本研究は、Instituto Nacional de Perinatologia(助成金番号:3300-11402-01-575-17および212250-3210-21002-06-15)およびCONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social(FOSISS)(認可番号2015-3-2-61661)の支援を受けて行われました。

このプロトコルは、Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15) の IRB によって承認されました。参加は任意であり、登録されたすべての女性がインフォームドコンセントフォームに署名しました。
1. 内臓脂肪組織採取
<ol><li>分娩のない正期産の単胎妊娠の健康な成人女性から帝王切開中の部分的大網切除術を通じてVAT生検を取得します。</li>
	<li>子宮閉鎖と止血の後、大網を特定し、湿式湿布で伸ばします。露出しているATはVATです。</li>
	<li>最大の血管を見つけ、7 x 5 cmの架空の線を大網の基部までたどります。</li>
	<li>無血管帯を特定し、ケリー鉗子を使用してVATの外側にドリルで穴を開けます。</li>
	<li>オクスナー鉗子を使用して、VATが穿たれたゾーンの近位側と遠位側をクランプし、メッツェンバウムのはさみを使用して組織を切断します。</li>
	<li>大網を黒い絹の番号1で結びます。</li>
	<li>オクスナー鉗子を取り外し、止血を評価します。</li>
	<li>VAT生検を滅菌容器に入れ、すぐにラボに輸送します。</li>
</ol>2. 内臓脂肪組織の酵素消化と成熟脂肪細胞および間質血管分画細胞の単離
<ol><li>VAT生検を秤量し、1x PBS(pH 7.4)ですすぎます。</li>
	<li>付加価値税4gを切り取り、はさみを使って解剖トレイで組織を細かく刻みます。</li>
	<li>みじん切りにしたVATを滅菌済みの50 mL遠心チューブに移し、20 mLのPBSを加え、穏やかに振とうして余分な赤血球を取り除きます。</li>
	<li>PBSを破棄し、手順を2回繰り返します。</li>
	<li>VATを新しい滅菌済み50 mL遠心チューブに移し、25 mLの消化溶液(0.25%コラゲナーゼII型、5 mMグルコース、1.5%アルブミン含有PBS)を加えます。</li>
	<li>37°C、125rpmのオービタルシェーカーで60分間インキュベートします。</li>
	<li>消化した組織を3層のガーゼでろ過し、新しい滅菌50 mL遠心チューブに入れます。</li>
	<li>4°Cで5分間、200 x g で遠心分離します。</li>
	<li>成熟脂肪細胞に対応する上相の2つの相が得られ、SFV細胞はペレット内に残ります。トランスファーピペットを使用して、成熟脂肪細胞を新しい滅菌済み50 mL遠心チューブに静かに移します。</li>
	<li>20 mLの冷たいPBSを加え、穏やかに振とうし、200 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>PBSを破棄し、手順を2回繰り返します。</li>
	<li>トランスファーピペットを使用して、成熟脂肪細胞を1.5 mLのDNase-RNaseフリー微量遠心チューブに静かに移します。</li>
	<li>200 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離し、P200 マイクロピペットを使用して余分な PBS を除去します。必要に応じて、この手順を繰り返します。</li>
	<li>300 μLの成熟脂肪細胞懸濁液を1.5 mLのDNase-RNaseフリー微量遠心チューブに静かに移します。成熟脂肪細胞は、RNA抽出まで-80°Cで保存してください。 注:脂肪細胞はペレットを形成しません。</li>
	<li>脂肪細胞が分離されたら(ステップ2.9)、SVFペレットをチューブの底に置いたまま、ほとんどの消化液をトランスファーピペットで吸引します。</li>
	<li>トランスファーピペットを使用して、SVF細胞を含むペレットを新しい50 mL遠心チューブに移します。</li>
	<li>細胞ペレットを穏やかに洗浄し、ピペッティングで上下させて20 mLの冷たい1x PBSに再懸濁します。</li>
	<li>800 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を速やかに廃棄します。</li>
	<li>手順2.17と2.18を繰り返して、2回目の洗浄を実行します。</li>
