Name: isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin
Uploaded: 2016-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin at JoVE.com

This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.

この研究は健康のイスラエルの省の実験動物の管理と使用に関するガイドに記載勧告に厳密に従って行きました。動物のすべてが承認された制度的動物管理プロトコルイスラエル工科大学のIL-02302から2015に従って取り扱われました。 1.実験の準備<ol><li>キレート化されたウシ胎児血清の調製 注：カルシウムに対するこれらの細胞の露出を制御することが重要ですので、上皮細胞は、カルシウムに対して非常に敏感です。細胞は、単離プロセスキレート中カルシウムに暴露されないことを確実にするために、ウシ胎児血清は、染色バッファ29の調製のために使用されるから残留カルシウムを除去するために使用されます。以下のプロトコルは、準備FACS染色バッファーに必要なカルシウムを含まないウシ胎児血清の約1 Lを用意します。 <ol><li>ドライキレート材料、 例えばの400グラムを追加します。4リットルのビーカーに、キレックス、全量4 L.カバーを蒸留H 2 Oを添加し、マグネチックスターラーを用いて連続的に撹拌します。 </li><li>撹拌しながら10 N HCl溶液を用いてpHを7.4に調整します。 pHが20分以上のための安定したままになるまで20分間攪拌し続け、必要に応じてpHを再調整します。 </li><li>キレート物質がコンパクトペレットを形成できるようにするために、4℃で一晩ビーカーをインキュベートします。慎重にH 2 Oを吸引し、4 Lの全体積に新鮮な蒸留H 2 Oを追加</li><li>ステップ1.1.2のようにpH調整を繰り返します。 </li><li>コンパクトなペレットを形成するためのキレート材料を可能にするために、1時間4℃でビーカーを置きます。注意深く吸引H 2 O </li><li>ゆっくりキレート材料にウシ胎児血清の2 500ミリリットルのボトルを追加します。速度設定は、泡を生成しないことを確実に1時間4℃でゆっくり撹拌します。 </li><li> COMPを形成するためのキレート物質を可能にするために1時間4℃でビーカーを置きペレットを行動します。 </li><li>注意深く1Lのガラス製ボトルに血清を移し、無菌条件下でボトルトップフィルターを介して濾過します。 -20℃でキレート化された血清を保存するか、すぐに使用しています。 </li></ol></li><li>染色緩衝液の調製<ol><li> 2+ の Ca 2+およびMgを含まないPBSでFBSをキレート化し、3％の100ミリリットルを用意し、氷上に保ちます。 </li></ol></li></ol>大人の表皮からの毛包の2の単離<ol><li>インダクションボックスを用いて、5％イソフルランを用いてマウスを麻酔。ここで説明するプロトコルは、HFサイクルの休止期である50から80日齢のマウスを使用して最適化しました。 </li><li>標準的な実験手順に従ってマウスを安楽死させます。ここでは、安楽死のチャンバー内でCO 2過剰投与を使用して、マウスを安楽死させます。 </li><li>電気バリカンを使用して背部皮膚からすべての毛を剃ります。頭や手足を避けてください。皮膚にできるだけ近いバリカンを保管してください。皮膚や皮下層にダメージを与えることは避けてください。 </l私&gt; <li>すべての毛が除去されると、任意の髪の残留物を除去し、背部皮膚を消毒するために70％エタノールを使用します。 </li><li>解剖パッドの上にマウスを置き、使用する鉗子は、尾近くの皮膚を引き上げ、はさみを使って小さなニックを作ります。慎重に皮膚を切り欠いおよび筋膜からそれを分離することによって、後方、前方方向の全背部皮膚をカット。皮下層に損傷を与えないようにしてください。 </li><li> 、髪の面を下に解剖マットの上に皮を置き、所定の位置に固定するために、皮膚の二つの隣接エッジを突き止めます。ゆっくり真皮が明確かつ端正になるまで鈍メスを用いて、脂肪を削り取ります。 注意：脂肪を掻き落とすときは、肌に穏やかな圧力を適用するように湾曲した鉗子を使用しています。鉗子の湾曲した側面を使用して皮膚に圧力を適用します。これは、引き裂きから肌を防ぐことができます。 </li><li> 、真皮が100mm無菌培養皿に、ダウンサイド肌を置き、何の折り目がないことを確認するために皮膚をまっすぐ。カルシウムを含まないPBSの10ミリリットルを追加2+ </培養皿にし、必要に応じて皮膚を真っすぐ- SUP&gt;およびMg 2+（PBS）。 </li><li> PBSを吸引し、0.25％トリプシンの10ミリリットルを追加します。皮膚が展開され、自由に浮遊していることを確認してください。 0.25％トリプシンの10ミリリットルあたりの皮膚の一枚をインキュベートします。 </li><li> 30から120分間、または4℃で一晩、37℃でサンプルをインキュベートします。 </li></ol>毛包からの単一細胞懸濁液の調製<ol><li>後方方向に前方に湾曲鉗子やメスを用いて皮膚からすべての髪を、こすり。鉗子の湾曲した側面を使用して所定の位置に皮膚を持ち、髪を掻き取るメスを使用しています。 注：ステップ2.8で追加されたトリプシン溶液中に髪を削り取ります。