This work was supported in part by NIH grant RO1GM60124 (to H.S.). H.S. is an Investigator with the Howard Hughes Medical Institute. Y.F. is supported by the Deloro Career Advancement Chair and The German Israeli Foundation (I-2381-412.13/2015). D.S. is supported by the Coleman-Cohen post-doctoral fellowship.

この研究は健康のイスラエルの省の実験動物の管理と使用に関するガイドに記載勧告に厳密に従って行きました。動物のすべてが承認された制度的動物管理プロトコルイスラエル工科大学のIL-02302から2015に従って取り扱われました。 1.実験の準備<ol><li>キレート化されたウシ胎児血清の調製 注：カルシウムに対するこれらの細胞の露出を制御することが重要ですので、上皮細胞は、カルシウムに対して非常に敏感です。細胞は、単離プロセスキレート中カルシウムに暴露されないことを確実にするために、ウシ胎児血清は、染色バッファ29の調製のために使用されるから残留カルシウムを除去するために使用されます。以下のプロトコルは、準備FACS染色バッファーに必要なカルシウムを含まないウシ胎児血清の約1 Lを用意します。 <ol><li>ドライキレート材料、 例えばの400グラムを追加します。4リットルのビーカーに、キレックス、全量4 L.カバーを蒸留H 2 Oを添加し、マグネチックスターラーを用いて連続的に撹拌します。 </li><li>撹拌しながら10 N HCl溶液を用いてpHを7.4に調整します。 pHが20分以上のための安定したままになるまで20分間攪拌し続け、必要に応じてpHを再調整します。 </li><li>キレート物質がコンパクトペレットを形成できるようにするために、4℃で一晩ビーカーをインキュベートします。慎重にH 2 Oを吸引し、4 Lの全体積に新鮮な蒸留H 2 Oを追加</li><li>ステップ1.1.2のようにpH調整を繰り返します。 </li><li>コンパクトなペレットを形成するためのキレート材料を可能にするために、1時間4℃でビーカーを置きます。注意深く吸引H 2 O </li><li>ゆっくりキレート材料にウシ胎児血清の2 500ミリリットルのボトルを追加します。速度設定は、泡を生成しないことを確実に1時間4℃でゆっくり撹拌します。 </li><li> COMPを形成するためのキレート物質を可能にするために1時間4℃でビーカーを置きペレットを行動します。 </li><li>注意深く1Lのガラス製ボトルに血清を移し、無菌条件下でボトルトップフィルターを介して濾過します。 -20℃でキレート化された血清を保存するか、すぐに使用しています。 </li></ol></li><li>染色緩衝液の調製<ol><li> 2+ の Ca 2+およびMgを含まないPBSでFBSをキレート化し、3％の100ミリリットルを用意し、氷上に保ちます。 </li></ol></li></ol>大人の表皮からの毛包の2の単離<ol><li>インダクションボックスを用いて、5％イソフルランを用いてマウスを麻酔。ここで説明するプロトコルは、HFサイクルの休止期である50から80日齢のマウスを使用して最適化しました。 </li><li>標準的な実験手順に従ってマウスを安楽死させます。ここでは、安楽死のチャンバー内でCO 2過剰投与を使用して、マウスを安楽死させます。 </li><li>電気バリカンを使用して背部皮膚からすべての毛を剃ります。頭や手足を避けてください。