Sadece ve sadece bağlayıcı proteinler birden fazla biyolojik işlemi kontrol eder. Bu FLAG-Biotin CLIP-seq yöntemi, dolayısıyla küresel memeli hücrelerinde RNA ve RRB'lerin özel ve zamansal düzenleme profilini. Bu yöntem, SDS-PAGE ve membran transfer prosedürleri olmadan doğrudan proteine bağlı RNA'ların etkin bir şekilde algılanmasını sağlar.
Geleneksel CLIP-seq ile karşılaştırıldığında izotop içermez ve proteine özgü antikor gerektirmez. Yaklaşık 3 milyon fare embriyonik KÖK hücresini 10 santimetrelik bir plakaya kapayarak ve bir gecede kuluçkaya yatarak başlayın. Ertesi gün, bir vakum ile orta çıkarın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca% 0.25 tripsin EDTA iki mililitre ile hücreleri tedavi.
Dört mililitre taze MESC ortamı ile tripsini söndürün ve hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, onları 300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücreleri dört mililitre soğuk PBS'de askıya alın ve çapraz bağlama için 10 santimetrelik plakaya geri aktarın.
Hücreleri 254 nanometreLIK UV ışığıyla yayan, sonra çapraz bağlı hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Bu hücreleri 300 kez G'de dört santigrat derecede üç dakika boyunca aşağı çevirin, sonra süpernatant'ı çıkarın ve el yazması talimatlara göre hazırlanan 500 mikrolitre Tampon A ile hücreleri inceleyin. Hücreleri RNAse içermeyen 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve 30 ila 60 dakika boyunca hafif bir dönüşle dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
10 dakika boyunca 37 santigrat derecede 30 mikrolitre DNAse 1 ile lysate tedavi edin. Daha sonra, 0,5 molar EDTA dört mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun. Çözünmez peleti 12,000 kez G'yi 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj ederek aşağı doğru çevirin ve süpernatant'ı soğutulmuş 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Hücre lisatını önceden dengelenmiş BAYRAK boncuklarına aktarın ve numuneyi iki ila dört saat dönerken dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra boncukları 3000 kez G'de iki dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Örneğe 500 mikrolitre Tampon A ekleyin ve 4 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın, sonra boncukları aşağı çevirin ve süpernatantı çıkarın.
Tampon A ile yıkamayı tekrarlayın, ardından önceden soğutulmuş Tampon B.To üç X FLAG peptidile elite, metin el yazmasında açıklandığı gibi elüsülasyon çözeltisini hazırlayın ve FLAG boncuklarını aşağı doğru döndürün. Supernatant'ı dar uçlu pipet ucuyla çıkarın ve her numuneye üç X FLAG elüsyon çözeltisinin 200 mikrolitresini ekleyin. Numuneleri 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın.
Sonra 3000 kez G.Transfer yeni bir tüp için boncuk iki dakika aşağı spin ve iki kez elüsyon tekrarlayın. FLAG immünopresipitenjinin verimliliğini kontrol etmek için batı leke analizi veya gümüş boyama için elüentlerin %5'ini kaydedin. Hazırlanan streptavidin boncuklar için çekilen eluents aktarın ve bir ila üç saat veya bir gecede dört derece santigrat hafifçe örnekleri döndürün.
Sonra, manyetik bir stand üzerinde boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Boncukları 500 mikrolitre Tampon C ile iki kez yıkayın ve yıkama başına beş dakika hafif bir dönüş le yıkayın. Daha sonra, boncukları 500 mikrolitre Tampon D ile iki kez, 500 mikrolitre buz gibi PNK tamponuyla iki kez yıkayın, manyetik standdaki boncukları toplayıp yıkamalar arasındaki süpernatantı temizler.
Kısmi RNA sindirimi gerçekleştirmek için, her numuneye 100 mikrolitre MNA çözeltisi ekleyin ve 10 dakika termal mikserle 37 santigrat derecede ayarlanan girdap. 30 saniye boyunca bir manyetik stand ile boncuk toplamak ve supernatant kaldırın. Daha sonra, el yazması yönergelerine göre PNK-EDTA arabelleği, Arabellek C ve PNK arabelleği ile yıkayın.
Manyetik stand ile boncuk toplamak ve tampon kaldırın. Daha sonra, CIP reaksiyon karışımı ekleyin ve 10 dakika boyunca bir termal karıştırıcı ile 37 santigrat derece boncuk girdap. Boncukları 500 mikrolitre buz gibi PNK EDTA tamponuyla iki kez hızlıca yıkayın ve ardından 500 mikrolitre buz gibi PNK tamponu ile iki yıkama yapın.
Yıkar sonra, boncuk üç prime linker ligation karışımı 40 mikrolitre ekleyin ve üç saat veya bir gecede bir termal karıştırıcı ile 16 derece santigrat onları girdap. Bağlantının müttefiklere verimli bir şekilde bağlanması bu deney için çok önemlidir. Bunlar ligasyon sırasında çökelti olmadığından emin olmak için zaman zaman reaksiyon tüpü kontrol edin.
Kuluçkadan sonra, PNK EDTA ve PNK tamponları ile yıkar, boncukkarışık PNK 40 mikrolitre ekleyin ve 10 dakika termal karıştırıcı ile 37 santigrat derece onları girdap. Boncukları PNK EDTA ve PNK arabellekleriyle yıkayın, ardından metin el yazmasında açıklandığı gibi RNA yalıtımı ile devam edin. FLAG aracılı veya streptavidin aracılı bir adım afinite saflaştırma ile karşılaştırıldığında, FLAG-Biotin tandem arıtma hemen hemen tüm çekirdek saflaştırılmış proteinler kaldırıldı, dolaylı protein RNA etkileşimlerinin kontaminasyon kaçınarak.
LIN28 ve WDR43, Fbio CLIP-seq fare embriyonik KÖK hücreleri kullanılarak yapıldı. Lin28 ve WDR43 için toplamda yaklaşık 7,7 milyon ve 2,2 milyon benzersiz okuma alındı. Parça görünümlerinin karşılaştırılması RN45 öncesi rRNA locusundaki farklı bağlama desenleri gösterir.
LIN28, Fbio CLIP-seq tarafından pre-let7-g RNA GGA G motifi üzerinde çapraz bağlantılı siteler veya tanımlanır. Ayrıca bağlayıcı bölgelerde zenginleştirilmiş RNA motifleri ve mutasyona uğramış nükleotitlerin farklı mutasyon türlerindeki yüzdesi belirlendi. LIN28'in gen nükleotitine bağlanmayı tercih ettiğini gösteriyor.
Saat 22:00'de, bu protokol, immünopresidasyonun verimliliğini doğrulamak ve proteinin sadece komplekslerinin başarıyla saflaştırıldığından emin olmak için önemlidir.