	<li>室温(RT)に平衡化した赤血球溶解バッファー5 mLをSVFペレットに加え、ピペッティングを繰り返して懸濁します。ボルテックスしないでください。</li>
	<li>室温で5分間インキュベートし、800 x gで5分間遠心分離します。トランスファーピペットを使用して上澄み液を慎重に除去し、適切に廃棄してください。</li>
	<li>溶解バッファーを中和するには、10 mLの冷たい1x PBSを加え、細胞ペレットが解解するまで穏やかに混合します。</li>
	<li>800 x g で5分間遠心分離してSVFペレットを得て、PBSを廃棄します。チューブの底に白いペレットが見えるはずです。</li>
	<li>細胞を 5 mL の 1 x PBS に RT で繰り返しピペッティングして再懸濁し、3 層のガーゼでろ過して新しい 50 mL のコニカルチューブに入れます。その後、これらの細胞は、フローサイトメトリーによるマクロファージ亜集団の特性評価に使用されます。</li>
</ol>3. 成熟脂肪細胞からのRNA抽出
<ol><li>RNAの分解を防ぐために、RNase除染スプレーを使用してクリーンな領域を準備します。RNA手順用に予約されたピペットのセットを使用してください。使用するチューブとチップはすべてRNaseフリーである必要があります。</li>
	<li>成熟脂肪細胞懸濁液(セクション2.14)を-80°Cで保存した場合は、4°Cで解凍します。 注意: 複数回の凍結融解サイクルは避けてください。</li>
	<li>1,000 μLの酸-グアニジニウム-フェノールベースの試薬を添加して細胞を溶解し、P1000マイクロピペットで完全に混合してホモジナイズします。</li>
	<li>室温で5分間インキュベートして、核タンパク質複合体の解離を促進します。</li>
	<li>細胞ライセートを室温で12,000 x g で5分間遠心分離します。脂肪細胞脂質に対応する上相(黄色)、核酸に対応する中期(ピンク)、ペレット(細胞破片)の3つの相が得られます。</li>
	<li>P200マイクロピペットを使用して、脂質層を慎重に除去します。</li>
	<li>脂質残渣やペレットの乱れを避けながら、中間相を新しい 2 mL チューブに移します(約 700 μL)。</li>
</ol>4. マイクロRNAを含むトータルRNAの精製
注:高品質のトータルRNAを得るには、カラムベースのトータルRNA精製法を使用します。
<ol><li>セクション3.7のサンプルに等量のエタノール(95%〜100%)、約700 μLを加え、チューブを10秒間反転させて手で混合します。</li>
	<li>混合物700μLをコレクションチューブに挿入したカラムに移し、遠心分離してフロースルーを廃棄します。</li>
	<li>列をリロードし、手順4.2を繰り返します。</li>
	<li>カラムを新しいコレクションチューブに移します。</li>
	<li>400 μL のプレウォッシュバッファーをカラムに加え、遠心分離します。フロースルーを破棄し、この手順を繰り返します。</li>
	<li>700 μL の洗浄バッファーをカラムに加え、遠心分離機で 2 分間加熱します。</li>
	<li>カラムをヌクレアーゼフリーチューブに慎重に移します。</li>
	<li>50 μL のヌクレアーゼフリー水をカラムマトリックスに直接添加し、遠心分離により RNA を溶出します。200 μLのマイクロチューブを使用して10 μLのアリコートを調製します。</li>
	<li>すぐにアリコートを氷の上に置き、そのうちの1つを使用してRNAの濃度と純度を測定します。</li>
	<li>100 ng/μL に調整した 5 μL のトータル RNA のアリコートを調製して、RNA の完全性と microRNA 濃度を測定します。</li>
	<li>使用するまで-80°Cで保管してください。</li>
</ol>5.成熟脂肪細胞RNA濃度、純度、および完全性の決定。microRNA定量アッセイ
注:RNA濃度と純度の測定は、UV-Vis分光光度計を使用して行われます。RNAの完全性とmiRNAの定量は、RNA品質管理分析装置を使用して行われます。
<ol><li>サンプルリーダーを分子グレードの水で洗浄し、拭き取ります。</li>
	<li>2 μLの溶出水(ブランク)をロードし、設定をRNAに変更し、 ブランク ボタンをクリックします。</li>
	<li>2 μL のサンプルをロードし、[ 測定 ]ボタンをクリックします。</li>
	<li>読み取りが完了したら、A260/A280 および A260/A230 の比率と RNA の量(ng/μL)を記録します(図 1A)。 注:OD260 / OD280およびOD260 / OD230比が約2.0のRNAは純粋と見なされます。</li>
