私たちは、がんと間質の相互作用を研究し、癌治療をテストするためのプラットフォームを提供する新しい3Dスフェロイドモデルを開発しました。私の視点では、この3Dシステムは、本物の腫瘍状態をよりよく模倣するためにストロマ線維芽細胞の癌細胞を組み合わせたもので、したがって、創薬のための非常に強力なツールとなり得る。また、このモデルは黒色腫の研究に限定されない。
これは、癌の他のタイプを調査するために使用することができます.この手順のデモンストレーションは、私の研究室のシニアサイエンティストであるホンウェイ・シャオ博士です。ヒト黒色腫細胞培養の場合、従来の接着細胞培養条件下で細胞を投げ、5%の二酸化炭素で摂氏37度でW489培地を完全に投げる。
細胞が90%の合流度に達したら、細胞を1〜5の比率で分割する。マウス皮膚線維芽細胞培養の場合、採取した組織ペレットをPBSで洗浄してから、10%の胎児ウシ血清を添加したDMEMと、細胞培養インキュベーターでペニシリン・ストレプトマイシンを1%補充した。合流率が90%になったら、細胞を1対2の比率で分割します。
コカルチャーをセットアップする前に、細胞の合流度が翌日約60%に達するように濃度で100ミリメートル皿に線維芽細胞を種付けします。翌朝、上清をGFPの1対3から1対5の濃度に置き換え、ポリブレンの1ミリリットル当たり4マイクログラムを添加した通常の培養培地中のストックから希釈したレンチウイルスに置き換える。上清を新鮮な培養培地に置き換える前に、細胞を細胞培養インキュベーターに6時間入れます。
2日後、蛍光顕微鏡で細胞からのGFPシグナルを観察します。両方の細胞培養が安定的にトランスフェクションされた場合、両方の細胞培養を0.25トリプシン-EDTAから切り離して、センチメートルによって単一細胞懸濁液を収集する。細胞をコ培養培地濃度のミリリットル当たり10〜4番目の細胞の2倍に再懸濁し、メラノーマ細胞と線維芽細胞を1対1の比率で混合する。
次に、各条件の24ウェルプレートと三重位の各ウェルに2ミリリットルの細胞を見て、細胞がプレート底に付着できるように細胞培養インキュベーターに4時間プレートを置きます。2D細胞クラスター形成を評価する黒色腫細胞単独培養については、24ウェルプレートの各ウェルに10〜4番目の黒色腫細胞を2回見て、細胞培養インキュベーターで7〜10日間培養する。次に、蛍光顕微鏡の標準プロトコルに従って、反転蛍光顕微鏡で細胞を撮影します。
タイムラプス撮像システムがオフの場合は、イメージングの少なくとも1時間前にオンにします。システムの準備ができたら、慎重に培養プレートを顕微鏡のステージに移し、インキュベーターをスライドさせ、ドアをしっかりとロックします。タイムラプスイメージングシステムのソフトウェアを開き、容器を追加してプレートの種類とメーカーを選択し、顕微鏡がスキャンエリアを正確に見つけることができます。
10倍の対物レンズと関心のあるウェルを選択し、スキャン領域のパラメータ、スキャンと開始時間と終了時間の間の間隔を設定します。次に、4時間から52時間の時間経過イメージングを記録します。画像記録の最後に、タイムラプスイメージングシステムソフトウェアを使用してデータを取得し、収集したビデオまたは画像セットをエクスポートします。
共培養物の共焦点顕微鏡イメージングでは、プレートを反転蛍光顕微鏡のステージに置き、赤と緑のレーザービームを選択します。5~10倍の目的で細胞を観察し、スフェロイドを選択してスキャンを開始します。1ミクロンのzステップを使用して、回転楕円体の下から上までスキャンします。
次に、適切な画像処理ソフトウェアを使用してデータを処理し、さらに回転して3Dムービーとして保存できる3D画像を再構築します。ここで、共培養した黒色腫細胞と線維芽細胞によって形成された多細胞3Dスフェロイドの画像が示されている。線維芽細胞の不在で培養された黒色腫細胞は典型的な3Dスフェロイドを形成しないが、一部の黒色腫細胞は拡張培養を伴う2Dクラスターを形成する。
時間経過イメージングを用いて、線維芽細胞および腫瘍細胞は、約36時間でスフェロイドから始まる共培養において相互作用を観察することができる。本ムービーでは、培養の4〜52時間の単一培養黒色腫細胞凝集体形成の動的プロセスが観察できる。ここで、培養7日後の共焦点顕微鏡で3Dスフェロイド構造を観察することができ、一方、この映画では、2D細胞クラスターを可視化することができる。
3Dスフェロイドは培養培地に懸濁したままで移動性であり、2D腫瘍細胞クラスターは培養プレートに付着する傾向があり、不動である。この3Dモデルは、腫瘍間質相互作用を研究するためのユニークなプラットフォームとして機能します。例えば、細胞間Notch1シグナル経路活性および癌関連線維芽細胞が癌の茎および開始細胞およびスフェロイド形成をどのように調節するかを解明する。
さらに、このモデルは、癌幹細胞および細胞の薬剤応答をテストするために使用することができる。この方法は簡単かつ簡単ですが、適切な細胞密度と細胞比を使用し、例示したように適切な培養プレートを使用するように注意してください。この3Dモデルは、がん幹細胞の表現型を決定する重要な細胞内シグナル伝達経路活性を鎮静させるとともに、がん幹細胞が高感度である低分子化合物をスクリーニングする場合にも適用できます。
