このプロトコルは、人工多能性幹細胞を使用してヒト心血管細胞型を生成する力と、72時間以内に鼓動性心臓スフェロイドを生成する汎用性の高い技術を組み合わせています。これらの心臓スフェロイドは、疾患モデリングおよび薬物検査に使用することができる。この容易な技術の主な利点の1つは、標準的な12ウェルプレートで約1000個の鼓動心臓スフェロイドを生成できることです。
そして最も重要なのは、すべての心臓スフェロイドは、イメージングベースの技術を使用して、その収縮機能についてアッセイすることができるということです。電子レンジでアガロースを溶かした後、バイオセーフティキャビネットに入れ、3分間冷却します。溶融したアガロースを700マイクロリットルのピペットで、気泡を発生させないように注意しながら、9×9アレイのシリコーンマイクロモールドに加える。
金型を冷蔵前の氷ブロックに慎重に置き、アガロースの持続時間を加速します。アガロースが半透明になったら、マイクロモールドの縁を慎重に曲げてアガロースのレプリカを失い、レプリカを四方から静かに剥がしてシリコーンマイクロモールドから取り外します。81個の円形凹部を含むアガロースマイクロティッシュトレイを滅菌12ウェルプレートに移し、次いで2ミリリットルのPBSをアガロースマイクロ組織トレイに加え、顕微鏡下で捕捉された気泡または不規則な形状のウェルがないか検査する。
アガローストレイを2ミリリットルの70%エタノールに一晩浸漬し、続いてバイオセーフティキャビネットで1時間UV処理を行った。70%エタノールを取り出し、蒸留水で2回、および2ミリリットルのPBSで1回洗浄した。誘導多能性幹細胞由来心筋細胞、心線維芽細胞、及び内皮細胞をトリプシン処理及び中和後に計数したら、細胞懸濁液を氷上に置く。
新しいチューブに、誘導多能性幹細胞由来心筋細胞、心線維芽細胞、内皮細胞を混合する。次いで、凹部に触れることなくウェルおよび細胞播種チャンバーからPBSを取り出し、200マイクロリットルの細胞懸濁液を滴下して加えた。細胞を二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で2時間沈降させる。
アガロースモールドを囲むマイクロ組織作製培地を加え、内部チャンバーの表面を覆う。24時間後、円形の凹部に自己組織化されたコンパクトな回転楕円体を観察します。2日ごとに培地を交換して回転楕円体を維持します。
典型的には、48時間後、スフェロイドの自発的な拍動が観察され得る。個々の細胞型を別々に基底膜マトリックス培地、またはゼラチンコーティングチャンバースライド上で培養する。円形のくぼみから心臓ミクロ組織を静かに洗い流し、15ミリリットルのクロニクルチューブに集めます。
培地を吸引し、細胞または微小組織を1ミリリットルのPBSですすいでください。次いで、細胞または微小組織を4.2%PFAを含む固定緩衝液で固定し、室温でインキュベートする。PFAを吸引し、細胞または微小組織を1ミリリットルの透過溶液でインキュベートする。
その後、溶液を吸引し、2〜3ミリリットルのPBSですすいでください。500〜1000マイクロリットルのブロッキング溶液を細胞に加え、チャンバースライドについては少なくとも1時間、微小組織については3〜4時間インキュベートする。ブロッキング溶液中の結合抗体と共にサンプルをチャンバースライドについて1時間インキュベートし、心臓ミクロ組織について摂氏4度で一晩インキュベートする。
チャンバースライドを500マイクロリットルの0.1%Tween 20で3回洗浄し、各洗浄の間に5分間持続し、PBSで最終洗浄を行います。心臓ミクロ組織を2ミリリットルの0.1%Tween 20で5回洗浄し、各洗浄の間に20分間持続する。その後、さらに20分間最終洗浄を行う。
共焦点顕微鏡検査の前に細胞またはマイクロ組織をDAPIでインキュベートし、心臓マイクロ組織を35ミリメートルのガラス底ディッシュに慎重に移し、PBSを加えてマイクロ組織を沈める。円形のくぼみからマイクロ組織を、幅の広いピペットチップまたは1ミリリットルのピペットチップを使用して中程度のもので15ミリリットルの慢性チューブに洗い流し、それらを沈降させます。その後、培地を吸引し、1ミリリットルのPBSですすいでください。
200〜300マイクロリットルの酵素消化バッファーを加え、摂氏37度で10分間インキュベートする。その後、微小組織を1分間穏やかに混合し、インキュベーションを繰り返す。インキュベーション後、マイクロ組織を通常の1ミリリットルのピペットチップで激しく混合し、単一細胞に消化します。
濁った細胞懸濁液を得、5%FBSを含む5ミリリットルの培地で細胞懸濁液を直ちに中和する。細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通してひずみ、細胞の総数をカウントした。単細胞懸濁液を300倍Gで4°Cで5分間遠心分離する。
上清を吸引し、FITCアネキシンVおよびヨウ化プロピジウム、またはTO-PRO-3死細胞排除色素を含むアネキシン結合緩衝液に細胞を再懸濁し、氷上で10分間インキュベートする。インキュベーション後、300マイクロリットルのアネキシン結合緩衝液を細胞懸濁液に加え、フローサイトメトリー分析のために丸底FACSチューブに移す。精製された誘導多能性幹細胞由来心筋細胞、内皮細胞および心臓線維芽細胞を、位相差顕微鏡を用いて可視化した。
異なる細胞型の純度を、免疫染色およびフローサイトメトリーを用いて決定した。トロポニンTを心筋細胞のマーカーとして用い、90%以上の純度を達成した。血小板内皮細胞接着分子CD31およびビメンチンを内皮細胞および心臓線維芽細胞のマーカーとして用い、それぞれ98%および96%を超える純度を示した。
免疫蛍光染色により、心筋細胞が最も重く、微小組織の中心を占めているのに対し、内皮細胞は微小組織全体に散在しており、心臓線維芽細胞が主に末梢を占めていることが明らかになった。このペース1およびリベラーゼTLを用いた微小組織の消化は、培養における2週間後により少ないアポトーシス細胞で非常に生存率の高い細胞比率をもたらした。高濃度のドキソルビシンへの心臓微小組織の1時間の曝露は、用量依存性心毒性を誘発した。
微小組織の収縮性、およびベクトル移動は、微小組織全体の平均収縮プロファイルを示す擬似ヒートマップを生成した。心臓ミクロ組織の収縮運動は、収縮速度、緩和速度、および拍動速度として測定された正のピークを生成し、これは2つの収縮サイクル間の時間として計算された。心臓ミクロ組織の収縮性は、培養において4週間にわたって一貫していた。
細胞加熱は、この特定のプロトコルにおける最も重要なステップの1つであり、マイクロウェル内で均等に分配するために細胞懸濁液をアガロースアレイに滴下し、オーバーフローを防止するように注意する必要があります。これらのマイクロ組織の最適化された放射線プロトコルを使用すると、単一細胞RNA-seqや単一細胞ATAC-seqなどのハイスループットシーケンシング技術にこれらを従わせて、異なる処理条件に起因する細胞特異的遺伝子発現パターンを理解することができます。