	<li>メーカーの指示に従い、RNA インテグリティキットを使用して RNA インテグリティナンバー(RIN)を測定します(図 1B)。 注:RIN =10 はインタクト RNA に対応し、RIN ≤ 3.0 は RNA が強く分解されていることを示します。発現マイクロアレイまたはRT-qPCRには、RIN ≥ 6.0のRNAを使用します。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、small RNA キットを使用してマイクロ RNA の濃度と割合を測定します(図 1C)。 注:低分子RNAおよびマイクロRNAの過大評価を避けるため、RIN ≥ 6.0のRNAサンプルを使用してください。</li>
</ol>6. 間質血管分画細胞の数と生存率
<ol><li>10 μLのSVF細胞懸濁液(セクション2.24)を90 μLの0.4%トリパンブルー溶液(最終希釈1:10)に希釈し、10 μLを標準的な血球計算盤に適用します。</li>
	<li>死んだ細胞を除いて、生細胞を計数チャンバーの隅にある4つの正方形に注意深く数えます。</li>
	<li>元の懸濁液中に存在する細胞濃度を測定:細胞濃度 = 総細胞数/4 x 希釈係数(10) x 10,000 = 細胞/mL</li>
	<li>得られた細胞収量(組織グラム当たりの細胞数)を計算するには、細胞濃度に元の総サンプル量(mL)を掛け、消化した組織の重量(グラム単位)で割ります。</li>
	<li>細胞生存率を生細胞の割合として次のように評価します:生存率 = (生細胞数 / 細胞総数) x 100。</li>
</ol>7. 間質血管分画からのマクロファージサブセットのキャラクタリゼーション
<ol><li>合計1 x 106 SVF細胞/mLを5 mLの丸底ポリプロピレン製試験管に移し、800 x g で4°Cで5分間遠心分離し、フローサイトメトリーおよびペレット細胞をペレット化します。</li>
	<li>ボルテックスしてペレットをほぐし、細胞を100 μLの1x PBSに室温で再懸濁します。</li>
	<li>細胞表面抗原に特異的な各蛍光色素標識モノクローナル抗体の滴定済み最適濃度を追加します。穏やかに混合し、室温で暗所で15分間インキュベートします。</li>
	<li>過剰の冷たい1x PBS(≈ 1 mL)を加え、SVFを400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。</li>
	<li>デカンテーションにより上清を速やかに廃棄する。ペレットを乱さないように注意してください。</li>
	<li>500 μL の 1x 溶解溶液を添加し、室温で 15 分間インキュベートし、チューブを直射日光から保護します。</li>
	<li>4°Cで400 x g で5分間遠心分離した後、溶液を除去し、データが取得されるまで暗所で2〜8°Cで保存します。</li>
	<li>細胞を低速で完全にボルテックスして凝集を減らしてから取得します。</li>
	<li>SVFペレットを室温で5 mLのシース液に再懸濁し、その後、フローサイトメトリーで分析する前に、3層のガーゼを新しい5 mLの丸底ポリプロピレン試験管にろ過して、セルソーターラインの詰まりを減らします。</li>
	<li>分析前に各チューブを短時間ボルテックスします。</li>
	<li>対象サンプルからデータを取得します。フロー分析では、少なくとも 10,000 個のイベントをカウントします。 注:セルソーティングフローサイトメーターを使用する場合は、マクロファージを分離して、その後の研究に適用してください。</li>
</ol>8. ゲーティング戦略
<ol><li>前方散乱分布(FSC)の面積に対して高さまたは幅をプロットし、一重項母集団を決定します(図2A)。</li>
	<li>FSCに対する側方散乱(SSC)の領域をプロットし、細胞破片を廃棄する細胞を選択します(図2B)。</li>
	<li>選択した細胞から、CD45を造血細胞として発現する集団(図2C)を同定し、CD45/CD14二重陽性細胞をマクロファージとして発現する集団を同定します(図2D)。</li>
	<li>CD45+/CD14+マクロファージから、陰性および陽性のHLA-DR細胞を検出します(図2E)。 注:抗体パネルのコンペンセーションコントロールを含め、パネルに適したマルチカラーフローサイトメーターでスペクトルオーバーラップを調整します。3つのレーザー(405 nm紫色レーザー、488 nm青色レーザー、640 nm赤色レーザー)を搭載したサイトメーターと、指示された蛍光色素の検出器を用いてフローサイトメトリー解析を行います。</li>
</ol>

