This work was supported by an Avenir/ATIP grant to Matteo Bonazzi and a Marie Curie CIG (N&#176; 293731) to Eric Martinez. The authors would like to thank Dr. Robert Heinzen for sharing C. burnetii strains, antibodies and tools, Virginie Georget and Sylvain DeRossi (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) for their technical assistance and data analysis.

<ol>
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Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566 (2013).</li><li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turning+a+tiger+into+a+house+cat:+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii..">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii..</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li><li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii.">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li><li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dot/Icm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages.">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li><li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium.">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li><li>Beare, P. a., Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

宿主/病原体相互作用の研究は、細菌感染症を理解し、感染症に対抗するための代替戦略を開発するために注目すべき方法であることが証明されています。しかし、別の細菌性病原体によって精緻化戦略の多様性のために、細菌の毒性因子および感染中に標的にされているホストのシグナル伝達経路の同定および特徴は、本当の挑戦を表します。これは重要な宿主/病原体相互作用のハブの大規模同定のための新たなアプローチの開発を求めています。革新的な、ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング技術の最近の開発は、細胞内細菌病原体15の研究に適合させることができる貴重なリソースを表します。ここでは、トランスポゾン突然変異誘発および蛍光ベースのアッセイを組み合わせたスクリーニング手法を開発するためのモデルとして、人獣共通細菌性病原体のQ熱リケッチアを使用しています。 ImportanTLY、このスクリーニング方法は、侵入複製し、感染した細胞内で永続化するために、この細菌によって開発された戦略のグローバルな概要を提供し、 コクシエラ細胞内サイクルの複数のステップを同時に監視することができます。 ここで説明するアプローチは、2つのよく確立された技術、トランスポゾン突然変異誘発し、正常細菌性病原体の研究に適用された蛍光に基づいたアッセイに基づいています。高スループット/高含量スクリーンのコンテキストでこれらの技術を組み合わせることで、私たちはイベントの非常に高い数（典型的には、細菌の変異15,000感染した細胞は、画像化され、分析される）を分析することによって、細菌の変異の数が多いの効果を評価することができます。これは、このような、自然に、高い変動の対象である宿主細胞と細胞内複製、細菌の侵入などのイベントの重要な統計的分析を提供します。これは、EP以外のその細胞株に注目することが重要ですithelialスクリーニングのこのタイプのために使用することができます。宿主細胞の細胞小器官を検出することが容易であるしかし、平らで大きな上皮細胞画像解析のために最適です。自動化された顕微鏡の大部分が自動的にプレートを大量に処理することができるので、同時にスクリーニングすることができる変異体の数に事実上制限はありません。病原体に応じて、ユーザー缶特権落射蛍光または共焦点顕微鏡を使用します。画像取得の時間は、主にウェルあたりと視野当たりの取得チャネル数、取得フィールドの数に、顕微鏡カメラの感度に依存することになります。ユーザーは、スクリーニングプロトコルを最適化するために、これらの要因を調整する方法を決めることができます。例として、点5.1で示される条件を使用して1つの96ウェルプレート/時間をイメージ。画像分析は、主に使用されるマシン（またはマシンのクラスタ）に依存します。我々は、12コア（2×3.06 GHzの6コア）、48ギガバイトのRAMのワークステーションを使用しています。このマシンはapproxiが必要です一枚の板から取得した画像を解析するmately 40分。 これらのアッセイを開発する際に考慮すべき重要な側面は、多数のサンプルの操作および処理を可能にする新規のセットアップ（または既存の最適化）のプロトコルです。典型的な例は、私たちは急速に非常に少量のサンプルから、各トランスポゾンの挿入部位を含むコクシエラ DNA断片を増幅し、配列することができ、単一のプライマーコロニーPCR法の開発です。我々の経験に基づいて、高忠実度ポリメラーゼを注意深く選択し、再現性のある結果を得るために試験されなければなりません。このアプローチの唯一の制限は、ほとんどの場合、処理されたサンプルの約30％が悪用可能でない、観察にPCRまたは配列決定の段階に起因するいずれかを非表示にすることができます。しかし、新しいコクシエラトランスポゾン突然変異体の単離が律速段階ではないことを考えると、これはrepreしません大きな問題を送りました。同様に、変異型株式の細菌濃度を定量化するための信頼性の高いアッセイの開発は、このアプローチのための鍵となっています。懸濁液中の凝集するコクシエラの傾向に起因して、光学密度の測定値を使用することはあったコクシエラの文化や、既存の代替の濃度定量PCR（定量PCR）を計算するためには適用されません。ここで、蛍光タグ化DNAの挿入剤の使用は、細菌の定量化を高速化。 このアプローチは、使用される病原体に応じて、いくつかの細胞内区画のための蛍光マーカーを発現する安定な細胞株の使用を利用することができます。もう一つの重要な側面は、フェノールレッドを欠く細胞培養培地の使用です。我々は、このpH指示薬は、自動化された蛍光リーダーに記録された信号を飽和赤と緑のスペクトルにまたがる自然蛍光を有していることを観察しました。 Tここで紹介する彼の戦略は、ランダムトランスポゾン突然変異誘発に依存しています。興味のある変異体のために、私たちは、サザンブロットおよびトランスポゾン挿入部位のPCR増幅を使用してユニークな入れ換えを検証（およびクローン）をお勧めします。 プロトコルセクションに記載された装置に加えて、ここに提示スクリーニングアプローチを使用して興味のチームは、データ収集、データ格納用のサーバと迅速な画像解析のためのワークステーションのためにリレーショナルデータベースのセットアップに非常に有利になります。 重要なことは、ここで説明する方法は、ランダム突然変異誘発法は、病原体のために存在する提供他の細胞内細菌性病原体の研究に適している、細胞株は、病原体に感染することができ、これは、感染の間に、特定の表現型を表示します。

