MDRと呼ぶシンプルで安価な方法により、パキテイン精子細胞の濃縮集団、円形精子、マウス精巣から精子を細長く分離することができます。MDR法の主な利点は、そのシンプルさです。ほとんどの生物医学研究所で利用可能な標準の実験装置のみが必要です。
MDRプロトコルは、男性生殖細胞の機能研究を行う研究者に最適です。例えば、精子形成を研究しているグループ、男性の生殖能力に影響を与える要因、ならびに父方のエピジェネティック遺伝。MDR法には最小限の出発材料が必要です。
実際、私たちは日常的に1つの成人男性マウスを使用してかなりの量の細胞を得ています。まず、必要な装置と試薬をセットアップします。水浴を摂氏37度に設定し、細胞培養インキュベーターを摂氏34度、炭酸ガス5%、湿度95%に設定します。
チューブローテーターをインキュベーターの内側に置きます。顕微鏡用ガラススライドの適切な量を準備し、ラベルを付け、次にグリースペンで直径約1センチメートルのリングを描き、グリースを乾燥させます。動物を解剖する準備ができたら、マウスの腹側腹部に70%エタノールをスプレーし、はさみを使用して腹骨盤腔にV字形を開きます。
鉗子で上官ジディマル脂肪パッドを引っ張り、精巣を見つけてハサミで取り除き、チュニカアルブギネアを邪魔しないようにします。1X KREBSを含む6センチメートルのペトリ皿に精巣を置きます。精巣をカプセル化し、チュニカアルブギネアを捨て、鉗子で軽くからかうことによって半尿細管をわずかに分散させる。
作りたてのコラゲターゼ溶液を2ミリリットル含む50ミリリットルの円錐形チューブに移します。37°Cの水浴で3分間尿細管をインキュベートし、揺らすことで穏やかに攪拌します。その後、暖かい1X KREBSの少なくとも40ミリリットルを追加し、室温で堆積物に尿細管を許可します。
上清を取り除き、もう一度洗い流しを繰り返します。25ミリリットルの作りたてのトリプシン溶液を加えます。細胞培養インキュベーター内の回転子にチューブを置き、15〜20分間放置し、約15rpmで回転させた。
散発的に尿細管をチェックします。溶液が曇りになり、小さな細管だけが残ったら、チューブを氷の上に置き、次のステップに進みます。40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して、氷の上の新しい50ミリリットルの円錐管に溶液をろ過します。
その後、600 x g で摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞をペレットします。上清を慎重に注ぎ、細胞ペレットをタップして、1X KREBSの残りの部分の細胞を再懸濁させます。再懸濁細胞に少なくとも40ミリリットルの冷たい1X KREBSを加え、遠心分離を繰り返す。
チューブをタップしてセルを再サスペンドします。その後、ピペットチップを1ミリリットルのピペットに取り付け、開口部の直径が約3ミリメートルになるようにカットします。KREBSで0.5%BSAの3ミリリットルまで追加します。
上下にピペットを作って細胞を再中断し、泡を避けるようにします。40マイクロメートルのストレーナーを通して細胞懸濁液をフィルターし、BSAの勾配の細胞をロードするためにすぐに進みます。グラデーションにセルをロードする前に、均質な単一セル懸濁液を取得する必要があります。
塊状細胞は、より速く沈み込み、勾配を破壊し、分画を汚染します。50ミリリットルのチューブを氷の上に垂直に設置し、チューブの片側を見ることを確認します。その後、10ミリリットル血清ピペットの先端から約5〜10ミリメートルを切断し、ピペットコントローラに取り付けます。
5%BSA溶液のピペット5ミリリットルを50ミリリットルチューブの底に入れた。ピペットのカットチップで5%溶液の表面を軽く触り、5%溶液の上に4%BSA溶液の5ミリリットルをゆっくりと重ねます。他の BSA ソリューションでこの手順を繰り返して、5% から 1%BSA の勾配を得ます。
レイヤー間にクリアラインが表示されます。その後、慎重にそれを邪魔することなく、勾配の上に単一のセルサスペンションをロードします。細胞は1時間半勾配を通って沈めます。
カットピペットチップを使用して、慎重に1ミリリットルの分率を別々の1.5ミリリットルチューブに収集し、氷の上に保存し、収集された順序でチューブに番号を付けます。胚芽細胞分率を摂氏4度で10分間600×gで遠心分離する。次にペレットを乱さないよう気を付け、上清の大部分を捨て、チューブをフリックして細胞を再懸濁します。
各チューブに氷冷1X KREBSバッファーを1ミリリットル加え、遠心分離を繰り返します。上清の大部分を捨て、約100マイクロリットルを残し、細胞ペレットを慎重に再懸濁する。細胞分画を分析するには、番号付き顕微鏡スライド上の各グリースペンリング内に4%パラホルムアルデヒドの20マイクロリットルをピペット処理します。
対応する分数から再懸濁細胞の2マイクロリットルを直ちに加える。その後、最低1時間は室温でスライドを乾燥させます。PBS でスライドを 1 回リンスし、DAPI 付きの取り付け媒体を使用してスライドを取り付けます。
蛍光顕微鏡下で各スライドを分析し、各分画でどの特定の生殖細胞タイプが濃縮されているかを推定します。各分画のサンプルを顕微鏡のために採取したら、各画分に氷冷1X KREBSを1ミリリットル加え、セルを摂氏4度で10分間600~13000xgで遠心分離します。上清を削除して破棄し、推奨されるダウンストリーム解析を続行します。
このプロトコルは、ラウンド精子を豊かにするために特にうまく機能します。90%を超える濃縮は、分数2、3および4で達成された。長い精子は勾配の上にとどまる傾向があり、最初の分数で収集された。
その大きなサイズのために、パキテネ精子細胞の堆積物はより速く、最後に採取された。濃縮は、分数14と15で約75%であった。大部分の分画から得られたRNAの合計は0.5~2.5マイクログラムで、下流RNA分析には十分でした。
各画分から得られたタンパク質の量は、典型的には20〜140マイクログラムの範囲であり、これはいくつかのウェスタンブロットに十分である。このプロトコルでは、単一の画分に由来するタンパク質ライセートの10%は、標準的なウェスタンブロット上のDDX4、PIWIL1およびPIWIL2タンパク質を明確に検出するのに十分であった。1画分のタンパク質量は、PIWIL1に対する抗体を用いた免疫沈降、および共免疫沈降PIWIL2の検出にも十分であった。
初めてのタイマーでも、このプロトコルは、細胞の前処理が良好であり、堆積中に勾配を乱すものは何もないようにする限り、非常にうまく機能します。単一のマウスから、高度に濃縮された細胞を得て、RT-PCR、RNAシーケンシング、免疫沈降法、ウェスタンブロッティングなどのさまざまな下流分析に使用できます。MDRは男性の生殖細胞を豊かにする唯一の方法ではありませんが、特殊な機器や広範なトレーニングを必要としないため、非常に便利なツールです。
