振るおよび5mM EDTAでPBS0 30mlのを含む別の50ミリリットルチューブに組織を移す。 （以前に組織を含む）を1 mMのEDTA溶液は、陰窩および絨毛の混合物が含まれます。それはしばしば絨毛の高い割合が含まれているので、この画分は、オルガノイドの播種に適していない。 </li><li>チューブローラー上で4℃で1時間、さらに組織をインキュベートする。 </li><li>激しくチューブを振るときれいな50mlチューブ内の溶液を収集します。光学顕微鏡で50μl中陰窩をカウントすることで、 たとえば 、陰窩の存在を確認し、数を推定。 50-100陰窩を得るために必要な体積を計算し、1.5ml tにそれを転送するUBE。 </li><li> 5分間300×gでスピン。 、上清を捨て、予め温めておいた24ウェルプレート中の基底行列50μlのペレット、および種子を懸濁します。地下マトリックスが重合ので5〜15分間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li><li> 500μlのENR培地でオーバーレイ（ 表1参照）。オルガノイドを播種した後の約24時間後には、小さな丸い嚢胞の形を示し、構造が見えるようになる新進さらに2〜3日後になります。 3日ごとに新鮮なENRメディアに変更します。 </li><li>通過は7日ごとに文化をオルガノイド。 </li></ol></li><li>継代およびメンテナンスオルガノイド<ol><li>約7日ごとに、死んだ細胞で満たされたルーメンになるように5：3または1：3日おきにメディアをリフレッシュし、通路1によるオルガノイドを維持します。 </li><li> 1ミリリットルピペットマンチップを用いて媒体と地下行列ドームを破壊し、1.5mlチューブによくからそれを転送します。 </li><li>機械的にピペッティングAを介してオルガノイドを解離pproximately 50倍細かい（ 例えば 、200μlの）チップを用いて。 </li><li> 5分間300×gでスピン。 </li><li>上澄みを捨て、地下マトリックスの150〜250μlのペレットを再懸濁します。予め温め、24ウェルプレートにおける種子（地下行列/ウェルを50μl）。コー​​ティングするために一度地下行列を上下先端部の壁にピペットを播種する前に。ピペットでゆっくりと広がる基底行列を防ぐためにウェルの中央に気泡やシードを回避する。これは、ウェルの中央に基底行列のドームを得ることが望まれる。 </li><li>基底行列が重合よう5-15分間組織培養インキュベーター中でインキュベートする。ウェルあたり500μlのENRメディアとのオーバーレイ。 </li></ol></li></ol> 3プリ感染SIオルガノイドの治療注： 図1は、形質導入手順を示す。 <ol><li> ENRWntNicへの交換ENR培地（ 表1参照）とtでオルガノイドを育てる3日以上または、彼らは嚢胞の形態を採用しているまで、彼のメディア。ニコチンアミド（NIC）が培養効率を向上させながら、Wnt3aは、幹やパネート細胞の数が増加します。 </li></ol> 4。ウイルス産生<ol><li>プラチナ-E細胞の一つの150mmの皿は、感染ごとに必要とされる。シード約5×10 6ピューロマイシンの存在下で15〜18ミリリットルの培地（DMEM + 10％FBS）を有する細胞（1μg/ ml）およびブラストサイジン（10μg/ ml）を。これらは70〜80％のコンフルエンシーに達したときに、2〜3日後に細胞をトランスフェ。ピューロなしで+ 10％FBSのDMEMに培地を変更し、トランスフェクション前にブラストサイ。 </li><li> OPTI-MEMの1ミリリットルを含むチューブを分離するポリエチレンイミン（PEI）のレトロウイルスDNA構築30μgの240を添加する。混合し、5分間室温でインキュベートする。 </li><li>二つの溶液をプールし、20〜30分間室温でインキュベートする。プラチナ-E細胞の培地への完全な混合物を追加し、慎重にPLATを振るeは、DNA-PEI複合体の均等な分布を確保する。 </li><li>一晩のトランスフェクション混合物とプラチナ-E細胞をインキュベートし、翌日培地をリフレッシュ。 2日間新しい培地中の細胞を保管してください。 </li><li> 、50mlのFalconチューブ内の培地のみを収集して12〜16時間、4℃で8,000×gで0.45μmのフィルターと遠心分離機を介して渡します。上澄みを捨て、形質導入培地250μlの中にペレットを再懸濁し（ 表1参照）。 </li></ol> 5。オルガノイドフラグメント準備<ol><li> 1感染のため、24ウェルプレートからの1つのウェルが必要とされている。 1ミリリットルピペットマンチップを用いて媒体と地下行列ドームを破壊し、1.5mlチューブに移す。 </li><li>機械的にピペッティング（30-50x）を介してオルガノイドを破壊するために細かいボリュームチップ（ 例えば 、200μlのチップ）を使用します。解決策は、曇っになり、全く全体オルガノイドは表示されません。 </li><li>室温で5分間、900×gでの遠心分離<html> 。 </li><li>上清を捨て、細胞培養グレードの組換えプロテアーゼ（ 例えば 、のTrypLE）500μlにペレットを再懸濁します。 5分間37℃でインキュベートする。