皮膚にできるだけ近いバリカンを保管してください。皮膚や皮下層にダメージを与えることは避けてください。 </l私&gt; <li>すべての毛が除去されると、任意の髪の残留物を除去し、背部皮膚を消毒するために70％エタノールを使用します。 </li><li>解剖パッドの上にマウスを置き、使用する鉗子は、尾近くの皮膚を引き上げ、はさみを使って小さなニックを作ります。慎重に皮膚を切り欠いおよび筋膜からそれを分離することによって、後方、前方方向の全背部皮膚をカット。皮下層に損傷を与えないようにしてください。 </li><li> 、髪の面を下に解剖マットの上に皮を置き、所定の位置に固定するために、皮膚の二つの隣接エッジを突き止めます。ゆっくり真皮が明確かつ端正になるまで鈍メスを用いて、脂肪を削り取ります。 注意：脂肪を掻き落とすときは、肌に穏やかな圧力を適用するように湾曲した鉗子を使用しています。鉗子の湾曲した側面を使用して皮膚に圧力を適用します。これは、引き裂きから肌を防ぐことができます。 </li><li> 、真皮が100mm無菌培養皿に、ダウンサイド肌を置き、何の折り目がないことを確認するために皮膚をまっすぐ。カルシウムを含まないPBSの10ミリリットルを追加2+ </培養皿にし、必要に応じて皮膚を真っすぐ- SUP&gt;およびMg 2+（PBS）。 </li><li> PBSを吸引し、0.25％トリプシンの10ミリリットルを追加します。皮膚が展開され、自由に浮遊していることを確認してください。 0.25％トリプシンの10ミリリットルあたりの皮膚の一枚をインキュベートします。 </li><li> 30から120分間、または4℃で一晩、37℃でサンプルをインキュベートします。 </li></ol>毛包からの単一細胞懸濁液の調製<ol><li>後方方向に前方に湾曲鉗子やメスを用いて皮膚からすべての髪を、こすり。鉗子の湾曲した側面を使用して所定の位置に皮膚を持ち、髪を掻き取るメスを使用しています。 注：ステップ2.8で追加されたトリプシン溶液中に髪を削り取ります。尾でスタートし、髪の成長の方向に従ってください。髪の成長の方向に対してスクレイピングは、細胞収率の実質的なHFSの損失と減少します。 HFSは共にそれぞれに付着し、小さな凝集塊を形成する傾向があります。目を低減するためにHF塊のEサイズは、一度に小さな領域を削り取るしてみてください。 </li><li>新しい培養皿に毛のない皮膚を移し、10mlのPBSを追加-乾燥からそれを防ぐために。皮膚を点検し、残りの髪を掻き落とします。 </li><li>単一のHF懸濁液が得られるまでメスや鉗子を使用してHFSを打破します。積極的にすべての髪の塊を破壊するために数分間10ミリリットルピペットを用いてHF懸濁液を粉砕します。 注：氷の上で、次のすべての手順を実行します。 </li><li>前標識された50ミリリットルチューブにHF懸濁液を転送します。 </li><li> ;皮膚からとHFのサスペンションを含んでいた細胞培養皿を洗うためにそれを使用- PBSを吸引50mlのチューブに移します。 </li><li>洗浄<ol><li> 50mlのチューブに装着70μmのセルストレーナーを通過することによってサスペンションをフィルタリングします。 （ - FBSキレート化3％PBS）染色緩衝液10mlで最初の50ミリリットルチューブとストレーナーを洗ってください。 </li><li>渡すことによって、サスペンションをフィルタリング40μmのセルストレーナーを通して50mlのチューブに装着。すべての細胞が新しいチューブに転送されていることを確認するために、染色緩衝液5〜10 mlのチューブを洗浄します。すべての動物が処理されるまで氷上にサスペンションを保管してください。 </li><li> 4℃で300×gで15分間遠心分離します。