新興、流行細菌コクシエラバーネッティは、Q熱、重度の健康と経済的影響1と衰弱インフルエンザ様人獣共通感染症の大規模な集団発生の原因です。 コクシエラの主な貯水池は、国内および農場の動物であり、それは米国の乳牛の90％以上がCを運ぶと推定されています2 バーネッティ 。人間は汚染されたエアロゾルの吸入によって感染している偶然の宿主です。ヒトQ熱は65％ に達し、1,3-死亡率、致命的な合併症を有していてもよい、いずれかの急性または慢性疾患として現れます。 1の感染量で- 10生物、 コクシエラが知られている最も感染性病原体であり、これは潜在的なバイオ兵器4として研究されてきました。オランダ（2007 - 2010）におけるQ熱の最近の爆発的な流行は、年間2,000人以上に182からエスカレートケースで、この病原体の深刻な毒性の例として立っ5。 コクシエラ感染の顕著な効率は、おそらく細胞をホストする独自の適応と合わせ、環境ストレスに対する抵抗性と関連しています。実際、 コクシエラは、いくつかの厳しい条件（乾燥、温度など ）に対して非常に抵抗性である代謝的に不活性小細胞変異体（SCV）の形で環境中に存在します。非食細胞の浸潤がコクシエラ接着 /浸潤のOmpA 7および未同定の受容体によって媒介されている間のSCVは、最大3インテグリン6βαのVを介して食細胞によって取り込まれます。取り込み後、 コクシエラは Rab5のとEEA1 8早期エンドソームマーカーに陽性、タイトフィットの液胞に存在します。細菌は代謝的に活性な大細胞変異体（小型商用車）に変換し、ドット/ ICMの4型分泌系（T4SS）9を活性化することにより、エンドソーム酸性化への対応します、 レジオネラ·ニューモフィラ 10のそれに非常に相同です。ドット/ ICMのエフェクターの分泌がコクシエラは細菌が繁栄し、積極的にアポトーシス11から感染細胞を保護することができるアクティブなリソソーム酵素を含む大きな、LAMP1陽性酸性コンパートメントを生成することができます。したがって、 コクシエラの細胞内周期は細菌エフェクター12のドット/ ICM-媒介転座によって制御されているが、宿主細胞の浸潤、細菌の複製および感染の普及に関与する微生物の要因はほとんどわかっていません。 宿主細胞内の1）内在化、2）細胞内複製、3）細胞から細胞への広がり：トランスポゾン突然変異誘発および蛍光ベースのアッセイを組み合わせることで、我々は、 コクシエラ感染の主なステップに関与する細菌の要因の同時同定のための公平なアプローチを開発しています、および4）持続。これまでに、我々は千メートルにわたってスクリーニングしコクシエラの病因7を調節する宿主-病原体相互作用への前例のない洞察力を提供してくれ500 コクシエラコード配列、でutations。注目すべきことに、このアプローチは、 コクシエラと細胞生物学の特徴を共有する他の細胞内病原体の研究に適用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td align="left">Citric acid</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C0759-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium citrate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S4641-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Potassium phosphate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>60218-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Magnesium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Calcium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Iron sulfate</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>F8633-250G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Sodium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>S9625-500G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">L-cysteine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C6852-25G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bacto Neopeptone</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>211681</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Casamino acids</td>
			<td align="left">BD (Beckton-Dickinson)</td>
			<td>223050</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Methyl-B-Cyclodextrin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>C4555-10G</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>61870-010</td>
			<td align="left">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">RPMI w/glutamax, without phenol red</td>
			<td align="left">Gibco</td>
			<td>32404-014</td>
			<td align="left">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fetal Bovine Serum</td>
			<td align="left">GE healthcare</td>
			<td>SH30071</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trypsin EDTA (0.25%)</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td align="left">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Saponin</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Ammonium chloride</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A9434</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Bovine Serum Albumine</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Electroporation cuvette 0.1 cm</td>
			<td align="left">Eurogentec</td>
			<td>ce0001-50</td>
			<td align="left">For Coxiella transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Trackmates screw top tubes with caps&#160;</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td>3741</td>
			<td align="left">2D barcoded screwcap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate with black walls and bottom&#160;</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655076</td>
			<td align="left">Flat dark bottom, for dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well microplate, &#65533;&#65533;clear, black walls</td>
			<td align="left">Greiner</td>
			<td>655090</td>
			<td align="left">Flat transparent bottom, for cell culture and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well PCR microplate</td>
			<td align="left">Biorad</td>
			<td>2239441</td>
			<td align="left">DNAse/RNAse free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">96-well plate, Deepwell</td>
			<td align="left">Labcon</td>
			<td>949481</td>
			<td align="left">For Coxiella mutants infections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">PicoGreen</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>P7581</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Triton X-100&#160;</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td align="left">For dsDNA quantitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Phusion High fidelity DNA Polymerase</td>
			<td align="left">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td align="left">For single primer colony PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Celltracker Red CMTPX</td>
			<td align="left">Life Technologies</td>
			<td>C34552</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Anti-LAMP1 antibody</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td align="left">For immunofluorescence staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Hoechst 33258</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td>L1418</td>
			<td align="left">For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Fluorescence microplate reader Infinite 200 Pro</td>
			<td align="left">Tecan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td align="left">Epifluorescence automated microscope Cellomics</td>
			<td align="left">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and multi-phenotypic high-content screening of coxiella burnetii transposon mutants

