この方法論は、生きている動物における血中単球の化学戦術活性を定量化し、貧しい食事が単球機能とその基礎メカニズムに及ぼす影響を研究することを可能にする。単球由来マクロファージは、単一細胞を含む様々なアプローチ、およびマウスモデルにおける血液単球部位の健康状態のスナップショットを提供するオミクス技術を用いて単離および分析することができる。今日の手順は、私の研究室の助教授であるヤング・ジュ・アーン博士と、私の研究室のポスドクであるルクシ・ワン博士によって行われます。
手順を開始する前に、消毒剤で細胞培養フードを洗浄し、成長因子減少した基基膜由来溶液を氷上で完全に解凍します。個々の無菌1ミリリットルの注射器に26本のゲージ針を装備し、針を氷の上に置きます。溶液が解凍されたら、化学誘引剤の有無にかかわらず補った500マイクロリットルの溶液を1ミリリットルのシリンジに装填する前に、基部膜由来溶液バイアルの上部をアルコール綿棒で拭き取ります。
次に、基体膜由来溶液から気泡を取り除き、シリンジを装填して均一なプラグ形成を確実にします。足指ピンチに対する応答の欠如を確認した後、MCP-1を1秒間に約100マイクロリットルで麻酔下マウスの右脇腹に加えることなく、基基膜由来溶液の全容をゆっくりと注入する。そして、動物の左脇腹にMCP-1を補った基膜由来溶液の全体500マイクロリットル。
注射後20~30秒後にシリンジを所定の位置に保持し、溶液の漏れを防ぎ、マウスを完全に回復するまで監視するウォーミングパッドにマウスを置く前に、単一の滑らかなゲルプラグを形成させます。注射の3日後、プラグ注入動物から後毛を取り除き、下胸部および上腰椎の周りの皮膚をつかむには鉗子を使用する。皮膚に2ミリメートルの長さの切開を行い、頸椎からコドル椎骨接合部の1センチメートル上にマウスの後ろの正中線に沿って切断します。
筋肉層から皮膚を分離し、ポリスチレンフォームプラットフォーム上の皮膚をピン留めします。次に、解剖顕微鏡の下で、基質膜由来ゲルプラグを含む繊維状カプセルを慎重に把握し、微細な鉗子を使用して繊維状カプセルを除去する。その後、プラグをきれいにするために細かいはさみを使用してください。
次に、洗浄された基質膜由来ゲルプラグを適切に標識し、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。チューブを再計量して、基質膜由来ゲルプラグの重量を計算します。基部膜由来ゲルプラグ消化の場合は、クリーンな微細なはさみを使用して、各マイクロ遠心管に基部膜由来ゲルプラグをミンチし、800マイクロリットルの変位をプラグに加えます。
プラグを破壊し、マイクロ遠心管を1分あたり1400回転のサーモミキサーに2時間摂氏37度で配置し、基体膜由来のゲルプラグを完全に溶解するために、最高速度で10秒間ボルテックスします。インキュベーションの終わりに、分離によりプラグ断片を2回沈下し、300マイクロリットルのPBS中でペレットを再懸濁する。各細胞懸濁液の50マイクロリットルを新しいマイクロ遠心チューブに移し、0.5マイクロリットルのカルシンで新しいチューブの細胞にラベルを付けます。
二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で10分間のインキュベーションを行った後、自動セルカウンター上の生きた緑色蛍光陽性および死んだ非蛍光細胞の数をカウントします。単一細胞のウェスタンブロット分析では、10センチメートルのシャーレの底に水分補給された単一細胞のウェスタンブロットチップに希釈された単一細胞懸濁液を1ミリリットル加えます。5~15分後、明視野顕微鏡下でチップを調べます。
マイクロウェルの約15〜20%は単一の細胞で占めるべきであり、ウェルの2%未満は2つ以上の細胞を含むべきである。チップが適切にロードされている場合は、皿を45度傾け、懸濁液バッファでチップを3回洗い、捕獲されていない細胞を取り除きます。最後の洗浄後、慎重にチップを単一のセル西洋の器具の電気泳動セルにロードし、ゲル側を上にして、単一細胞のウェスタンブロットチップ全体をリシスランニングバッファで覆います。
細胞のライシスを開始し、適切な実験パラメータに従って機器を実行します。ランの最後に、室温で洗浄ごとに新鮮な洗浄バッファーで2つの10分の洗浄でチップを洗い流します。2回目の洗浄後、目的の一次抗体溶液80マイクロリットルを抗体プローブチャンバーに加え、チップのゲル側を下に下げて、抗体溶液がチップ全体をウィックするようにします。
室温で2時間後、洗浄バッファーでチップを3回洗浄し、シェーカーで1回水で洗います。光から保護された室温で1時間適切な二次抗体をチップにインキュベートします。インキュベーションの終わりに、洗浄バッファーでチップを3回洗い、スライドスピナーでチップを回転させて残りの洗浄バッファーを取り除きます。
単一セルのウェスタンブロットチップを取り除くために、15ミリリットルのチューブラックを60°Cの水浴に入れ、ラックのわずか1センチメートル上に水を入れます。ヒュームフードには、40ミリリットルのストリッピングバッファーと320マイクロリットルのベータモルセプタエタノールをキャニスターに加えます。チップをキャニスターの中の10センチメートルのシャーレに入れ、キャニスターをパラフィルムで密封します。
その後、水浴中のチューブラックの中にキャニスターを置きます。90分後、チップを新しいシャーレに慎重に移し、洗浄バッファーでチップを1回短時間洗ってから、シャーカーで15分間洗浄するためにシャーレに新鮮な洗浄バッファーを15ミリリットル加えます。本代表的実験では、各プラグにリクルートされた細胞を、注射後1、3、および5日で数えた。
MCP-1装填されたプラグのセル数から車両搭載プラグのセル数を差し引くことにより、ケモ誘引剤に反応して特異的に採用された細胞数を算出した。5日間にわたってMCP-1特異的な採用と蓄積が観察され、注射後1日31,000細胞から1日あたり最大136,000細胞まで増加し、注射後5日後に増加した。その後、単一細胞のウェスタンブロット分析を使用して、関心のある特定の免疫細胞マーカーの発現に従って、基部膜由来のプラグに採用された異なる細胞タイプを同定した。
例えば、MCP-1に装填された基部膜由来ゲルプラグ内の単球の割合は1日目に低く、5日目に再び落下する前に3日目にピークを迎え、マクロファージ数は研究期間を通じて着実に増加した。MCP-1装填されたプラグの場合、単球と単球のマクロファージの割合は3日目で最も高く、3日後にMCP-1依存性の走気軸によって募集された細胞の大半が単球およびマクロファージであった。一般的に、単球とマクロファージの総数は3日目に比べて5日目に高くなりますが、3日目の細胞数は単球の白血軸およびリクルートの末梢血をより正確に反映するため、3日目は膜直接性差を分析することをお勧めします。
下流分析のための単一セルの取得に成功した場合、注入の精度とプラグの完全な除去に依存します。フローサイトメトリー、単一細胞のウェスタンブロッティング、バルク、または単一細胞RNAシーケンシングおよび他のオミクス手順は、募集された単球および単球由来マクロファージの特性およびフェノタイプを評価するために使用することができる。