著者には開示すべき利益相反はありません。

VATは、代謝調節と炎症に重要な役割を果たします。肥満に伴う慢性炎症における脂肪細胞と免疫細胞の役割への関心の高まりにより、ATに存在するSVF細胞と脂肪細胞を分離するためのさまざまな技術が開発されています。しかし、ほとんどの技術では、脂肪細胞とSVF細胞の相互作用に関する研究に不可欠な、同じVAT生検から下流のアプリケーションに有効なこれら2つの異なる細胞セットを1回...

白色脂肪組織は、脂肪細胞や脂肪細胞だけでなく、マクロファージ、制御性T細胞(Treg)としての免疫細胞、好酸球、前駆脂肪細胞、線維芽細胞からなる不均一な細胞集団を含む間質血管分画(SVF)と呼ばれる非脂肪細胞分画で構成されており、血管組織や結合組織に囲まれています1,2。.現在、脂肪組織(AT)は、アディポカイン、サイトカイン、マイクロRNAを介して代謝と炎症に関連する生理学的プロセスを調節する器官と見なされており、さまざまな細胞によって組織に生成および放出され、自己分泌、パラクリン、および内分泌の影響を受けます3,4。ヒトでは、白色脂肪組織は皮下脂肪組織(SAT)と内臓脂肪組織(VAT)で構成され、それらの間には重要な解剖学的、分子的、細胞的、および生理学的違いがあります2,5。SATはヒトのATの最大80%を占めていますが、VATは腹腔内、主に腸間膜と大網にあり、代謝的により活発です6。さらに、VATはメディエーターを分泌する内分泌器官であり、体重、インスリン感受性、脂質代謝、炎症に大きな影響を与えます。その結果、VATの蓄積は、腹部肥満や、2型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧、心血管疾患リスクなどの肥満関連疾患につながり、肥満関連死亡率のより良い予測因子となります6,7,8,9。
恒常性維持状態では、脂肪細胞、マクロファージ、およびその他の免疫細胞が協力して、抗炎症メディエーターの分泌を介してVAT代謝を維持します10。しかし、VATを過度に拡大すると、活性化T細胞、NK細胞、マクロファージの動員が促進されます。実際、除脂肪VATでは、マクロファージの比率は5%ですが、肥満ではこの比率が最大50%まで上昇し、マクロファージが抗炎症性から炎症誘発性の表現型に二極化し、慢性炎症環境を生成します10,11。
肥満のパンデミックの結果として、脂肪細胞生物学、エピジェネティクス、炎症、内分泌特性、細胞外小胞などの新興領域など、さまざまなVAT研究トピックを扱う驚くべき数の報告が発生しています8,10,12,13。しかし、VAT環境は脂肪細胞と常在マクロファージまたは到着マクロファージとの間のクロストークによって定義されますが、ほとんどの研究は1つの細胞集団のみに焦点を当てており、VATにおけるこれらの細胞の相互作用とその病態生理学的影響に関する情報はほとんどありません11,14。さらに、ATにおける脂肪細胞とマクロファージの相互作用に対処する貴重な研究は、in vivoプライミング条件を欠いた細胞株を使用して行われました11,14,15。VATにおけるこれらの細胞の相互作用または特定の寄与を解剖する適切な戦略では、VAT代謝を調節するin vivo特性を可能な限り類似したin vitroアッセイを実施するために、同じ脂肪生検から両方の細胞タイプを単離する必要があります。
ATを破壊する機械的力に基づく非酵素的解離法は、最小限の操作を保証しますが、酵素法と比較して細胞回収効率が低く、細胞生存率が低く、より多くの組織が必要になるため、SVF細胞を研究することを目的としている場合は使用できません16,17。.コラゲナーゼを用いた酵素消化は、WAT18などの線維組織のコラーゲンや細胞外マトリックスタンパク質を適切に消化できる穏やかな方法であり、トリプシンが効果がない、または損傷を与える場合によく使用される19。プロトコルはコラゲナーゼの酵素の消化力の技術を使用して単一のプロセスの人間のVATのバイオプシーから実行可能な成長した脂肪細胞そしてSVFのセルの有効な隔離のための基本的なトラブルシューティングの指針を、与える下流の表現の適用のためのmicroRNAsを含む成長した脂肪細胞からの総RNAの高収率(量、純度および完全性)を、保障するために情報を提供する。同時に、プロトコルは、フローサイトメトリー20によるさらなる分析のために、複数の膜結合マーカーの染色を通じてSVF細胞からのマクロファージサブセットを識別するように最適化されています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 mL PCR tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>PCR-02-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS4101-50EA</td>
			<td>Individually plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-L-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R-S</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-200-C</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L universal pipet tip</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-Y-R</td>
			<td>RNase, DNase free and nonpyrogenic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2101 Bioanalyzer PC</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2953CA</td>
			<td>2100 Expert Software pre-installed in PC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352003&#160;</td>
			<td>Snap cap, sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430828-100EA</td>
			<td>Polipropilene, conical bottom and sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid-guanidinium-phenol based reagent</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2050-1-200</td>
			<td>TRI Reagent or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Small RNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1548</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cy7 anti-human CD14 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>325620</td>
			<td>0.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>250 ml, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3912-100G</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 5.2, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip priming station</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5065-9951</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101-015</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA Miniprep</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R2051</td>
			<td>Supplied with 50 mL TRI reagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Steel, serrated jaws and round ends</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td>200&#160;proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Flow Sheath Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>342003</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Lysing Solution</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>349202</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III Flow Cytometer/Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>648282</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FASCDiva Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>642868</td>
			<td>Software v6.0 pre-installed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629-1EA</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual cell counter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo dissecting scisors</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Stainless steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND2000LAPTOP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Adjustable temperature and speed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P10&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642040</td>
			<td>1 to 10 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P1000&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642090</td>
			<td>100 to 1000 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642010</td>
			<td>0.2 to 2 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P200&#160;variable volume&#160;micropipette&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific-Finnpipette</td>
			<td>4642080</td>
			<td>20 to 200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube storage rack</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>R96PCRFSP</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-human HLA-DR Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>307608</td>
			<td>0.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy7 anti-human CD45 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304016</td>
			<td>0.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td>Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette controller</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cells Lysis Buffer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 814 389 001</td>
			<td>For preferential lysis of red blood cells from human whole blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Whit adapter for 50 mL conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Specimen container</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Scientific-Samco</td>
			<td>204-1S</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For different tube sizes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mini Shaker</td>
			<td>Cientifica SENNA</td>
			<td>BV101</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for rna analysis and macrophage phenotyping

