ほとんどの実験は、植民地化に焦点を当てて植物微生物の相互作用を研究しますが、私たちのプロトコルは、根の細菌のコロニー形成と維持の両方を見るように設計されています。実験は異なる細菌や植物に合わせて変更することができ、各24ウェルプレートで複数の細菌をテストすることさえできます。まず、標準のパンチングを使用してプラスチックメッシュのディスクを作成します。
ガラス容器にディスクを集め、ゆるく覆います。20分間のドライサイクルにセットしたオートクレーブを使用して滅菌します。炎滅菌されたピンセットを使用して、以前に調製した植物成長培地寒天プレートの表面全体に、1層に約40個の滅菌メッシュディスクを分配します。
2つの以前に殺菌された種子を各メッシュの中心に置きます。外科用テープでプレートを密封し、暗闇の中で摂氏4度で2〜6日間インキュベートして種子を春にします。その後、プレート寒天側を植物成長室に8〜10日間置き、摂氏21度で9時間の光と18°Cの暗さの15時間を使用して苗を発芽させ、成長させます。
滅菌24ウェルプレートの各ウェルに細菌増殖培地を1ミリリットル加えます。メッシュに埋め込まれた発芽した苗を転送するには、炎滅菌鉗子を使用して、2つの発芽した、等しいサイズ、損傷していない苗を含むメッシュを寒天プレートの上下に静かに剥がします。苗と一緒に1つのフロートを細菌増殖液の各ウェルに移し、根側を下にします。
次に、液体細菌増殖培地中の寒天プレート上で一晩増殖した細菌を再懸濁させる。各井戸に10マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、メディア専用の制御井戸を除き、井戸あたり100万個のコロニー形成細菌ユニットの最終濃度を得る。滅菌成長のためにプレートを密封するには、粘着面に触れることなく、慎重にプレート全体に気体透過性フィルムを押してください。
各ウェルが個別に密封されていることを確認するために、ウェルによって作られたリングの周りに圧力を適用します。次に、プラスチック製の蓋をガス透過性フィルムの上にぴったりと閉じます。220rpmに設定された軌道プレートシェーカー上の植物成長室にプレートを置き、苗を発芽させたのと同じ条件で18時間インキュベートします。
すべてのフロートを植物ですすいするには、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの無菌水を加えます。植物でプレートからガス透過性フィルムを取り除き、滅菌鉗子を使用して水でウェルにフロートを移し、攪拌することなく室温で10分間インキュベートします。次に、新しい24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの植物成長培地を充填します。
各ウェルに1つのメッシュを転送し、ガス透過シールで覆います。植物成長チャンバーで220rpmで軌道プレートシェーカーで72時間インキュベート。インキュベーション後、前に行ったように植物をすすいでください。
すすぐ後、メッシュの葉の下に炎で殺菌した鉗子をそっと置くことによって、メッシュから苗を取り除きます。茎を軽くつまみ、苗をメッシュから上下に動かし、根を壊さずに外します。植物の根から細菌を除去するには、各メッシュから苗を1ミリリットルの二重蒸留水を含む24ウェル超音波処理プレートの個々の井戸に移します。
原稿に記載されているように多面的なソニケーターを使用して、一度にプレート内のすべてのサンプルを超音波処理します。細菌を定量化するには、細菌増殖培地中の超音波処理されたサンプルの連続10倍希釈を行う。滅菌ガラスビーズを使用して広がり、個々のコロニーが数えられるまで細菌の最適な温度でインキュベートする。
無傷の植物の根を収集するには、フォースを使用してメッシュから苗を取り除きます。次に、各植物を顕微鏡スライドに移し、先端から引きずり出してスライドと一緒に撮影を下ろし、最良のイメージングのためにまっすぐな根を確保します。各サンプルに水または無菌植物成長培地を一滴加え、カバーリップとスライド間のインターフェースを水和します。
カバースリップの傾斜を避けるために、ガラスカバースリップを根冠のすぐ上とシュートリーフの下に置き、穏やかに押し下げます。次に、適切な励起/放出フィルタを使用して細菌を画像化し、細菌同士と植物根とを区別します。シュードモナス・シミアエは、天然蛍光細菌、シロイヌナズナタリアナ根をコロニー化し、植物成長培地への移入後根上に維持した。
根冠、中長、および先端はシュードモナスシミエのコロニー形成による蛍光を示す。無細菌陰性対照はコロニー形成を示さなかった。シロイナナナのシミアエを18時間の植民地化または72時間の維持後に定量化した場合、いずれの時点でも苗あたりのコロニー形成ユニットの総数は、異なる日に行われた生物学的複製全体にわたって良好な再現性を示した。
維持培地中で72時間後に苗1当たりのコロニー形成単位の数が増加したところ、コロニー形成後18時間の時点で観察された数と比較して、植物根上のコロニー形成菌の活性成長が維持段階で起こったことを示す。実験室の条件下で自然土壌で成長したシロイヌナズナから分離された細菌の3種を使用して、植物の根に複数の種の関連を監視した。彼らはコロニーの形態と色の違いのためにX-galを含むメディア上で明確に区別され、多種の共同培養でも、抗生物質を選択せずに各種の苗ごとにコロニー形成単位を数えることを可能にした。
これらの3種の細菌はすべてコロニー形成され、単独であれ細菌の共同培養であれ、根上で維持された。各種は、異なる生物学的および技術的複製にわたって類似した傾向を示し、このプロトコルは、各種の根元当たりの相対的または総コロニー形成ユニットの両方を測定するために使用できることを示した。単独で増殖した場合、個々の種は維持段階で豊富な量の大幅な増加を示さなかったが、結合されたコミュニティの根元当たりの全体的なコロニー形成単位は、共培養において増加し、これらの細菌が他の株のコロニー形成を禁止していないことを示している。
最も困難なステップは、メッシュディスクから無傷の植物を除去する必要があるステップです。忍耐強く、穏やかであることは、これを可能にします。細菌細胞が蛍光性である場合、サンプルをフローサイトメトリーで選別して、細胞の相対数を決定することができます。
