ここで説明するプロトコルは、生体内癌モデルを用いて治療効果をテストするためのアルゴリズムを実証することを目的としている。プロトコルは、いくつかの手法の組み合わせで構成されています。ヒト腫瘍標本の全ゲノムバイオシーケンシングは、ゲノム変化を同定するために使用される。
これらには、遺伝子の再調整と遺伝子コピー数の変化の両方が含まれる。したがって、特定された変更の分析は、潜在的に薬物可能な変化を選択するために行われます。ゲノム解析に基づいて選択された薬物は、免疫不全マウスで増殖した対応する腫瘍のインビボ治療に使用される。
開発されたアルゴリズムは、がん患者のケアのための治療決定を支援するための有望なアプローチを表しています。パンダツールまたは類似のソフトウェアを使用して、ターゲット可能な変更を特定します。標準的な遺伝子シンボルを使用して単純なタブの区切りファイルとして生じた微小配列決定によって同定された遺伝子をリストアップすることができます。
テーブルヘッダーがソフトウェアの経路レベルUに転送されるように、リストのヘッダラインにポンド記号を追加します。対応するナビゲーションタブをクリックしてファイルをアップロードします。選択したアイコンをクリックし、[ファイナライズ] タブをクリックして、基になるデータを表す 1 つのアイコンを割り当てます。
患者ファイルがアップロードされたら、ページをプレビューして、経路ごとのアポイントト付き遺伝子数を表示する列を特定します。これは、右側の最後の列です。メイン ウィンドウの左上にある経路フィルターを使用して、表示される経路の数を、対象の遺伝子を含むものに制限します。
偶然に予想されるよりも多くの遺伝子に注意を付けた経路を特定するには、濃縮タブの下にある関数を使用します。その後、フィッシャーの正確検定の対応するp値を示すメインテーブルに列が追加されます。メイン ウィンドウの左側にある適切なアイコンをチェックして、事前設定アノテーションから潜在的な薬物性遺伝子を表示するデータベースを選択します。
ビジュアライゼーション用の経路を選択するには、経路ビューアページに表示されている名前をクリックします。各アノテーションセットを表すアイコンが、関連するジーンの横に表示されます。経路内の任意の遺伝子をクリックすると、対応する遺伝子カードページが開きます。
関心のある遺伝子と、さらなる分析のための潜在的な薬物のヒットを示した経路を選択します。滅菌状態を維持するために層流フードで組織作業を行います。抗生物質を含む冷たいPBSまたは組織培養培地(RPMI、DMEMなど)を含む皿に腫瘍組織を置く。
病理学者の助けを借りて、隣接する正常および壊死組織から生存可能な腫瘍材料を同定し、単離する。生殖不能鉗子およびメスを使用して、病理学者によって指摘された壊死性物質を除去する。皮下生着を行うために、滅菌鉗子、メスまたは手術用ハサミで腫瘍組織を小さな断片(およそ2×2×2ミリメートル)に切断する。
断片化した組織を氷の上の冷やされたシャーレに移します。断片化した組織、組織の10個あたり約200マイクロリットルで皿に冷たいマトリゲルを入れます。よく混ぜて、組織断片をマトリゲルに10分間浸します。
無菌の外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの両脇腹に5〜10ミリメートルの垂直皮膚切開を行います。ストレート鉗子を皮下空間にそっと挿入して、脂肪パッドの下に腫瘍片を置くのに十分な大きさのポケットを作ります。無菌ストレート鉗子を使用して、前に準備したポケットに腫瘍断片を5匹のマウスのそれぞれに挿入します。
ティッシュ接着剤を使用して皮膚切開を閉じます。移植後、リンパ球増殖を阻害し、各マウスに100マイクロリットルのリツキシマブを注入する。背中の皮膚をつまんで後ろ向きに曲げて、マウスの頭と唇が固定されるようにして、マウスを経口ギャバジに備えます。
プローブが食道に到達するまで、マウスの喉の後ろにガビンプローブを挿入します。マウスの肺が死を引き起こす可能性があるため、プローブが挿入されすぎないようにしてください。代表的なゲノムフロートは、1つの腫瘍におけるゲノム変化の景観を示す。
高品位の血清型腫瘍に典型的な、青い線および損失の赤い線を複数得る、ゲノム不安定性の高いレベルを示す同定された。OC101腫瘍における治療介入の最も高い傾向変化は、HER2受容体をコードする遺伝子であるERBB2を含む染色体17での増幅であった。DNAレベルで結果を検証するために、増幅された領域の縁に対していくつかの特定のプライマーセットが設計されました。
PCRを行った。ヒトDNAの制御を使用した場合、増幅産物は吸収されなかった。OC101腫瘍DNAについて特異的なバンドが同定された。
別の変異型腫瘍、T14では、多数のDNA利益が観察された。これらには、RICTOR遺伝子にAKT2が含まれていました。タンパク質レベルで行われた検証は、イムノブロット法を用いて、RICTORにおいて高レベルのAKTを示した。
腫瘍の負担の有意な減少は、第6週末までに化学療法処置群において観察された。併用治療を受けたグループだけでも化学療法に対する余分な利点があった。腫瘍組織は、治療試験終了時に治療応答の分子分析のために収集した。
S6、AKT、およびmTORの合計およびリン酸化レベルは、免疫ブロット法を用いて決定した。未治療、化学療法、およびAKTまたはmTOR阻害剤で治療したこれらのタンパク質のレベルの比較は、後者の2つについて顕著な減少を示した。提示されたアプローチはPDXモデルの臨床試験を行うために非常に有用である。
ゲノムプロファイリングによって得られる腫瘍の分子特性を利用して、検査のための最良の選択薬を決定する。