内臓脂肪組織(VAT)は、主に成熟脂肪細胞と間質血管分(SVF)細胞で構成される活発な代謝器官であり、代謝、ホルモン、および免疫プロセスを制御するさまざまな生理活性分子を放出します。現在のところ、これらのプロセスが脂肪組織内でどのように制御されているかは不明です。したがって、脂肪組織の病態生理学に対する各細胞集団の寄与を評価する方法の開発は非常に重要です。このプロトコルでは、単離手順を説明し、コラゲナーゼ酵素消化技術を使用して、単一のプロセスでヒトVAT生検から生存可能な成熟脂肪細胞およびSVFを効率的に分離するために必要なトラブルシューティングガイドラインを提供します。さらに、プロトコルはまたマクロファージのサブセットを識別し、これらのセル集団間の相互作用を解剖する調査を行うことを可能にする遺伝子発現の調査のための成熟した脂肪細胞のRNAの隔離を行うために最大限に活用される。簡単に言うと、VAT生検を洗浄し、機械的に細かく刻み、消化して単一細胞懸濁液を生成します。遠心分離後、成熟脂肪細胞は浮遊選鉱によりSVFペレットから単離されます。RNA抽出プロトコルは、下流の発現アッセイのために脂肪細胞からの総RNA(miRNAを含む)の高収率を保証します。同時に、SVF細胞を使用して、フローサイトメトリー解析を通じてマクロファージサブセット(炎症誘発性および抗炎症性表現型)を特徴付けます。

このプロトコルは部分的なomentectomyの後で健康な妊婦から得られるVATのバイオプシーから、単一のプロセスで、実行可能な成熟した脂肪細胞およびSVFのセルを隔離するために差動遠心分離に続くコラゲナーゼの消化力を使用して酵素方法を記述する。この場合、RNA抽出には脂肪細胞を、マクロファージ表現型にはSVFを使用します。
RNA抽出プロトコルにより、成熟脂肪細胞...

