結合タンパク質のみが複数の生物学的プロセスを制御します。このFLAG-ビオチンCLIP-seq法は、したがって、哺乳類細胞におけるRNAおよびRRBの特殊および時間的配置をグローバルにプロファイリングする。この方法により、SDS-PAGEおよび膜移動手順を使用せずに、直接タンパク質結合RNAを効率的に検出することができます。
従来のCLIP-seqと比較すると、同位体は含みがなく、タンパク質特異的抗体を必要としません。10センチメートルプレートに約300万個のマウス胚性幹細胞をめっきし、一晩インキュベートすることから始めます。翌日、真空で培地を取り出し、室温で2分間0.25%トリプシンEDTAの2ミリリットルで細胞を処理します。
新鮮なMESC培地の4ミリリットルでトリプシンをクエンチし、15ミリリットルの遠心分離管に細胞を移す。その後、摂氏4度で3分間Gの300倍に遠心し、上清を取り除きます。冷たいPBSの4ミリリットルで細胞を中断し、架橋のために10センチメートルのプレートに戻します。
254ナノメートルのUV光で細胞を放射し、架橋された細胞を15ミリリットルのチューブに移します。この細胞を摂氏4度で3分間3分間Gの300倍に回転させ、上清を取り除き、原稿の指示に従って調製したバッファAの500マイクロリットルで細胞をライスします。細胞をRNAseフリーの1.5ミリリットルチューブに移し、摂氏4度で30〜60分間穏やかな回転でインキュベートします。
30マイクロリットルのDNAse 1を摂氏37度で10分間処理します。次いで、0.5モルEDTAの4マイクロリットルを加えて反応を停止する。摂氏4度で20分間12,000倍Gで遠心分離機を回し、上清を新しい冷蔵1.5ミリリットルチューブに移します。
細胞ライセートを事前に平衡化したFLAGビーズに移し、2〜4時間回転させながらサンプルを摂氏4度でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズをGの3000倍で2分間遠心し、上清を取り除く。サンプルに500マイクロリットルのバッファーAを加え、摂氏4度で5分間インキュベートし、ビーズを回転させて上清を取り除きます。
バッファーAで洗浄を繰り返し、次に3つのX FLAGペプチドを用いて溶出B.To前冷蔵緩衝液を2回洗浄し、テキスト原稿に記載されているように溶出液を調製し、FLAGビーズをスピンダウンする。狭い端のピペットの先端で上澄み物を取り除き、各サンプルに3つのX FLAG溶出液の200マイクロリットルを加えます。穏やかな回転で摂氏4度で30分間サンプルをインキュベートします。
その後、3000倍のG.上華を新鮮なチューブに移し、溶出を2回繰り返します。FLAG免疫沈降の効率を確認するために、ウェスタンブロット分析または銀染色のための溶出物の5%を保存します。プルド溶出物を準備したストレプトアビジンビーズに移し、サンプルを摂氏4度で1〜3時間または一晩穏やかに回転させます。
次に、磁気スタンドにビーズを集め、上清を取り除きます。500マイクロリットルのバッファーCでビーズを1回5分間穏やかな回転で2回洗います。次に、500マイクロリットルのバッファーDでビーズを2回洗浄し、500マイクロリットルの氷冷PNKバッファーで2回洗浄し、磁気スタンドにビーズを集め、洗浄の間に上澄み剤を取り除きます。
部分的なRNA消化を行うために、各サンプルにMNA溶液100マイクロリットルを加え、熱ミキサーで摂氏37度に設定された渦を10分間加えます。30秒間磁気スタンドでビーズを収集し、上清を取り除きます。次に、原稿の指示に従ってPNK-EDTAバッファー、バッファC、およびPNKバッファで洗浄します。
磁気スタンドでビーズを収集し、バッファーを取り外します。次に、10分間サーマルミキサーで37°CのビーズをCIP反応ミックスと渦液を加えます。500マイクロリットルの氷冷PNK EDTAバッファーでビーズを2回素早く洗浄し、続いて500マイクロリットルの氷冷PNKバッファーで2回洗浄します。
3つのプライムリンカーライゲーションミックスの40マイクロリットルをビーズに加え、3時間または一晩熱ミキサーで摂氏16度で渦を出します。この実験では、同盟国へのリンカーの効率的な結紮が重要です。反応管を時々調べて、ライゲーション中に沈殿しないことを確認します。
インキュベーション後、PNK EDTAおよびPNKバッファーでの開化を繰り返し、ビーズに40マイクロリットルのPNKを混合し、サーマルミキサーで37°Cで10分間ボルテックスします。PNK EDTAおよびPNKバッファーでビーズを洗浄し、テキスト原稿に記載されているようにRNAの分離を進める。FLAG媒介性またはストレプトアビジンと比較して、一段階の親和性精製を媒介し、FLAG-Biotinタンデム精製は、間接的なタンパク質RNA相互作用の汚染を回避し、ほぼすべてのコア精製タンパク質を除去した。
LIN28およびWDR43は、マウス胚性幹細胞を用いてFbio CLIP-seqを行った。合計で、LIN28とWDR43について、それぞれ約770万件と220万件のユニークな読み取りが行われました。トラックビューの比較は、RN45プレrRNA遺伝子座における異なる結合パターンを示す。
LIN28によるプレレット7-g RNAのGGA Gモチーフ上の架橋部位を、Fbio CLIP-seqまたは同定した。さらに、結合部位における濃縮されたRNAモチーフ、および変異の異なるタイプの変異における変異ヌクレオチドの割合を決定した。LIN28が遺伝子ヌクレオチドに結合することを好むことを示す。
さて、午後10時に、このプロトコルは、タンパク質のみの複合体が正常に精製されたことを確認するために免疫沈降の効率を確認することが重要です。