インキュベーションに続いてフラグメント当たりの細胞数をカウントし、光学顕微鏡を用いてオルガノイド断片のサイズを確認。 5-10細胞を含有するフラグメントが理想的です。断片の大部分は細胞のより高い数を含む場合、インキュベーション時間は、一度に2分することにより増加させることができる。 </li><li> ENR培地500μlを添加することにより、解離プロセスを終了します。 </li><li>室温で遠心し、5分間900×gで。上清を除去し、氷や4℃でペレットを保持します。 </li></ol> 6。レトロウイルス形質導入<ol><li> 48ウェルプレートの1ウェル中（セクション4.5からの）レトロウイルス溶液を250μlのオルガノイドの断片を結合します。 1ミリリットルピペットマンチップを用いてゆっくりとピペッティングにより穏やかに混合します。 </li><li>パラフィルムでプレートを密封。 </li></ol>E &quot;&gt; 7。ピノキュレーションとメッキ<ol><li> 1時間、32℃、600×gでプレートを遠心。慎重にパラフィルムを除去し、6時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 </li></ol>感染オルガノイドフラグメントの8播種<ol><li> 1.5mlチューブによくから感染オルガノイド断片及び伝達メディアを転送し、5分間900×gでスピン。 </li><li>上澄みを捨て、冷却するために氷上で5分間ペレットを含むチューブを置く。地下マトリックスを100μlを加え、上下にゆっくりピペッティングすることによりペレットを再懸濁します。 </li><li>新しい24ウェルプレートに50μlの「ミックス-cell地下マトリックス」の種子落下。地下の行列が固化するまで5〜15分間、37℃でプレートをインキュベートする。 </li><li>ウェルにポリブレンなしに伝達メディアを追加し、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。 2〜3日おきにメディアを変更します。 </li></ol> 9。選択<ol><li>スタートSEメディアへのピューロ（を1μg/ ml）を添加することにより、2〜3日後にlection。 </li><li>フラグメントが形成オルガノイドピューロ（1μg/ ml）を補充したENRメディアに伝達メディアを交換し始めています。 </li></ol> 10感染後のSIオルガノイドの治療<ol><li>文化 &quot;は継代およびオルガノイドの維持&quot;プロトコル（セクション2.2.1）に従ってオルガノイド形質導入。 1〜2週間後のSIオルガノイドは、出芽の構造を取り戻すでしょう。 </li><li>出芽構造の出現に続いて1μMの作用濃度で4 - ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）を加えることによってmiRNA又はcDNAの発現を誘導する。このステップはAddgene（のpMSCV-のloxP-DsRedを - のloxP-EGFP-ピューロ-WPRE（32702）のpMSCV-のloxP-DsRedを - のloxP-3xHA-ピューロ-WPRE（32703）、およびのpMSCVからのレトロウイルスベクターを用いた場合にのみ有効であることに注意してください-FLIP-ピューロ-DsRedを-GFP-miRNAは（32704））とのCre-ERT2を表現オルガノイド。 </li></ol>感染およびexprの11の確認目的の遺伝子のession /抑制<ol><li> Addgene（32702、32703および32704）からのレトロウイルスベクターを使用している場合は形質導入効率は、DsRedの発現を観察することにより確認することができる。クーら 4に例示するようにさらに、目的の遺伝子の発現または抑制は、GFPまたは（遺伝子過剰発現用）3xHAエピトープおよび定量PCR（遺伝子ノックダウンのための）を使用して、ウエスタンブロットによって確認することができる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures.">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li><li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids.">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871 (2013).</li><li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo.">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling.">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li><li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors.">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose. The authors have no conflict of interest declared.