尾でスタートし、髪の成長の方向に従ってください。髪の成長の方向に対してスクレイピングは、細胞収率の実質的なHFSの損失と減少します。 HFSは共にそれぞれに付着し、小さな凝集塊を形成する傾向があります。目を低減するためにHF塊のEサイズは、一度に小さな領域を削り取るしてみてください。 </li><li>新しい培養皿に毛のない皮膚を移し、10mlのPBSを追加-乾燥からそれを防ぐために。皮膚を点検し、残りの髪を掻き落とします。 </li><li>単一のHF懸濁液が得られるまでメスや鉗子を使用してHFSを打破します。積極的にすべての髪の塊を破壊するために数分間10ミリリットルピペットを用いてHF懸濁液を粉砕します。 注：氷の上で、次のすべての手順を実行します。 </li><li>前標識された50ミリリットルチューブにHF懸濁液を転送します。 </li><li> ;皮膚からとHFのサスペンションを含んでいた細胞培養皿を洗うためにそれを使用- PBSを吸引50mlのチューブに移します。 </li><li>洗浄<ol><li> 50mlのチューブに装着70μmのセルストレーナーを通過することによってサスペンションをフィルタリングします。 （ - FBSキレート化3％PBS）染色緩衝液10mlで最初の50ミリリットルチューブとストレーナーを洗ってください。 </li><li>渡すことによって、サスペンションをフィルタリング40μmのセルストレーナーを通して50mlのチューブに装着。すべての細胞が新しいチューブに転送されていることを確認するために、染色緩衝液5〜10 mlのチューブを洗浄します。すべての動物が処理されるまで氷上にサスペンションを保管してください。 </li><li> 4℃で300×gで15分間遠心分離します。慎重に染色緩衝液5mlにペレットを再懸濁ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。 </li><li> 4℃で5分間300×gで遠心します。注意深く上清を吸引し、染色緩衝液800μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。 注：上記の指定されたボリュームは、2つの成体マウス由来の細胞を染色するために十分です。 </li></ol></li><li>前標識されたFACSチューブにサスペンションを転送します。 <ol><li>コントロールチューブについて、細胞懸濁液（または細胞懸濁液からの任意の残留左）の25-50μLを取り、染色バッファーで300μlの総体積を作ります。 注：（未染色のための制御管（総容量300μl）を準備しない抗体はありませんなしDAPI）。のみDAPI;インテグリンβ1;インテグリンα6。 SCA-1; CD34。 </li></ol></li><li>適切なチューブに所望の濃度の一次抗体およびDAPIを（適切な希釈のための材料の表を参照）を追加します。静かに細胞懸濁液を混合するためにチューブをフリック。氷上に戻り、光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。 </li><li>氷上で30分間インキュベートし、穏やかに細胞を懸濁状態に維持されることを保証するためにチューブを10分ごとにフリック。 </li><li>染色緩衝液（チューブあたり約4ml）で、各FACSチューブを充填することにより細胞を洗浄。 4℃で300×gで5分間遠心します。 </li><li>注意深く上清を吸引し、染色緩衝液800μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>単一細胞懸濁液を確実にするために、セルストレーナーキャップでFACSチューブに細胞懸濁液を移します。 </li></ol> 4.フローサイトメトリー分析<ol><li> Signaのための適切なフィルタを用いて、フローサイトメーターを使用して、すぐに細胞選別に進んでくださいリットル検出。 （DAPIの測定用）405 nmの紫、（APCの励起用）と633nmの赤色のレーザー（FSC、SSC、PE、PE-Cy7のとFITCの測定用）488 nmの青を使用します 注：機器はすべての3つの蛍光チャネル用の検出器から記録されていることを確認。 </li><li>未染色試料および単一染色されたコントロールを使用して、スペクトルのオーバーラップの補償に基づいて設定された蛍​​光ゲート。 注：蛍光シグナルの任意の重複を排除するために、チャンネル間の補償を調整するための単一の染色されたコントロールを使用します。補償調整は使用FACSソーターに依存します。 </li><li>死細胞を排除するためにDAPIに基づいて、プライマリゲートを設定します。 </li><li>一重のイベントを選択するために散布図（FSC-A対SSC-A）を調整します。 </li><li>ダブレットのために排除し、一重イベントを識別するためにFSCとSSCの高さと幅のパラメータを設定します。 </li><li>高α6およびβ1発現を有するとCDのいずれかで、この集団のゲート細胞からのゲート細胞34高発現またはのSca1高発現。 </li><li>予め標識FACSチューブにソート細胞。 注：細胞の二つの一般的な集団を単離することができます。 α6+ /β1+ / CD34 + / SCA-1 -及びα6+ /β1+ / SCA-1 + / CD34 - 。それらは、細胞培養またはRNAの単離などの下流のアプリケーションが使用されるまで、選別された細胞は、常に氷上で維持されるべきです</li></ol>