細菌性病原体による宿主細胞の浸潤およびコロニー形成が重要なホスト機能を破壊して操作することができる病原因子として定義された原核生物の多数のタンパク質、の活性に依存します。ホスト/病原体相互作用の研究は、細菌感染症を理解し、感染症に対抗する代替戦略を開発することが極めて重要です。このアプローチは、しかし、細菌の病原性決定因子の公正な、自動化された同定および特徴付けのための新たなハイスループットアッセイの開発を必要とします。ここでは、トランスポゾン突然変異誘発によりGFPタグ付き変異体ライブラリーを生成するための方法を説明し、ハイコンテントスクリーニングの開発には、複数のトランスポゾンに関連する表現型の同時同定のために接近します。私たちの作業モデルは、SEと関連している細胞内細菌性病原体のQ熱リケッチア 、人獣共通感染症のQ熱の病原体であり、その結果としての健康と経済的負担との発生をヴィア。この病原体の偏性細胞内性質は、最近まで、厳しくコクシエラのハイスループット/高含量のアプローチを実現するための理想的なモデルを作り、ホスト病原体の相互作用に関与する細菌因子の同定を妨げています。

トランスポゾン突然変異体を単離すると、単一プライマーコロニーPCRは、各変異体のためのトランスポゾン挿入部位を同定するための強固な、ハイスループット法です。このアプローチは、典型的なネストされたPCRプロトコルから派生が、ここでは単一のプライマーは、アニーリング温度（ 図1A）のストリンジェンシーに依存して鋳型DNAに特異的および/ ​​または非特異的にハイブリダイズします。典型的なPCR産物は、特異的であり、そのほとんどが、複数のDNA断片（ 図1B）から成ります。右トランスポゾンITRの上流、および増幅プライマーにより認識される配列の下流にアニールする異なる配列決定プライマーの使用は、配列決定工程（ 図1C）に対する特異性を提供します。配列解析のための自動化ソフトウェアは、トランスポゾン挿入（ 図1C）の正確な部位を提供するコクシエラゲノムに得られた配列を整列させます。すべてのトランスポゾン挿入は、その後、アンすることができますコクシエラゲノム （ 図1D）にotated。 各コクシエラ変異体が単離され、貯蔵またはスクリーニングのいずれかの前にACCM-2培地に無菌的に増幅される。2、16 ドット/ ICMコクシエラ遺伝子 （ 図2A）38のトランスポゾン変異体の例を示す図 。 コクシエラ突然変異体の生存率を評価するために、純粋な成長曲線を1.5（Figurie 2B）に記載の細菌濃度アッセイを、接種後7日間の細菌培養物をサンプリングして適用することによって得られます。増幅された変異体は、その後7日間三重96ウェルプレート中で、上皮細胞とインキュベートします。 GFPタグ化されて生成されたすべてのコクシエラ変異体は、細胞内の増殖曲線は各24時間、すべてのウェルのGFPの蛍光強度を測定した、時間の関数（ 図2C）として測定値をプロットしています。 INTR無細胞成長曲線は、 コクシエラゲノム内のすべてのトランスポゾン挿入に関連する表現型の定量的な分析を提供します。同じトランスポゾン突然変異体についての定性的な情報を追加するために、我々は、自動画像収集と分析のために選びました。七日感染後、プレートは、固定された4に記載のように免疫蛍光のために処理され、そのようなCellProfiler（ブロード研究所5.自動画像解析ソフトウェアに記載されるように自動化され、落射蛍光顕微鏡を用いて分析<a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ）、取得したチャネルを処理します独立セグメント（ 図3）の比較分析のためのオブジェクトを特定しました。これは、宿主細胞核、細胞輪郭、リソソームおよびコクシエラコロニー （ 図3上パネル）の同定および形態学的特徴付けを可能にします。細胞およびリソソームとコクシエラコロニーの相関identificatiを可能にします上と（正LAMP1、 図3左下のパネルである） コクシエラ含有液胞の具体的な形態学的分析。宿主細胞の輪郭とコクシエラコロニーを相関させること、感染細胞（ 図3下部の中央パネル）の同定および特定の形態学的分析を可能にします。