<html>高い形質導入効率を達成するために特定の側面は重要である。彼らは丸い嚢胞形状を採用するまで、一つはENRWntNicメディアとのオルガノイドの前処理である。これは、幹細胞の数とそれによって導入遺伝子の安定な組み込みを得る、ならびに形質導入​​手順を通じてSIのオルガノイドの生存率を増加させる機会を増大させる。別のパラメータは、スピノキュレーション以下のインキュベーション時間である。貧弱な形質導入効率およびオルガノイドの貧しい生存率の短すぎたり長すぎインキュベーションの結果であった。それは有意に形質導入​​オルガノイドの割合を増加させるが、スピノキュレーション工程は必須ではない。最後に、高力価のウイルスは、正常形質導入するためのキーである。これは、パッケージング細胞株およびウイルスの種類に依存する。プラチナ-E細胞株およびマウス幹細胞ウイルス（MSCV）の組み合わせは、オルガノイドの形質導入のための十分に高い力価を産生することが見出された。 ve_content &quot;&gt;以下は、成功した形質導入を達成することに役立つトラブルシューティングのためのヒントを紹介します。パッケージング細胞株のトランスフェクションが悪い場合、最初に細胞の密集度が70〜80％の間とのインキュベーション時間に確認してくださいプールされたPEI-DNA混合物を20〜30分の間にある。形質導入の際オルガノイドの生存は非常にフラグメントサイズに依存します。長すぎるトリプシン処理フラグメントの大半が3未満の細胞からなるさせ、それによってオルガノイド生存性を減少させます。もう一つの要因であるのWnt馴化培地の活性は、活性が低すぎる5μMの作業濃度にCHIR99021の添加を介して昇圧された場合は、生存率を増加させることができる。CHIR99021が増加Wntシグナル伝達をもたらす、GSK3を阻害し、さらに、Y-27362、これを防止オルガノイドが形質導入前にフラグメント（1-10個の細胞を含む）に破壊されているのでアノイキスは、オルガノイドバイバを向上させるために形質導入​​培地に添加されている。のよう60;スピノキュレーション後のインキュベーション時間が6時間を超えるべきではない、上記の。貧しい形質導入が認められた場合最後に、ウイルス力価及びレトロウイルスベクターインサートのサイズ制限に影響を与える前述の要因を考慮すべきである。ノックダウンの効率は、miRNAに大きく依存する。効率は、標的遺伝子とmiRNAの組み合わせに応じて変化するので、それが最も効果を発揮するものを同定するために効率スクリーニングを行う価値がある。 技術はオルガノイドシステムの上皮現象に限定されています。将来的には、それぞれ、免疫系に由来する成分と、病原体または再構成の共培養を介して感染性または免疫媒介性疾患を研究することが可能かもしれない。さらに、レトロウイルスは、比較的小さいサイズの挿入物を運ぶことができる。したがって、天然に存在する調節領域は除外されなければならないので、導入遺伝子の発現は、それを模倣することができない内因性遺伝子。上述したように、ノックダウン効率は、標的遺伝子およびmiRNAに依存している。適切なノックダウン効率とのmiRNAが見つからない場合には、その特定の標的遺伝子のための技術の使用を制限することができる。 理論的には、オルガノイドは、細胞株に使用されるすべての標準化された操作的な技術と互換性があります。レトロウイルス形質導入は、4に報告された最初の方法であったが、近年、BAC（細菌人工染色体）-transgenesis 5利用可能になった。 2〜3週間の総発電時間で、パッケージング細胞株へのウイルスプラスミドのトランスフェクション後に、トランスジェニック（TG）マウスの世代よりもかなり高速である。幹細胞ならびに腸上皮のすべての分化した細胞系統を含むながら、in vivoでの陰窩-絨毛アーキテクチャを維持することにより、オルガノイド培養系は、TG動物および以前に使用した細胞培養の間のギャップを埋める。 <pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt;プロトコルは、ここで説明するゲイン-と機能の研究の無損失を通じてin vitroで内胚葉上皮の表現型の解析を実行するための方法を提供する。これはtgマウスの最小限の必要性と、成体幹細胞生物学の生理学的に関連する問題に対処することが可能になります。例えば、条件付きノックアウトマウスの生成は周産期致死6新生児の変異体から誘導されるオルガノイドを使用することによって回避することができる。さらに、この技術は、追加のノックダウン7,8を行うことにより、パラログの役割を研究するために以前に確立されたノックアウトマウス由来のオルガノイドに適用することができる。 小腸オルガノイドの確立に続いて、元の培養プロトコルの適合は、膵臓、肝臓、大腸、胃上皮9-11の培養を可能にした。さらに、ヒトの腸オルガノイド及び腫瘍オルガノイドは、一次アデン、正常なヒトの生検に由来しているOMAおよび大腸癌生検10。ウイルス感染プロトコルを容易オルガノイドこれらのタイプに拡張し、ヒト由来の組織において機能的研究を行うの前例のない方法を提供することができる。 まとめると、小腸オルガノイドのレトロウイルス形質導入は、幹細胞の維持、分化、および細胞運命決定、ならびに細胞シグナル伝達および細胞 - 細胞相互作用を調べるための貴重な資源である。

