二次元細胞培養は、生体内腫瘍の増殖を十分に模倣しない。改善のために、3D手順は、回転楕円体を用いて開発されています。当社の3D神経膠芽腫スフェロイドベースアッセイは、健康な脳腫瘍環境への脳腫瘍浸潤を調査するのに特に適しています。
三次元培養モデルは、多細胞アーキテクチャ、異種性および腫瘍の代謝状態を再現するために使用することができ、薬物効果のより厳格な評価を可能にする。ウェルの底に触れたり、上澄み物を完全に取り除いたり、ゲルを氷の上に保ち、細胞をゲルに素早く加えたりしないでください。均一な大きさの腫瘍スフェロイドを生成するには、まず5ミリリットルのPBSで目的の腫瘍細胞培養物を洗浄し、解離酵素の0.5〜1ミリリットルで細胞を治療する。
摂氏37度で5分後、PBSの4〜4.5ミリリットルで反応を停止し、完全な成長培地の10ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に取り外した細胞を移す。カウント後、2%メチルセルロース濃度の2ミリリットルを添加した完全な増殖培地の8ミリリットル当たり6番目の細胞に1回10〜6番目の細胞で細胞を再懸濁し、無菌系容器に懸濁液を移す。その後、96ウェル丸底板の各ウェルに100マイクロリットルの細胞を加え、3〜4日間37°C5%の二酸化炭素インキュベーターにプレートを置きます。
浸潤アッセイを行うために、腫瘍細胞が均一なサイズのスフェロイドを形成した場合、各細胞構造を500マイクロリットルチューブに移し、200マイクロリットルのPBSでスフェロイドを1回洗浄する。2回目の洗浄後、スフェロイドを作りたてのコラーゲンマトリックス100マイクロリットルに慎重に移し、各スフェロイド懸濁液を平底96ウェルプレートの各ウェルの中央に加えます。摂氏37度で30分のインキュベーションを行った後、各ウェルのゲルの上に100マイクロリットルの完全な成長培地を加えます。
腫瘍細胞の浸潤の最良の画像化のために、各ウェルの中心にすべてのスフェロイドを配置してください。移行アッセイを行うために、腫瘍細胞が均一なサイズのスフェロイドを形成した場合、6ウェルプレートにマトリゲル1ミリリットル当たり0.2ミリグラムを37°Cで30分間コーティングする。インキュベーションの終わりに、 Matrigel を取り除き、完全な成長培地を 2 ミリリットルずつ各ウェルに加えます。
丸底板から50マイクロリットルのボリュームのスフェロイドを6ウェルプレートの個々のウェルに移し、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間入れます。翌日、ヘヒストのミリリットル当たり10ナノグラムで37°Cで30分間スフェロイドを染色します。侵入または移行アッセイ後の画像取得のために、ビデオカメラを搭載したブライトフィールド共焦点顕微鏡のステージにプレートを置き、適切な実験期間にわたって画像を取得します。
半自動化された方法で画像を分析するには、フィジーに画像をインポートし、プラグイン、マクロ、インタラクティブインタプリタをクリックします。適合した紫色のループをコピーして貼り付けます。紫色の文を保持し、必要に応じて、関心のある緑色の文を追加します。
次に、各回転楕円体の面積を測定するには、[解析と測定] をクリックします。球面構造の異なる領域における低酸素症を測定するために、炭酸脱水酵素IX染色は、低酸素活性を決定するために使用することができる。本代表分析では、より多くの炭酸脱水酵素IX陽性細胞がスフェロイド中心において観察された。
スフェロイドコアに位置する低酸素細胞は、コアを取り巻く細胞よりも解糖性が高い傾向がある。ミトコンドリアは、さらなる分析のために電子顕微鏡で画像化することができます。スフェロイド径は、3D細胞構造を構成する細胞の密度に直接相関しており、フィジーマクロは、各スフェロイド内の細胞の増殖、浸潤または移動または各スフェロイド内の細胞の移動を定量化するために使用することができる。
スフェロイドコアの増加は、細胞増殖の刺激を反映する。ミトコンドリア呼吸鎖の複合体Iの阻害に際して、ミトコンドリアにおけるATP産生の大半は、72時間後に増殖を20%減少させる妥協される。塩化水素処理は、24時間にわたってコラーゲンタイプIの浸潤を高めるが、未処理のスフェロイドを制御するのと比較して、回転楕円体の回遊面積を1.5倍に減少させる。
ライブイメージングによって評価されるように、スフェロイドは高い内部ダイナミクスを示し、迅速に移動します。スフェロイドのサイズは比較的均一で、最良のイメージング結果を得るためには、ウェルの中心まで回転楕円体を操作するように注意する必要があります。この方法は、腫瘍細胞増殖、遊行および死の解析、細胞外マトリックス、細胞受容体または細胞内タンパク質の発現を調べる場合にも使用できます。
スフェロイドはまたカプセル化され、また、細胞表面張力の増加の効果は、カプセルの除去時に調べることができる。