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The authors have nothing to declare

ここで説明するプロトコルは、よく成体マウスの背部皮膚からHFSCsを単離するための確立されていますが、同じように、マーカー2,16,23,28,29の選択に基づいて、HF構造内の他の集団の単離のために適用することができます。特定の細胞型は、不均一な細胞集団の混合物から選択され、収穫することができるという点で、この方法は、組織解離、細胞単離の他の方法、上特に有利です。さ...

成体幹細胞（SCS）は、死細胞を置き換えることにより、組織の恒常性を維持し、けがの際に損傷した組織を修復するために不可欠です。これらのSCは、継続的な自己再生を受けると、様々な細胞系列1-3に分化する能力によって定義されます。その補充のための成人のSCに依存している最も研究システムは、造血系、腸及び皮膚1,2,4を含みます。 胚発生の間、皮膚は、表皮細胞の単層として始まります。間葉系細胞は、皮膚を移植し、下層のコラーゲン性真皮5を形成する場合、毛包（HF）の形態形成が開始されます。下向き6を成長し始める毛プラコードを形成するために、後に、真皮乳頭（DP）を構成する表皮層の直下に整理し、上皮を刺激する間葉系細胞を、専門に。高いHFの底部に位置するマトリックス細胞を、増殖、内層が毛幹（HS）と周囲の内毛根鞘（IRS）2,3を形成するために、同心円筒に分化し始める一方で、これらの間葉系細胞を包むと毛球を形成します。 毛包間表皮（IFE）、皮脂腺（SG）およびHF：出生後の生活の中で、皮膚の表皮には3つの区画で構成されています。恒常性の一定の状態にあるIFEとSGとは対照的に、HFは、持続的な成長のサイクル（成長期）、破壊（退行期）、残り（休止期）4,7を受ける動的なミニ臓器です。毛包幹細胞（HFSCs）、燃料、この永久サイクルは、バルジ4として知られているHF内に特殊なニッチに存在します。 HFSCsが膨らみを終了する成長期の間に、DPからの起動信号以下、増殖し始めると下向きの下降従って、外毛根鞘として知られている細胞の長い直線状の軌跡を作成する（ORS）8-10。マトリックス細胞、すなわちHF、急速サイクルの基部にDPを囲むので、HSとIRS 10（ 図1）を生成する最終分化を受けて上方へ移行します。成長期の持続時間は、毛髪の長さを決定し、マトリクスのセル6の増殖および分化能力に依存します。 HFが退行期に入ると、バルブ止めにおけるトランジット増幅マトリックス細胞は、増殖、アポトーシスを起こし、それがHF 8,11の非循環部に達するまで上方DPを引きながら完全に退行します。この後退の間、HFは退行期の特徴である上皮鎖として知られる一時的な構造を形成し、多くのアポトーシス細胞が含まれています。マウスでは、退行期は3-4間日間持続し、非常に最初の毛周期に同期されます。 HFは休止期に達すると、すべてのHFSCsが静止状態になります。 HFサイクルの異なる段階はまたメートルのため、マウスの皮膚の色の変化によって特徴付けられますelanin生産。退行期中の濃い灰色に成長期の間に黒から皮膚の変化は、休止期6,7,12,13の間にピンクに。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> 図1：毛包サイクル 。 