ハイスループット機能遺伝学は、現在の基礎科学と医学を改善するために、身体の私たちの生物学的理解を高めるために必要とされる。マウス遺伝学、それは時間がかかり、コスト高でもあるが、in vivoでの遺伝子機能を調べるためのゴールドスタンダードとなっている。安価でありながら細胞株は、他の一般的な選択で、より高いスループット能力を有する。しかしながら、それらがインビボで見られる適切な微小環境、それにより生理学的応答を再現することができないことによって妨害されているため、コスト/時間効率の高スループット分析しばらくが容易なハンドルモデル系のための明白な必要性があるin vivoでのトランスジェニック（TG）マウスの実験で観察生理学的応答を模倣する。 内胚葉上皮そのようなモデル系では2009年1で登場しました。LGR5陽性腸管幹細胞の発見から得られた知識の中にあった幹細胞の維持に必要な細胞外マトリックスおよび成長因子に対応するニッチについての情報。この情報を利用することもオルガノイド2としても知られている「ミニ勇気を」確立することが可能になりました。最近オルガノイドが「enteroids」と呼ばれているインビトロ培養のためのコンセンサス命名法は、3示唆された。細胞株と同様に、オルガノイドは拡大を続けるとのリガンドおよび阻害剤で処理するのは簡単です。しかし、代わりに二次元であることから、それらは三次元自己組織化陰窩 - 絨毛組織を保持する構造体ならびに幹細胞および小腸（SI）の分化した細胞系統である。オルガノイドは、管腔領域を囲む上皮細胞の単層から成る。突出出芽構造は幹細胞区画を含む小腸の陰窩に相当する。前駆細胞は、それらマイルのように分化する出芽構造の先端から始まる最終分化細胞が内腔に流されている上皮内層に向かってすりおろす。細胞株と比較して、このエキソビボシステムは、より密接に正常な生理機能を再現し、したがって小腸上皮のための有望なモデル系である。 レトロウイルス形質導入のこのビデオプロトコルでは、この新規オルガノイド培養系でex vivo遺伝子機能研究を可能にする方法を提示する。私たちは、ステップ·バイ·ステップ方式でオルガノイド文化を記述することで起動し、導入手順が続くレトロウイルスの生成を実証することによって継続する。最後に、トラブルシューティングのための追加的なアドバイスをする部分があります。この技術の利点は、それが腸上皮に恒常性、細胞運命決定および細胞 - 細胞相互作用を研究するために、ライブイメージング又は薬物スクリーニングと組み合わせることができることである。それらの単純な構造と高速回転率に、オルガノイドは、理想的なモデルSを表す成体幹細胞生物学を研究するためのテム。さらに、レトロウイルス形質導入は、予め確立されたトランスジェニックマウスおよびヒト患者試料由来するオルガノイドに適用することができる。ノックイン及びノックアウトアプローチはヒトに拡張することはできませんように、ヒトのSIオルガノイドは、魅力的な代替を構成している。 要約すると、レトロウイルス形質導入による遺伝子操作が人間由来の組織での研究のための新たな道を開いている間に、それによって、マウスの遺伝学および細胞株を補完する、マウスまたはヒト組織サンプルから得られた小腸オルガノイドにおける表現型分析を可能にする。レトロウイルス形質導入はゲイン-可能にし、機能喪失研究は、オルガノイド培養系4で実行される。これは、リデュース（削減、洗練、および置換）に従ってながら、遺伝子の機能、成体幹細胞生物学および疾患を調べるための貴重な資源となる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1090">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">Advanced DMEM/F12&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12634-034</td>
			<td style="width:595px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Glutamax 100x&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">35050-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Hepes 1M&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin- Streptomycin 100x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">B27 supplement 50x</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">N2 supplement 100x&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">n-Acetylcysteine 500 mM&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse EGF 500 &#181;g/ml</td>
			<td>Invitrogen Biosource</td>
			<td>PMG8043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Noggin 100 &#181;g/ml&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">R-Spondin conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from HEK293 cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Wnt conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The conditioned media is generated&#160; from L cells, for details see Sato and Clevers 2013</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Nicotinamide 1 M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 10 &#181;M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polybrene 8 &#181;g/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9268-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">Standard BD Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356231</td>
			<td style="width:595px;">Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02 ) 
			supplied by AMSBIO can be used as an alterntive.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:220px;">24 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>662960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">48 well plate</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>677980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">CHIR99021</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3734-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Platinum- E cells</td>
			<td>Cell biolabs</td>
			<td>RV-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Blasticidin</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A1113902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Polyethyleneimine (PEI)</td>
			<td style="width:157px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">23966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">TrypLE</td>
			<td style="width:157px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">Parafilm</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:220px;">4-OHT</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H7904</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture