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Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。

RNA解析およびマクロファージ表現型解析に適したヒト内臓脂肪組織からの生存脂肪細胞および間質血管画分の単離

Visceral adipose tissue (VAT) is an active metabolic organ composed mainly of mature adipocytes and stromal vascular fraction (SVF) cells, which release ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

3.5K ビュー.  Instituto Nacional de Perinatologia. このプロトコルは脂肪細胞から良質のRNAを得る方法論および流れのcytometryによって分析のための多数の膜区切られたマーカーの汚損によってSVFマクロファージの表現型化を含む単一のプロセスの人間の内臓の脂肪からの生存可能な脂肪細胞そして間質の管の部分SVFのセルの隔離に有効なコラゲナーゼの消化力方法を提供する。

ビデオ: Isolation of Viable Adipocytes and Stromal Vascular Fraction from Human Visceral Adipose Tissue Suitable for RNA Analysis and Macrophage Phenotyping

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 diabetic islets from organ donors2. Here we share our protocol for isolating islets from human pancreatic tissue obtained from type 2 diabetic and non-diabetic patients who have undergone partial pancreatectomy due to different pancreatic diseases (benign or malignant pancreatic tumors, chronic pancreatitis, and common bile duct or duodenal tumors). All patients involved gave their consent to this study, which had also been approved by the local ethics committee. The surgical specimens were immediately delivered to the pathologist who selected soft and healthy appearing pancreatic tissue for islet isolation, retaining the damaged tissue for diagnostic purposes. We found that to isolate more than 1,000 islets, we had to begin with at least 2 g of pancreatic tissue. Also essential to our protocol was to visibly distend the tissue when injecting the enzyme-containing media and subsequently mince it to aid digestion by increasing the surface area.
To extend the applicability of our protocol to include the occasional case in which a large amount (&gt;15g) of human pancreatic tissue is available , we used a Ricordi chamber (50 ml) to digest the tissue. During digestion, we manually shook the Ricordi chamber3 at an intensity that varied by specimen according to its level of tissue fibrosis. A discontinous Ficoll gradient was then used to separate the islets from acinar tissue. We noted that the tissue pellet should be small enough to be homogenously resuspended in Ficoll medium with a density of 1.125 g/ml. After isolation, we cultured the islets under stress free conditions (no shaking or rotation) with 5% CO2 at 37 &deg;C for at least 48 h in order to facilitate their functional recovery. Widespread application of our protocol and its future improvement could enable the timely harvesting of large quantities of human islets from diabetic and clinically matched non-diabetic subjects, greatly advancing type 2 diabetes research.

The supply of type 2 diabetic islets for research is insufficient. Here we share our protocol for isolating islets from patients undergoing partial pancreatectomy. This approach represents a unique venue for obtaining islets from type 2 diabetic and clinically matched non-diabetic subjects in adequate numbers for basic and clinical studies.

部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

医学

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular weight metabolites in tissues of the treated host to achieve long-term survival. The semipermeable membrane allows engrafted encapsulated cells to avoid rejection by the immune system. The encapsulation procedure was designed to enable a controlled release of bioactive compounds, such as insulin, other hormones, and cytokines. Here we describe a method for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production and energy dissipation (thermogenesis) in the intra-abdominal adipose tissue of obese mice. Encapsulation of thermogenic catabolic cells may be potentially applicable to the prevention and treatment of obesity and type 2 diabetes. Another potential application of catabolic cells may include detoxification from alcohols or other toxic metabolites and environmental pollutants.

Here, we present a protocol for encapsulation of catabolic cells, which consume lipids for heat production in intra-abdominal adipose tissue and increase energy dissipation in obese mice.

移植のためのカプセル化サーモ前脂肪細胞の脂肪組織デポへ

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Stromal Vascular Fraction-enriched Fat Grafting for the Treatment of Symptomatic End-neuromata

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a novel treatment of symptomatic end-neuromata of peripheral sensory nerves, and in this study, specifically of the superficial branch of the radial nerve (SBRN). Despite a multitude of existing treatments, persistent postoperative pain and common pain relapse are still very common, independent of the procedure assessed. The neuroma is microsurgically excised accordingly to standardized protocol. Instead of the relocation of the regenerating nerve stump in neighboring anatomical structures, such as muscle or bone, a fat graft is applied perifocally and acts as a mechanical barrier. In order to reduce the fat resorption rate and boost the regenerative potential of the graft, the highly concentrated SVF is integrated in the grafting. The SVF is isolated from subcutaneous fat by enzymatic and mechanic separation of the lipoaspirate by a specific commercial isolation system. The SVF-enriched fat graft provides both a mechanical barrier and various biological effects at the cellular level, including improving angiogenesis, inflammation, and fibrosis. Both mechanical and biologic effects help to reduce the disorganized axonal outgrowth of the nerve stump during nerve regeneration and hence prevent the recurrence of painful end-neuromata.