最後に、4チャネルは、例示および品質管理の目的（ 図3右下のパネル）のためにマージされます。 自動画像解析から得られたデータは、「マルチ表現型の散布図」を得るために、互いに対してプロットすることができます。一例として、 図4Aにコクシエラコロニー （μM2）平均面積は、コクシエラ（複製表現型）の細胞内複製に影響を与える突然変異を同定するために、細胞当たりのコロニー数（ 図4A）に対してプロットされ、および/ ​​または宿主細胞に侵入する細菌の能力（INTERNAlization表現型）。統計解析は、軽度（-4 &lt;Zスコア≤-2）、重度（Zスコア≤-4）の表現型に対応し、得られた散布図内の領域を定義するために使用されました。変異体は、主に3つのクラスターで観察された：コクシエラの不良細胞内増殖をもたらした突然変異は、プロット（ 図4A、ピンクと赤のドット）の最も左の部分に分類しました。細胞内のコクシエラ内在に影響を与え突然変異がプロットの底部にグループ分けした（ 図4（a）は 、光とダークブルードット）、そして最後に、プロットの一番右の領域では、緑のドットは（非有意な表現型をもたらす変異に対応しますZスコア&gt; -2）。重要なのは、複製に失敗するが、それでも、宿主細胞に侵入することができる変異体は、細胞核（ 図4C、第二パネル）をホストするために、隣接する単一の細菌、または小さなコロニーとして、感染の7日後に検出されています。したがって、 コクシエラのサイズ」コロコロ国立環境研究所は「大幅に影響を受けることになりますが、感染した細胞の数は、WT コクシエラに感染した細胞と比較して変化しません。逆に、宿主細胞に侵入するコクシエラの能力に影響を与える変異は、コロニー/細胞の数の減少をもたらします。この数が大幅に1未満である場合には、平均して、感染した細胞の全体数の減少があることを示します。あるいは、 コクシエラコロニーの （ミクロン2）平均面積は、 コクシエラ （細胞傷害性表現型）の細胞傷害性を付与する突然変異を同定するために、感染（ 図4B）が生存した宿主細胞の数に対してプロットすることができます。上記のように、統計的分析は、軽度（-4 &lt;Zスコア≤-2）および重度（Zスコア≤-4）の表現型に対応する結果の散布図内の領域を定義するために使用されました。ほとんどの変異が大きく、宿主内細菌の複製に関係なく、細胞の生存に影響を及ぼさなかったスクリーニング細胞（ 図3B緑の点）。 37変異軽度影響を受けた宿主細胞の生存（ 図3B、光赤ドット）、および7の変異は、細胞の生存（ 図3B、暗赤色のドット）をホストするために特に有害でした。実験的なニーズに応じて、自動化された画像解析処理により得られた追加のパラメータは、他のチャートを導出するために使用することができることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> 図1：配列決定及びコクシエラトランスポゾン変異体の注釈（A）単一コロニーPCRプライマーは、トランスポゾン挿入の部位を含むDNA断片を増幅するために使用されます。増幅プライマー（アンプ）はアニール温度のストリンジェンシーに依存して特異的および非特異的プライマーの両方として使用されます。 （B）単一のプライマーコロニーPCRの典型的な結果。各をReacti上のトランスポゾン挿入部位を含むいくつかの可変サイズのフラグメントの数を生成します。他のいくつかは、ランダムに副産物低ストPCRサイクルのように増幅されます。 （C）トランスポゾン配列にハイブリダイズする配列決定プライマー（配列）の使用は、目的の断片の配列決定を可能にします。 （D）配列分析ソフトウェアは、細菌ゲノムのトランスポゾン挿入の自動アノテーションを可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> 図2：無菌とコクシエラトランスポゾン変異体の細胞内増殖（A）のパイロットの画面では、我々は、単離し、配列決定し、16コアグラムで38トランスポゾン突然変異体をスクリーニングしていますコクシエラドット/ ICMの分泌系のエンは（赤で示しました）。 （B）各トランスポゾン突然変異体の生存率を評価するために、それぞれの成長は無菌培地中で単離は、蛍光タグ化DNAの挿入剤を使用して、8日間にわたってモニタリングされます。 （C）それぞれの変異体は、その後、上皮細胞に感染するために使用されます。トランスポゾンは、GFPカセットを有しているように、細胞内の細菌の増殖を、マイクロプレートリーダーを使用して、 コクシエラ·レプリケーションに関連するGFP蛍光の変化を追跡することによって、感染の7日にわたって監視されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> 図3： コクシエラ感染の自動画像解析オート。落射蛍光顕微鏡をトリプリケート96ウェルプレートのウェルあたり画像21の位置に使用されて嵌合さ。画像解析ソフトセグメントは、定量および分析のために取得された各チャネル内のオブジェクト。すべての場合において、画像の境界に触れるのオブジェクトが除外されます。 （A）ヘキストチャネル（緑の円内）は、宿主細胞の核を識別するために使用されます。 （B）これらは（核の位置は青丸で囲まれている、細胞の輪郭が緑色である）をCy3チャネルでの宿主細胞の輪郭を識別するためのシードとして使用されます。 （C）のCy5チャネル（緑の円内）LAMP1陽性区画を識別するために使用されます。以前に同定された細胞の輪郭（赤）に含まれるオブジェクトのみが画像解析のために保持されています。 （D）GFPチャネルが（緑の円内） コクシエラコロニーを同定するために使用されます。 （E）LAMP1陽性コンパートメントとコクシエラコロニーの相関コクシエラの同定を可能にします</em&gt;含有液胞（CCVS）。以前に同定された細胞の輪郭（緑色）に含まれるオブジェクトのみが画像解析のために保持されています。 （F）は、細胞の輪郭とコクシエラコロニーの相関は、感染細胞（疑似カラー）の同定を可能にします。 4蛍光チャネルで取得した（G）画像（ コクシエラコロニー （緑）、宿主細胞の核（青）、宿主細胞原形質膜（灰色）、LAMP1陽性区画（赤）に対応する）はマージされ、例示および質のために使用されコントロール。スケールは10μmのバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> 図4：ホスト/病原体相互作用に関与コクシエラ因子の大規模同定イオン（A）は、 コクシエラコロニーの （ミクロン2）平均面積は、関心の複製および内在化の表現型を同定するために、細胞当たりのコロニーの相対数に対してプロットされています。緑の点は、Zスコア&gt; -2（有意ではない）により、WT コクシエラから逸脱した表現型を表します。ピンクと水色のドットが-2、-4（軽度の表現型）との間のZスコアで、それぞれ複製および内在化表現型を表します。赤とダークブルードットは、Zスコア≤-4（強い表現型）との表現型を表します。 コクシエラコロニーの （ミクロン2）（B）の平均面積は、トランスポゾン挿入に起因する細胞毒性効果を推定するために、感染の7日を生き延びた細胞（感染し、感染していない）の合計数に対してプロットしました。緑の点は、Zスコア&gt; -2（有意ではない）により、WT コクシエラから逸脱した表現型を表します。ピンクのドットは、細胞傷害性のpHを表します-2、-4（軽度の表現型）との間のZスコアとenotypes。レッドドットは、Zスコア≤-4（強い表現型）を用いて細胞傷害性表現型を表します。矢印はC.（C）に対応する小文字によって示される変異体複製、内在化および細胞傷害性表現型の代表的な画像を示します。全ての場合において、宿主細胞の核は赤色であり、 コクシエラコロニーは緑色です。スケールは50μmでバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Q熱リケッチアは人獣共通感染症のQ熱の責任偏性細胞内グラム陰性細菌です。ここでは、 コクシエラ蛍光トランスポゾン変異体の生成と同様に、得られた内部移行、複製、および細胞傷害性表現型の自動識別と分析のための方法を説明します。