慎重に染色緩衝液5mlにペレットを再懸濁ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。 </li><li> 4℃で5分間300×gで遠心します。注意深く上清を吸引し、染色緩衝液800μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。 注：上記の指定されたボリュームは、2つの成体マウス由来の細胞を染色するために十分です。 </li></ol></li><li>前標識されたFACSチューブにサスペンションを転送します。 <ol><li>コントロールチューブについて、細胞懸濁液（または細胞懸濁液からの任意の残留左）の25-50μLを取り、染色バッファーで300μlの総体積を作ります。 注：（未染色のための制御管（総容量300μl）を準備しない抗体はありませんなしDAPI）。のみDAPI;インテグリンβ1;インテグリンα6。 SCA-1; CD34。 </li></ol></li><li>適切なチューブに所望の濃度の一次抗体およびDAPIを（適切な希釈のための材料の表を参照）を追加します。静かに細胞懸濁液を混合するためにチューブをフリック。氷上に戻り、光から保護するためにアルミホイルでカバーしています。 </li><li>氷上で30分間インキュベートし、穏やかに細胞を懸濁状態に維持されることを保証するためにチューブを10分ごとにフリック。 </li><li>染色緩衝液（チューブあたり約4ml）で、各FACSチューブを充填することにより細胞を洗浄。 4℃で300×gで5分間遠心します。 </li><li>注意深く上清を吸引し、染色緩衝液800μlの中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>単一細胞懸濁液を確実にするために、セルストレーナーキャップでFACSチューブに細胞懸濁液を移します。 </li></ol> 4.フローサイトメトリー分析<ol><li> Signaのための適切なフィルタを用いて、フローサイトメーターを使用して、すぐに細胞選別に進んでくださいリットル検出。 （DAPIの測定用）405 nmの紫、（APCの励起用）と633nmの赤色のレーザー（FSC、SSC、PE、PE-Cy7のとFITCの測定用）488 nmの青を使用します 注：機器はすべての3つの蛍光チャネル用の検出器から記録されていることを確認。 </li><li>未染色試料および単一染色されたコントロールを使用して、スペクトルのオーバーラップの補償に基づいて設定された蛍​​光ゲート。 注：蛍光シグナルの任意の重複を排除するために、チャンネル間の補償を調整するための単一の染色されたコントロールを使用します。補償調整は使用FACSソーターに依存します。 </li><li>死細胞を排除するためにDAPIに基づいて、プライマリゲートを設定します。 </li><li>一重のイベントを選択するために散布図（FSC-A対SSC-A）を調整します。 </li><li>ダブレットのために排除し、一重イベントを識別するためにFSCとSSCの高さと幅のパラメータを設定します。 </li><li>高α6およびβ1発現を有するとCDのいずれかで、この集団のゲート細胞からのゲート細胞34高発現またはのSca1高発現。 </li><li>予め標識FACSチューブにソート細胞。 注：細胞の二つの一般的な集団を単離することができます。 α6+ /β1+ / CD34 + / SCA-1 -及びα6+ /β1+ / SCA-1 + / CD34 - 。それらは、細胞培養またはRNAの単離などの下流のアプリケーションが使用されるまで、選別された細胞は、常に氷上で維持されるべきです</li></ol>