本質的な成長は、EGF、ノギン、およびインビトロで原発3D上皮構造の拡大を続ける文化に私たちを可能にする、R-スポンジンを要因とLGR5陽性幹細胞は補うことができる。どちらもオルガノイドと呼ばれるこれらの「ミニ·ガッツ」のアーキテクチャと生理学的特性は、密接にそれらのインビボの対応に似ている。これは、彼ら小腸上皮のための魅力的なモデル系になります。レトロウイルス形質導入を用いて、機能的な遺伝学は、現在、条件付き遺伝子の過剰発現またはノックダウンすることにより行うことができる。このビデオでは、オルガノイド文化、レトロウイルスの生成、およびin vitroでの小腸上皮の表現型分析を支援するオルガノイドのレトロウイルス形質導入の手順を示しています。レトロウイルス媒介性の遺伝子発現と組み合わせたこの小説器官型モデルシステムは、costlを必要とせずにin vitroでの遺伝子機能の迅速な分析のための貴重なツールを提供していますトランスジェニック動物のためのyおよび時間のかかる世代。

オルガノイドは、中央管腔が原因死細胞（ 図2）の存在のために暗くされたときに分割される準備ができている。前処理オルガノイドの2〜3日後のラウンド嚢胞の形態（ 図3）を採用する必要があります。これは、安定した組み込みを得る機会を高めること、幹細胞の数を増加させる。ウイルスペレットのサイズに起因ペレットサイズの細胞破片の変化の寄与に、ウイルス上清の遠心分離後の最も可能性を変化させることができる。形質導入効率に明確な相関関係が観察されていない。安定な組込みを有するものが残りますしながら、選択手順非形質導入オルガノイド中に、死んでしまう。 MSCV-eGFPのレトロウイルスからの蛍光タンパク質は、形質導入（ 図4）は、次の2〜3日以内に、嚢胞性形態を有するオルガノイドを、生き残っ由来の細胞で観察することができる。 <img alt<html> =「図1」のfo：コンテンツ幅= &quot;6インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg&quot;幅= &quot;600&quot; /&gt; 図1。レトロウイルス形質導入手順の概略図。前に感染オルガノイドへは、前処理された彼らは、嚢胞性構造（ステップ1）を採用するまでENRWntNicを使用している。白金-E細胞は、パッケージング細胞株として用いられ、それらは70〜80％コンフルエントに達するまで培養する。その後、それらは、PEIを用いてレトロウイルス構築物でトランスフェクトする。ウイルスは、2日後（ステップ2）収穫する。オルガノイドは、1〜10細胞（ステップ3）を含有する断片を得るためにトリプシン処理され、次いで（ステップ4）を感染させる。感染効率（ステップ5）を大きくするピノキュレーションに続いて、感染したオルガノイド断片が播種される（ステップ6）、2-3日後に安定した統合を陽性クローンの選択を行うことができる（ステップ7）。 1765fig2highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図2文化の4-6日後のオルガノイドの代表的なイメージが。ルーメンは、それが暗く見えること、死細胞で満たされている。この段階でオルガノイドを継代する準備ができました。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" /> 3〜4日間ENRWntNic培地で培養小腸オルガノイドの図3。代表画像。オルガノイドは、嚢胞の形態を採用しています。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" /> ウイルス性導入遺伝子発現（B、eGFPの）を示して小腸オルガノイドの図4。代表的なイメージは、（a）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> ADVANCED DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> 4週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>グルタマックス100倍</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>ヘペス1Mの</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質100X </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2"> ENRWntNic培地（20ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2"> 2週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 +++ </td><td> 7.2ミリリットル</td></tr><tr><td> B27サプリメント（50×） </td><td> 400μlの</td></tr><tr><td> N2サプリメント（100×） </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td>のn-アセチルシステイン（500ミリモル） </td><td> 50μlの</td></tr><tr><td>マウスEGF（500μg/ ml）を</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td>マウスノギン（100μg/ ml）を</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td> R-スポンジンコンディットionedメディア</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td>のWnt3a馴化培地</td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td>ニコチンアミド（1 M） </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td colspan="2"> 伝達媒体（20ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2">新鮮な準備</td></tr><tr><td> ENRWntNicメディア</td><td> 20ミリリットル</td></tr><tr><td> Y-27632（10μM） </td><td> 20μlの</td></tr><tr><td>ポリブレン（8μg/ ml）を</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td colspan="2"> ENR培地（20ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2"> 4週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>高度なDMEM / F12 +++ </td><td> 17.4ミリリットル</td></tr><tr><td> B27サプリメント（50×） </td><td> 400μlの</td></tr><tr><td> N2サプリメント（100×） </td><td> 200μlの</td></tr><tr><td>のn-アセチルシステイン（500ミリモル） </td><td> 50μlの</TD&gt; </tr><tr><td>マウスEGF（500μg/ ml）を</td><td> 2μlの</td></tr><tr><td>マウスノギン（100μg/ ml）を</td><td> 20μlの</td></tr><tr><td> R-スポンジン馴化培地</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td colspan="2"> プラチナ-E細胞のための培地（500ミリリットル用） </td></tr><tr><td colspan="2"> 12週間、4℃で保存</td></tr><tr><td>のDMEM </td><td> 449.45ミリリットル</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> 50ミリリットル</td></tr><tr><td>ピューロ（1μg/ ml）を</td><td> 50μlの</td></tr><tr><td>ブラストサイ（10μg/ ml）を</td><td> 500μlの</td></tr></tbody></table> プラチナ-E細胞のための高度なDMEM / F12 +++、ENRWntNicメディア、トランスダクション培地、ENR媒体及び媒体のため、表1のメディア組成物。