The purpose of the study is to illustrate the technical procedure of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a novel treatment of symptomatic end-neuromata. This technique provides advantages of both the mechanical barrier and the biological action at the cellular level by the processed and concentrated SVF.

間質血管分数濃縮脂肪移植症候性の終わり neuromata の治療のため

The purpose of this study was to methodically illustrate and highlight the crucial steps of stromal vascular fraction (SVF)-enriched fat grafting as a ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

顕微鏡を用いたひと脂肪組織血管機能評価

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the knees by using different forms of mesenchymal stem cells (MSCs). In Korea, bone marrow concentrates and cord blood-derived stem cells have been approved by the Korean Food and Drug Administration (KFDA) for cartilage regeneration. In addition, an adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) has been allowed by the KFDA for joint injections in human patients. Autologous adipose tissue-derived SVF contains extracellular matrix (ECM) in addition to mesenchymal stem cells. ECM excretes various cytokines that, along with hyaluronic acid (HA) and platelet-rich plasma (PRP) activated by calcium chloride, may help MSCs to regenerate cartilage and improve knee functions. In this article, we presented a protocol to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with OA. The result of the protocol was first reported in 2011 followed by a few additional publications. The protocol involves liposuction to obtain autologous lipoaspirates that are mixed with collagenase. This lipoaspirates-collagenase mixture is then cut and homogenized to remove large fibrous tissue that may clog up the needle during the injection. Afterwards, the mixture is incubated to obtain adipose tissue-derived SVF. The resulting adipose tissue-derived SVF, containing both adipose tissue-derived MSCs and remnants of ECM, is injected into knees of patients, combined with HA and calcium chloride activated PRP. Included are three cases of patients who were treated with our protocol resulting in improvement of knee pain, swelling, and range of motion along with MRI evidence of hyaline cartilage-like tissue.

Here, we present a protocol to produce an adipose tissue-derived stromal vascular fraction and its application to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with osteoarthritis.

潜在的な軟骨再生のための脂肪組織由来間質血管分数の生産の臨床プロトコル

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem cells can be obtained from different tissues and several methods for isolation have been described. The presented method for the isolation of adipose-derived regenerative cells (ADRCs) can be used within many therapeutic areas because the method is a general procedure and, therefore, not limited to erectile dysfunction (ED) therapy. ED is a common and serious side effect to radical prostatectomy (RP) since ED often is not well treated with conventional therapy. Using ADRC&#8217;s as treatment for ED has attracted great interest due to the initial positive results after a single injection of cells into the corpora cavernosum. The method used for the isolation of ADRC&#8217;s is a simple, automated process, that is reproducible and ensures a uniform product. Furthermore, the sterility of the isolated product is ensured because the entire process takes place in a closed system. It is important to minimize the risk of contamination and infection since the stem cells are used for injection in humans. The whole procedure can be done within 2.5-3.5 hours and does not require a classified laboratory which eliminates the need for shipping tissue to an off-site. However, the procedure has some limitations since the minimum amount of drained lipoaspirate for the isolation device to function is 100 g.

Precise disclosure of methods and protocols is crucial for large scale uptake of stem cell therapies. Here, we present a protocol to isolate adipose-derived regenerative cells, used for a single intracavernous injection as treatment of erectile dysfunction (ED) following radical prostatectomy (RP).