HFは永久上部と急速な成長（成長期）、破壊（退行期）および相対的静穏期や休符（休止期）の連続的なサイクルを経る下絶えず改造、サイクリング部で構成されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">大きい方を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。</a> HFを維持するのSCは、最初だけSG 14の下方HFの恒久的な地域に住んでスローサイクリングラベル保持細胞（LRC）の人口を明らかにしたトリチウム化チミジンで、チェイス実験を用いて同定しました。 HFSCの進歩特徴付けは、HFのニッチ15からの特定のSCを同定および単離するために使用することができるマーカーの数が少ないことが明らかになりました。おそらくHFSCsの濃縮のための最良のマーカーは、CD34、また、ヒト16中の造血SCマーカーとして同定された細胞表面マーカーです。このCD34 +集団内の2つの異なる集団はまた、α6インテグリンの発現2に基づいて単離されています。他のマーカーは、CD34発現と共局在し、K15プロモーターは、標的化およびトランスジェニック動物15,17-19にHFSCsを単離するために使用され、ケラチン高いバルジ領域で発現される15（K15）です。過去10年間でHFSCsおよび前駆細胞の他のいくつかの異なる集団はまた、HF 17,20-27内に存在することが報告されています。 HFSCsの追加の刺激的な特徴は、皮膚修復への貢献です。通常の条件下ではHFSCsは、HFを補充し、IFEの恒常性に関与しません。ハウ版、創傷に応じて、これらの細胞はIFE 9を再増殖にそのSCのニッチや援助を終了します。我々は最近、マウスがプロアポトーシスSept4 / ARTS遺伝子の表示のために、アポトーシスに対する耐性を実証CD34、K15およびSox9を+ HFSCs、数の増加を削除することを実証しました。 HFSCsはSept4 / ARTSから単離した- / -背部皮は蛍光活性化細胞選別（FACS）を利用し、CD34 +およびK15 + HFSCsの数の2倍を超える増加がありました。これらのSept4 / ARTS - / - HFSCsが、 インビトロで拡大していなかっただけでそれ以上のコロニーを生じたが、対照28と比較しても過酷な条件に耐えることができました。 HFSCs数が増加した結果、Sept4 / ARTS - / -マウスは、皮膚切除損傷に応答して有意に速く治癒します。驚くべきことに、Sept4 / ARTS - / -マウスdisplayeダ創傷床から再生されたHFSの数が多い、とかなり小さい傷跡。さらに、XIAP（アポトーシスのX連鎖阻害剤）、ARTSの生化学的目標のために削除されたマウスは、治癒障害28を実証しました。 我々の結果と他の研究室で行われた作業はHFSCsは大人のSCの生物学と機能を研究するための理想的なモデルとして役立つことが示されています。ここでは、4つのマーカーの発現に基づいてHFSCsと表皮角化細胞の濃縮及び単離するための方法論について説明します。インテグリンα6。インテグリンβ1; SCA-1（表皮角化細胞のマーカー）およびCD34。 K15 + HFSCsの同様の分離はまた、K15-GFPレポーターマウス19を用いて行うことができます。

