我々は、プロジェクトのさまざまな段階で助け、アドバイスと重要な入力を提供する私たちの多くの同僚に感謝したいと思います。このビデオの記事の生産は、教育と研究のためのドイツ省（BMBF）から糖尿病研究のためのドイツ語センター（DZDへの資金でサポートされていました<a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> IMIDIA（、） <a href="http://www.imidia.org">のhttp://www 。imidia.org</a> ）と技術ドレスデンの大学の大学病院カールグスタフケーラス。これらの結果につながる研究は、助成金協定N ° 115005の下で革新的医学イニシアティブに関する欧州共同体の第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）から資金を受けています。

1。手術室における膵組織のコレクション<ol><li>外科医は、膵臓の部分切除を行います。 </li><li>氷の上にボックスで膵臓試料を配置した後、病理医にすぐにそれを提供します。 </li></ol> 2。膵島分離のための組織の選択<ol><li>病理医は、診断目的のために損傷した組織を維持し、柔らかで健康的に表示される組織を選択します。線維化組織と使用可能な組織の未満2gを提供する標本は膵島分離から除外されます。 </li><li>ユーロコリンズ液における膵組織を浸漬し、実験室に氷の上で実現。 </li></ol> 3。ヒト膵島の単離<ol><li>膵臓の組織を比較検討し、10cmの皿に入れてください。 </li><li> 500mlのフラスコに150ミリリットルRPMI培地を入れて。 </li><li> 250mlのフラスコに、100 mg / mlのDNaseおよび5mg/mlリベラーゼRIの20mlで130ミリリットルRPMI媒体を組み合わせることにより、消化酵素溶液を調製。膵臓の組織を注入するシリンジにこの溶液10mlを描く。 </li><li>均一に膨張させることを目指し、膵組織に消化酵素溶液を注入。これは線維化が禁止されている場合は、消化が失敗する可能性があります。次に、〜4ミリメートル氷の上に3つの部分にティッシュを飾らない。 </li></ol> 4。ヒト膵臓の消化回路<ol><li>図1に示すように、消化の回路を組み立てます。 Ricordiのチャンバ内の流れ方向は、チャンバーの上部の底とアウト時になります。 </li><li> 300mlの総容積を500 mlのフラスコに、残りの消化酵素溶液を追加し、温度計を挿入する。 </li><li> 、チャンバー内に膵組織を転送するメッシュ（孔径：600μm）を挿入する三窒化ケイ素ビー玉（直径：15 mm）を、チャンバーを閉じ、140ml /分で設定流量でポンプを起動します。 </li><li>回路の温度が37℃に達すると、タイミングを開始し、定期的に消化を停止する時期を決定するためにサンプルを取る。ジチゾン（濃度2μg/ ml）で染色すると消化された組織4内の膵島の微視的な可視化が可能になります。 </li><li>小島が周囲の腺房組織から分離されると、氷の上で加熱コイルを配置し、回路へのコールド洗浄媒体200mlの（5.5 mMグルコース及び10％FBSと900ミリリットルRPMI 1640）を追加することで消化を迅速に停止する。 </li><li>それはサンプルチューブから出てくると250 mlコニカルチューブに膵島ソリューションを収集する。回路が空になるまで続けます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" /> 図1。三窒化ケイ素のビー玉（直径：15ミリメートル）： ヒト膵臓の消化回路は、ヒト膵臓の消化回路は、メッシュ（600μmの孔径）を含むRicordiのチャンバーが含まれています。チャンバーからの流出は、蠕動ポンプ（140ml /分）により、組織のコレクションのフラスコに駆動されます。矢印は流れ方向を示している。酵素消化のための最適温度は37℃の水浴中で加熱コイルを浸漬することにより維持されています。 5。後の消化を洗浄<ol><li> 5分間1000rpmで膵島ソリューション、4 ° Cを含む250ミリリットルコニカルチューブを遠心する。 </li><li>上清を捨て、（5.5 mMグルコース及び10％FBSを900ミリリットルRPMI 1640）洗浄媒体の膵島ペレットを再懸濁し、50 mlコニカルチューブに等しい分数にそれを配布する。 （オプション：洗濯を向上させるために追加のコニカルチューブに配布します。）遠心は1000rpmで、4℃で5分間Cを。 </li><li>上清を捨て、軽くマニュアル揺れによってペレットを緩めます。 </li></ol> 6。フィコール勾配で精製<ol><li> 1.125グラム/ mlの、pH7.4の密度でフィコールメディアでペレットを再懸濁し、ゆっくり1.080、1.060および1.037グラム/ mlの密度でフィコールメディアを10mlのアリコートを重ねます。 </li><li> 20分間4℃、2400 rpmでフィコール勾配を遠心分離します。 </li></ol> 7。膵島コレクションと文化<ol><li>遠心分離後、別の組織成分は勾配で、そのパーティションで区別することができます。 </li><li>脂肪と結合組織から成る上部層を捨てる。 </li><li>慎重に1.037〜1.060グラム/ mlの相間での膵島集合体の最初の層を収穫。この層は最も純粋な孤立した島が含まれています。効率的な分離のために別々の画分を集める。 </li><li> 1.060〜1.080グラム/ mlの間期における膵島集合体の第二、少ない純粋なフラクションを集める。 </li><li> 50mlの合計量にそれぞれのコニカルチューブに（5.5 mMグルコース及び10％FBSを900ミリリットルRPMI 1640）を洗浄するメディアを追加することにより、フィコール勾配を希釈する。 1000rpmで遠心、5分間4℃。 </li><li>吸引により上清を捨てる。ペレットはルーズフィコール勾配が原因である可能性があるので注意してください。 </li><li>ペレットwiを洗う番目の洗浄媒体（5.5 mMグルコース、10％FBSと900ミリリットルRPMI 1640）と1000 rpmで遠心、4℃で5分間。膵島培養培地を用いて繰り返す</li><li>培地で島を再懸濁し、37℃5％CO 2でインキュベーターの中に置いてください° Cをさらに処 ​​理する前に、24〜48時間。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes:+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality.">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li><li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects.">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li><li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets.">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li><li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets.">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li><li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., J&#228;ger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients.">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li><li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pancreatic+diabetes+(type+3c+diabetes)+underdiagnosed+and+misdiagnosed?.">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?.