根治的前立腺切除術後の勃起不全治療のための脂肪由来再生細胞の単離

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible source for regenerative clinical applications. Different protocols have been used to obtain adipose-derived stem cells. This article describes different steps of an improved time-saving protocol to obtain a more significant amount of ADSC, showing how to cryopreserve and thaw ADSC to obtain viable cells for culture expansion. One hundred milliliters of lipoaspirate were collected, using a 26 cm three-hole and 3 mm caliber syringe liposuction, from the abdominal area of nine patients who subsequently underwent elective abdominoplasty. The stem cells isolation was carried out with a series of washes with Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) solution supplemented with calcium and the use of collagenase. Stromal Vascular Fraction (SVF) cells were cryopreserved, and their viability was checked by immunophenotyping. The SVF cellular yield was 15.7 x 105 cells/mL, ranging between 6.1-26.2 cells/mL. Adherent SVF cells reached confluence after an average of 7.5 (&#177;4.5) days, with an average cellular yield of 12.3 (&#177; 5.7) x 105 cells/mL. The viability of thawed SVF after 8 months, 1 year, and 2 years ranged between 23.06%-72.34% with an average of 47.7% (&#177;24.64) with the lowest viability correlating with cases of two-year freezing. The use of DPBS solution supplemented with calcium and bag resting times for fat precipitation with a shorter time of collagenase digestion resulted in an increased stem cell final cellular yield. The detailed procedure for obtaining high yields of viable stem cells was more efficient regarding time and cellular yield than the techniques from previous studies. Even after a long period of cryopreservation, viable ADSC cells were found in the SVF.

The present protocol describes an improved methodology for ADSC isolation resulting in a tremendous cellular yield with time gain compared to the literature. This study also provides a straightforward method for obtaining a relatively large number of viable cells after long-term cryopreservation.

脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission due to the introduction of animal-derived products during in vitro manipulation. The xenogeneic components, such as collagenase or fetal bovine serum, commonly used during the cell isolation and expansion steps could be associated with the potential risks of immune reactivity or viral, bacterial, and prion infection in the receiving patients. Following good manufacturing practice guidelines, chemical tissue dissociation should be avoided, while fetal bovine serum (FBS) can be substituted with xenogeneic-free supplements. Moreover, to ensure the safety of cell products, the definition of more reliable and reproducible methods is important. We have developed an innovative, completely xenogeneic-free method for the isolation and in vitro expansion of human adipose-derived stem cells without altering their properties compared to collagenase FBS-cultured standard protocols. Here, human adipose-derived stem cells (hASCs) were isolated from abdominal adipose tissue. The sample was mechanically minced with scissors/a scalpel, micro-dissected and mechanically dispersed in a 10 cm Petri dish, and prepared with scalpel incisions to facilitate the attachment of the tissue fragments and the migration of hASCs. Following the washing steps, hASCs were selected due to their plastic adherence without enzymatic digestion. The isolated hASCs were cultured with medium supplemented with 5% heparin-free human platelet lysate and detached with an animal-free trypsin substitute. Following good manufacturing practice (GMP) directions on the production of cell products intended for human therapy, no antibiotics were used in any culture media.

Xenogeneic (chemical or animal-derived) products introduced in the cell therapy preparation/manipulation steps are associated with an increased risk of immune reactivity and pathogenic transmission in host patients. Here, a complete xenogeneic-free method for the isolation and in vitro expansion of human adipose-derived stem cells is described.

ヒト異種異系フリーのヒト治療法によるヒト脂肪由来幹細胞の単離と培養

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Dermal Fibroblasts from Human Keloid Tissue

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of primary fibroblasts derived from keloid tissue are the basis for further studies of the biological function and molecular mechanisms of keloids, as well as new therapeutic strategies for treating them. The traditional method of obtaining primary fibroblasts has limitations, such as poor cellular state, mixing with other types of cells, and susceptibility to contamination. This paper describes an optimized and easily reproducible protocol that could reduce the occurrence of possible issues when obtaining fibroblasts. In this protocol, fibroblasts can be observed 5 days after isolation and reach nearly 80% confluency after 10 days of culture. Then, the fibroblasts are passaged and verified using PDGFR&#945; and vimentin antibodies for immunofluorescence assays and CD90 antibodies for flow cytometry. In conclusion, fibroblasts from keloid tissue can be easily acquired through this protocol, which can provide an abundant and stable source of cells in the laboratory for keloid research.

This study describes an optimized protocol for establishing primary fibroblasts from keloid tissues that can effectively and steadily provide pure and viable fibroblasts.

ヒトケロイド組織からの初代皮膚線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

Fibroblasts, the major cell type in keloid tissue, play an essential role in the formation and development&#160;of keloids. The isolation and culture of ...