<table><tbody><tr><td>Isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Primal Critical Care</td><td>&amp;nbsp;66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Carbon dioxide</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Electro Shaver</td><td>Oster&amp;nbsp;</td><td>Golden A5</td><td>Shaver from any other company could be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Gadot Lab</td><td>830000051</td><td>96% ehtanol diluted with distilled water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dissection mat</td><td></td><td></td><td>Dissection tools from any provider can be used</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td>Foreceps from any other company could be used</td></tr><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Dumont</td><td>14094-11</td><td>Scissors from any other company could be used</td></tr><tr><td>Needles/Pins</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Albion</td><td>10</td><td>Ensure that the scalpel has a blunt end</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 60 mm x 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430166</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>-</td><td></td><td>In house PBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-050-1A</td><td>Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly</td></tr><tr><td>Pipettes 10 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Corning, 4488</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterile centrifuge tubes</td><td>Minplast Ein-shemer</td><td>35050-43</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362548</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Cell strainer</td><td>Fisher</td><td>22362549</td><td></td></tr><tr><td>Staining buffer</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf 5804 R</td><td>5805 000.017</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes with Cell strainer caps&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon&amp;nbsp;</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Integrin &amp;beta;1</td><td>eBioscience</td><td>25-0291</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Integrin &amp;alpha;6</td><td>eBioscience</td><td>15-0495</td><td>1:600</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>eBioscience</td><td>11-5981</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>eBioscience</td><td>9011-0349</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>Dry Chelex</td><td>BioRad</td><td>142-2842</td><td></td></tr><tr><td>Beaker&amp;nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Distilled H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Stir bar</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NHCl</td><td>BioLab</td><td>1903059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Beit Haemek Biological Industries</td><td>400718</td><td>FBS obtained from a different company can be used</td></tr><tr><td>1 L glass bottle</td><td>Ilmabor</td><td>Boro 3.3</td><td></td></tr><tr><td>Bottle top filter</td><td>Autofil</td><td>1102-RLS</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

このプロトコルは、詳細に濃縮し、集団の2つのタイプの分離について説明します。バルジのSC及び表皮角化細胞を2プロトコルの主要なステップを示しています。バック8週齢のマウスの背部摘出皮膚を用いて、我々は唯一のHFSCsで表現されているCD34マーカーを使用して、バルジのSCを豊かに。およびSCA-1、表皮ケラチノサイトにラベルを付けま...

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Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

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Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

20.9K ビュー.  Technion Israel Institute of Technology. An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

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Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast physiology and pathology underlie a spectrum of clinical entities, including fibroses in multiple organs, hypertrophic scarring following burns, loss of cardiac function following ischemia, and the formation of cancer stroma. However, fibroblasts remain a poorly characterized type of cell, largely due to their inherent heterogeneity. Existing methods for the isolation of fibroblasts require time in cell culture that profoundly influences cell phenotype and behavior. Consequently, many studies investigating fibroblast biology rely upon in vitro manipulation and do not accurately capture fibroblast behavior in vivo. To overcome this problem, we developed a FACS-based protocol for the isolation of fibroblasts from the dorsal skin of adult mice that does not require cell culture, thereby preserving the physiologic transcriptional and proteomic profile of each cell. Our strategy allows for exclusion of non-mesenchymal lineages via a lineage negative gate (Lin-) rather than a positive selection strategy to avoid pre-selection or enrichment of a subpopulation of fibroblasts expressing specific surface markers and be as inclusive as possible across this heterogeneous cell type.

Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

発生生物学

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

生物学

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

神経科学

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

要約

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この動画の章

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

大人の皮膚組織から人間ケラチノサイト主を特定する簡易で効率的な方法

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

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FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

髪の再生の間に上皮間葉シグナル伝達の迅速遺伝子解析

ヒト包皮からの初代シュワン細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

大人の皮膚組織から人間ケラチノサイト主を特定する簡易で効率的な方法