オルガノイドをうまく扱うのは細部にあり、この分野には他の人が構築するための明確な詳細なプロトコルがないため、このプロトコルは重要です。この手法の最大の利点は、タイムスケール、低バイオマス要件、および低コストのスケーラビリティです。さらに多くの研究が必要であるが、この技術は、臨床的に翻訳できるより正確な個別療法または併用療法の試験を可能にすることによって、肺癌治療を改善するのに役立つ可能性がある。
最大の課題は、マトリゲルとして広く知られているBME2の取り扱いです。貴重なオルガノイドを導入する前に、ピペッティングを練習し、液体BME2を扱うことを強くお勧めします。培養物に触れないように培養プレートから培地を慎重に吸引することによって、水中のBME2オルガノイド培養物を解離させることから始める。
6ウェルプレートに1ウェルあたり2ミリリットルの組換え酵素を添加することによって、適切な組換え酵素で沈没したBME2オルガノイド培養物をトリプシン処理する。上下にピペッティングを繰り返してBME2を機械的に破り、細胞培養インキュベーター内でプレートを摂氏37度で5分間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、懸濁液を15ミリリットルの遠沈管に移し、室温で5分間、600倍Gで遠心分離する。
オルガノイドペレットに触れることなく組換え酵素上清を注意深く吸引し、オルガノイドペレットを成長培地に再懸濁する。DNase 1を加えた後、懸濁液を室温で5分間インキュベートし、600倍Gで室温で3分間遠心分離する。オルガノイドペレットに触れずに培地を慎重に廃棄し、ペレットを新鮮な成長培地に再懸濁させる。
新しい黒色透明底部96ウェルプレートを細胞培養インキュベーター内で摂氏37度で10分間予熱し、その後PBS中の細胞懸濁液を調製し、細胞分析装置を用いて細胞を計数した。実験に必要な細胞懸濁液量を計算した後、単一細胞懸濁液から細胞をアリコートし、以前に実証したように遠心分離によってペレットダウンする。培地が廃棄されたら、細胞を約1分間氷上に保持してからBME2に再懸濁させる。
予め加温した黒く透明な底部96ウェルプレートを本体に向かって傾け、1ウェルあたり5マイクロリットルの細胞懸濁液を播種し、続いてウェルの6時位置に細胞ドームを播種した。96ウェルプレートの縁にある外側のウェルをPBSで満たし、残りの内側のウェルに細胞ドームを播種する。新しく播種した細胞ドームをプレートを動かさずに細胞培養層流フードに5分間インキュベートし、次いでプレートを細胞培養インキュベーターに移し、摂氏37度で10分間インキュベートする。
オルガノイドを含むすべてのウェルにウェルあたり100マイクロリットルの成長培地を慎重に加え、プレートの縁にある外側のウェルに100マイクロリットルのPBSを加える。オルガノイドを摂氏37度で7日間培養し、本文原稿に記載されている指示に従って培地を交換し、定期的に光学顕微鏡下でオルガノイドの成長を検査する。EGFR変異型非小細胞肺癌オルガノイドを治療するために、オシメルチニブ用の低成長因子培地中で連続薬物希釈を調製する。
低成長因子培地および0.1%DMSOを添加することによるネガティブコントロールを含む。オルガノイドプレートを時計回りに180度回転させてオルガノイドが12時位置になるようにし、マルチチャンネル装置を用いて成長媒体を注意深く吸引することが好ましい。ウェルあたり100マイクロリットルのコントロールまたは薬物溶液を加える。
処理したオルガノイドを細胞培養インキュベーター内で摂氏37度で再度5日間インキュベートする。試薬を摂氏4度で一晩解凍することによって生存アッセイを行い始める。使用前に室温の水浴中で30分間試薬を平衡化し、反転させて混合する。
各ウェルに100マイクロリットルの試薬を加え、オルガノイドドームの位置にピペットチップを置いて上下にピペッティングして十分に混合する。暗所で室温で5分間インキュベートする。マルチチャンネルピペットを使用して、約150マイクロリットルの溶解物を新しい白色不透明な底部96ウェルプレートに移し、次いで、プレートを暗所で室温でさらに25分間インキュベートする。
ELISAプレートリーダーを用いて発光を記録する。プレートレイアウトと使用された薬物のすべての生の読み取りと記録を含む適切なデータテーブル形式でデータを保存します。EGFR変異陽性TH107オルガノイドは、56ナノモルの最大阻害濃度の半分のオシメルチニブ処理に対する感受性を示したが、EGFR変異陽性TH116オルガノイドは、1マイクロモルを超える半分の最大阻害濃度を有するオシメルチニブ処理に対して耐性であった。
EGFR陽性TH107非小細胞肺癌細胞の感受性は、細胞周期関連遺伝子シグネチャの発現の低下およびアポトーシス関連遺伝子シグネチャの発現の増加を含む、有意な転写変化を伴った。標的阻害剤に対する感受性EGFR変異陽性TH330の応答は、成長培地対低成長因子培地において有意に影響を受ける。EGFR変異陽性TH330における組合せ治療は、治療応答の増加をもたらした。
このアプローチは、分子療法または組み合わせ治療レジメンのためのパーソナライズされた戦略を改善する。後者は、早期に薬物耐性および耐性メカニズムを標的とし、臨床応答を深め、患者の転帰を改善するのに役立つ。