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A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

このプロトコルは、一次LGR5-高い正のオルガノイド文化やレトロウイルス形質導入のその後のパフォーマンスを説明しています。これは配信の導入遺伝子のCre誘導性過剰発現またはノックダウンを可能にし、機能的研究は、in vitro器官における新規で行うことができるようになり モデル系。

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.5K ビュー.  University of Cambridge. このプロトコルは、一次LGR5-高い正のオルガノイド文化やレトロウイルス形質導入のその後のパフォーマンスを説明しています。これは配信の導入遺伝子のCre誘導性過剰発現またはノックダウンを可能にし、機能的研究は、in vitro器官における新規で行うことができるようになり モデル系。 

ビデオ: A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

デング熱蚊の感染症（A.ネッタイシマカ）と感染症の表現型決定のためのプロトコル

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

生物学

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and composed of mature enterocytes, goblet cells and enteroendocrine cells; and crypts, residing proximal to the submucosa and the muscularis, harboring adult stem and progenitor cells and mature Paneth cells, as well as stromal and immune cells of the crypt microenvironment. Until the last few years, in vitro studies of small intestine was limited to cell lines derived from either benign or malignant tumors, and did not represent the physiology of normal intestinal epithelia and the influence of the microenvironment in which they reside. Here, we demonstrate a method adapted from Sato et al. (2009) for culturing primary mouse intestinal crypt organoids derived from C57BL/6 mice. In addition, we present the use of crypt organoid cultures to assay the crypt metabolic profile in real time by measurement of basal oxygen consumption, glycolytic rate, ATP production and respiratory capacity. Organoids maintain properties defined by their source and retain aspects of their metabolic adaptation reflected by oxygen consumption and extracellular acidification rates. Real time metabolic studies in this crypt organoid culture system are a powerful tool to study crypt organoid energy metabolism, and how it can be modulated by nutritional and pharmacological factors.

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Small intestinal crypt organoids cultured ex vivo provide a tissue culture system that recapitulates growth of crypts dependent on stem cells and their niche. We established a method to assay the metabolic profile in real time in primary mouse crypt organoids. We found organoids maintain physiological properties defined by their source.

における代謝プロファイルのリアルタイム分析<em&gt;エクスビボ</em&gt;マウス腸陰窩オルガノイド培養

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological substances or characterization of specific biological activities. However, due to the lack of universally applicable cell culture media and protocols, well described cell culture methods for marine organisms are still limited. Meanwhile, the commonly occurring microbial contamination and polytropic properties of marine invertebrate cells further impede the establishment of an effective cell culture strategy for marine invertebrates. Here, we describe an easy-to-handle method for culturing intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus; additionally, we provide an example of in vitro apoptosis induction and detection in primary cultured intestinal cells. Moreover, this experiment provides details about the appropriate culture medium and cell collection method. The described protocol is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea, and it can provide sufficient cells for multiple in vitro experimental applications. This technique would enable researchers to efficiently manipulate primary cell cultures from marine invertebrates and to facilitate the functional evaluation of targeted biological materials on cells.

This protocol provides an easy-to-handle method to culture the intestinal cells from sea cucumber Apostichopus japonicus and is compatible with a variety of widely available tissue samples from marine organisms including Echinodermata, Mollusca, and Crustacea.

ナマコ腸細胞の一次培養におけるアポトーシス誘導と検出

Primary cultured cells are used in a variety of scientific disciplines as exceptionally important tools for the functional evaluation of biological ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

オルガノイド由来の上皮単分子膜:腸管バリア機能のための臨床的に関連するインビトロモデル

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...