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

9.7K ビュー.  Université Montpellier.  Q熱リケッチアは人獣共通感染症のQ熱の責任偏性細胞内グラム陰性細菌です。ここでは、 コクシエラ蛍光トランスポゾン変異体の生成と同様に、得られた内部移行、複製、および細胞傷害性表現型の自動識別と分析のための方法を説明します。 

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A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

分離するために遺伝学的スクリーニングトキソプラズマホストセル出口変異体

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

免疫・感染学

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

アルギン酸塩産生に関連する新規遺伝子の同定<em&gt;緑膿菌</em使用&gt;ミニ<em&gt; himar1</em&gt;マリナートランスポゾンによる突然変異誘発

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

によってエフェクター転効率を検査するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を適用<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;のsiRNAサイレンシング中

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness during infection of Golden Syrian hamsters. Tn-Seq combines random transposon mutagenesis with the power of high-throughput sequencing technology. Animals are challenged with a pool of transposon mutants (input pool), followed by harvesting of blood and tissues a few days later to identify and quantify the number of mutants in each organ (output pools). The output pools are compared to the input pool to evaluate the in vivo fitness of each mutant. This approach enables screening of a large pool of mutants in a limited number of animals. With minor modifications, this protocol can be performed with any animal model of leptospirosis, reservoir host models such as rats and acute infection models such as hamsters, as well as in vitro studies. Tn-Seq provides a powerful tool to screen for mutants with in vivo and in vitro fitness defects.

High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection

We describe here a technique that combines transposon mutagenesis with high-throughput sequencing to identify and quantify transposon leptospiral mutants in tissues after a challenge of hamsters. This protocol can be used to screen mutants for survival and dissemination in animals and can also be applied to in vitro studies.

レプトスピラトランスポゾン挿入変異体中に黄金シリアのハムスター感染の測定フィットネスにハイスループット並列配列

In this manuscript, we describe a transposon sequencing (Tn-Seq) technique to identify and quantify Leptospira interrogans mutants altered in fitness ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

発注済み、緑膿菌ひずみ PA14 トランスポゾン挿入変異体の非冗長ライブラリのレプリケーション

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...