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The authors have nothing to declare

ここで説明するプロトコルは、よく成体マウスの背部皮膚からHFSCsを単離するための確立されていますが、同じように、マーカー2,16,23,28,29の選択に基づいて、HF構造内の他の集団の単離のために適用することができます。特定の細胞型は、不均一な細胞集団の混合物から選択され、収穫することができるという点で、この方法は、組織解離、細胞単離の他の方法、上特に有利です。さ...

成体幹細胞（SCS）は、死細胞を置き換えることにより、組織の恒常性を維持し、けがの際に損傷した組織を修復するために不可欠です。これらのSCは、継続的な自己再生を受けると、様々な細胞系列1-3に分化する能力によって定義されます。その補充のための成人のSCに依存している最も研究システムは、造血系、腸及び皮膚1,2,4を含みます。 胚発生の間、皮膚は、表皮細胞の単層として始まります。間葉系細胞は、皮膚を移植し、下層のコラーゲン性真皮5を形成する場合、毛包（HF）の形態形成が開始されます。下向き6を成長し始める毛プラコードを形成するために、後に、真皮乳頭（DP）を構成する表皮層の直下に整理し、上皮を刺激する間葉系細胞を、専門に。高いHFの底部に位置するマトリックス細胞を、増殖、内層が毛幹（HS）と周囲の内毛根鞘（IRS）2,3を形成するために、同心円筒に分化し始める一方で、これらの間葉系細胞を包むと毛球を形成します。 毛包間表皮（IFE）、皮脂腺（SG）およびHF：出生後の生活の中で、皮膚の表皮には3つの区画で構成されています。恒常性の一定の状態にあるIFEとSGとは対照的に、HFは、持続的な成長のサイクル（成長期）、破壊（退行期）、残り（休止期）4,7を受ける動的なミニ臓器です。毛包幹細胞（HFSCs）、燃料、この永久サイクルは、バルジ4として知られているHF内に特殊なニッチに存在します。 HFSCsが膨らみを終了する成長期の間に、DPからの起動信号以下、増殖し始めると下向きの下降従って、外毛根鞘として知られている細胞の長い直線状の軌跡を作成する（ORS）8-10。マトリックス細胞、すなわちHF、急速サイクルの基部にDPを囲むので、HSとIRS 10（ 図1）を生成する最終分化を受けて上方へ移行します。成長期の持続時間は、毛髪の長さを決定し、マトリクスのセル6の増殖および分化能力に依存します。 HFが退行期に入ると、バルブ止めにおけるトランジット増幅マトリックス細胞は、増殖、アポトーシスを起こし、それがHF 8,11の非循環部に達するまで上方DPを引きながら完全に退行します。この後退の間、HFは退行期の特徴である上皮鎖として知られる一時的な構造を形成し、多くのアポトーシス細胞が含まれています。マウスでは、退行期は3-4間日間持続し、非常に最初の毛周期に同期されます。 HFは休止期に達すると、すべてのHFSCsが静止状態になります。 HFサイクルの異なる段階はまたメートルのため、マウスの皮膚の色の変化によって特徴付けられますelanin生産。退行期中の濃い灰色に成長期の間に黒から皮膚の変化は、休止期6,7,12,13の間にピンクに。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53931/53931fig1.jpg" /> 図1：毛包サイクル 。 HFは永久上部と急速な成長（成長期）、破壊（退行期）および相対的静穏期や休符（休止期）の連続的なサイクルを経る下絶えず改造、サイクリング部で構成されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53931/53931fig1large.jpg" target="_blank">大きい方を表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。</a> HFを維持するのSCは、最初だけSG 14の下方HFの恒久的な地域に住んでスローサイクリングラベル保持細胞（LRC）の人口を明らかにしたトリチウム化チミジンで、チェイス実験を用いて同定しました。 HFSCの進歩特徴付けは、HFのニッチ15からの特定のSCを同定および単離するために使用することができるマーカーの数が少ないことが明らかになりました。おそらくHFSCsの濃縮のための最良のマーカーは、CD34、また、ヒト16中の造血SCマーカーとして同定された細胞表面マーカーです。このCD34 +集団内の2つの異なる集団はまた、α6インテグリンの発現2に基づいて単離されています。他のマーカーは、CD34発現と共局在し、K15プロモーターは、標的化およびトランスジェニック動物15,17-19にHFSCsを単離するために使用され、ケラチン高いバルジ領域で発現される15（K15）です。過去10年間でHFSCsおよび前駆細胞の他のいくつかの異なる集団はまた、HF 17,20-27内に存在することが報告されています。 HFSCsの追加の刺激的な特徴は、皮膚修復への貢献です。通常の条件下ではHFSCsは、HFを補充し、IFEの恒常性に関与しません。ハウ版、創傷に応じて、これらの細胞はIFE 9を再増殖にそのSCのニッチや援助を終了します。我々は最近、マウスがプロアポトーシスSept4 / ARTS遺伝子の表示のために、アポトーシスに対する耐性を実証CD34、K15およびSox9を+ HFSCs、数の増加を削除することを実証しました。 HFSCsはSept4 / ARTSから単離した- / -背部皮は蛍光活性化細胞選別（FACS）を利用し、CD34 +およびK15 + HFSCsの数の2倍を超える増加がありました。これらのSept4 / ARTS - / - HFSCsが、 インビトロで拡大していなかっただけでそれ以上のコロニーを生じたが、対照28と比較しても過酷な条件に耐えることができました。 HFSCs数が増加した結果、Sept4 / ARTS - / -マウスは、皮膚切除損傷に応答して有意に速く治癒します。驚くべきことに、Sept4 / ARTS - / -マウスdisplayeダ創傷床から再生されたHFSの数が多い、とかなり小さい傷跡。さらに、XIAP（アポトーシスのX連鎖阻害剤）、ARTSの生化学的目標のために削除されたマウスは、治癒障害28を実証しました。 我々の結果と他の研究室で行われた作業はHFSCsは大人のSCの生物学と機能を研究するための理想的なモデルとして役立つことが示されています。ここでは、4つのマーカーの発現に基づいてHFSCsと表皮角化細胞の濃縮及び単離するための方法論について説明します。インテグリンα6。インテグリンβ1; SCA-1（表皮角化細胞のマーカー）およびCD34。 K15 + HFSCsの同様の分離はまた、K15-GFPレポーターマウス19を用いて行うことができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1027">
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:295px;">Isoflurane&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Primal Critical Care</td>
			<td style="width:144px;">&#160;66794-017-10</td>
			<td style="width:341px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Carbon dioxide</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Electro Shaver</td>
			<td>Oster&#160;</td>
			<td>Golden A5</td>
			<td>Shaver from any other company could be used</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70% ethanol</td>
			<td>Gadot Lab</td>
			<td>830000051</td>
			<td>96% ehtanol diluted with distilled water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Dissection mat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection tools from any provider can be used</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>Foreceps from any other company could be used</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Scissors&#160;</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>Scissors from any other company could be used</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Needles/Pins</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Scalpel</td>
			<td>Albion</td>
			<td>10</td>
			<td>Ensure that the scalpel has a blunt end</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Tissue culture dish 60mm x 15mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">PBS</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>In-house PBS without Calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;">0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-050-1A</td>
			<td style="width:341px;">Trypsin obtained from a different company might have a different activity and duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Pipettes 10ml</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Corning, 4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Ice</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">50 ml sterie centrifuge tubes</td>
			<td>Minplast Ein-shemer</td>
			<td style="width:144px;">35050-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">70&#181;M Cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22362548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">40&#181;M Cell strainer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22362549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Staining buffer</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf 5804 R</td>
			<td>5805 000.017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">FACS tubes with Cell strainer caps&#160;</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">FACS tubes&#160;</td>
			<td>Falcon&#160;</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Integrin &#946;1</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0291</td>
			<td>1:400</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Integrin &#945;6</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>15-0495</td>
			<td>1:600</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Sca I</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-5981</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">CD34</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>9011-0349</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>50ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Dry Chelex</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>142-2842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Beaker&#160;</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Distilled H2O&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Stir bar</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">NHCl</td>
			<td>BioLab</td>
			<td>1903059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Beit Haemek Biological Industries</td>
			<td>400718</td>
			<td>FBS obtained from a different company can be used</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">1L glass bottle</td>
			<td>Ilmabor</td>
			<td>Boro 3.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Bottle top filter</td>
			<td>Autofil</td>
			<td>1102-RLS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating hair follicle stem cells and epidermal keratinocytes from dorsal mouse skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

このプロトコルは、詳細に濃縮し、集団の2つのタイプの分離について説明します。バルジのSC及び表皮角化細胞を2プロトコルの主要なステップを示しています。バック8週齢のマウスの背部摘出皮膚を用いて、我々は唯一のHFSCsで表現されているCD34マーカーを使用して、バルジのSCを豊かに。およびSCA-1、表皮ケラチノサイトにラベルを付けま...

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Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

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Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

Stem Cell Biology And Renewal in Epithelial Tissue

SCIENTISTS IN ACTION

20.8K ビュー.  Technion Israel Institute of Technology. An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

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Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

発生生物学

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a "highly permissive" state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated "epigenetic cell conversion". It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.

Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

水平全マウント：皮膚の厚い3次元組織断面のための新規処理および画像化プロトコール

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

Pax7 とラミニン抗体抗体法による骨格筋衛星細胞の同定

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...