</a> Diabetes Care. 31, S165-S169 (2008).</li><li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus.">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, S7-S12 (2008).</li><li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin,+GAD,+and+ICA512bdc/IA-2+autoantibodies.">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li><li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition,+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1:+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation.">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li><li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+of+Purified+{beta}-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection.">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちのプロトコルを使用して、ヒト膵島は、膵部分切除から収集した膵臓組織から単離することができる。このプロトコルの成功は、いくつかの重要なポイントの間に取られた心配に依存しています。 β-細胞生存率を維持するために、それは、試験片を実験室に氷上で急速に輸送されることが不可欠です。さらに、組織の消化の期間は、組織の線維化とメディアの酵素活性の等級に応じて経験的に最適化する必要があります。これはRicordiのチャンバーに手動で適用される機械的な力の程度についても同様です。したがって、良好な膵島収量を得るために、プロトコルは最適​​な、専用の科学者や技術アシスタントによって実行されます。チームはすでに膵島分離に経験されていない限り、初期不良が主流です。 私たちの膵島分離プロトコルと標準的なヒト膵島分離法の主な違いがあります：1）我々は手術中に虚血の数時間を受けた膵臓組織を使用していますが、それはすぐにサイト上で処理されますが。これは、割り当ておよび膵島分離施設への納入時に数時間のために虚血性のまま膵臓/膵島移植のための脳死患者からの外植膵臓とは対照的です。標準プロトコルは、膵管にそれを注入することであるのに対し、2）我々は、膵臓の組織に直接コラゲナーゼを注入する。 3）我々は、代わりにCOBEセルのプロセッサを使用して連続フィコール勾配から膵島を集めるの不連続フィコール勾配を使って島を区切ります。 手術標本があまりにも線維性または膵島の十分な数を単離するための不足しているケースでは、組織はまだレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）10によって取得することができます。これは、膵島分離に失敗した場合でも、遺伝子発現データは、ほぼすべての試料から回収することができますまたは収率が非常に低いです。残念ながら、LCMは、機能的な研究のために生きている細胞を生成しませんし、その量は、プロテオーム解析のための一般的には不十分である。このように、膵島を取得するために私たちのコラゲナーゼ消化プロトコルと並行してLCMを使用すると手術標本を処理するために最も効果的な方法かもしれない。 部分的pancreatectomiesからの膵島分離のために組織を収集する場合、それは患者の病歴や代謝の状態を慎重に調べることが重要です。部分的に膵臓を摘出された患者は、型3C糖尿病、手術6につながる膵臓疾患に続発すなわち糖尿病の影響を受ける可能性があります。 2010年に当科でこの手術を受けた43参加した患者のうち、32は非糖尿病だった、5は2型糖尿病の影響を受け、6種類3C糖尿病を持っていた。これらのデータは、グルコース代謝の障害と膵癌や慢性膵炎6から患っている患者のかなりの割合で糖尿病を指している以前の研究に同意する。それは膵臓の手術7につながる症状の発症前に少なくとも一年と診断された場合、我々は、一次起源であることが糖尿病を考慮。膵島自己抗原に対する抗体のレベルはまた、糖尿病8の潜在的な自己免疫の起源を評価するために測定する必要があります。膵切除術を受けた患者は、未診断の糖尿病を患うまたはグルコース不耐症になる可能性があるため、すべての非糖尿病患者は膵切除9以前に経口ブドウ糖負荷試験を付与する必要があります。

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><th>機器</th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR） </td><td>グライナーバイオワン</td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR） </td><td>グライナーバイオワン</td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR） </td><td>グライナーバイオワン</td><td> 760180 </td></tr><tr><td> 10mlのシリンジ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50mlのシリンジ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 mlのシリンジ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2ニードルMicrolance 3 </td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2ニードル</td><td>ブラウン</td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4ニードルMicrolance 3 </td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3cmの細胞培養ディッシュ2 × 2 mmの格子</td><td>ヌンク</td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20cmの組織培養皿</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6センチメートルイージーグリップのペトリ皿</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150mlのストレージのボトル</td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250ミリリットルの三角フラスコ</td><td>ショットデュラン</td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500mlエルレンマイヤーフラスコ</td><td>ショットデュラン</td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250mlのスクリューキャップコニカル遠心分離管</td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50mlファルコンコニカルチューブ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260ミリリットルEasyflask非処理</td><td>ヌンク</td><td> 156800 </td></tr><tr><td>マイレクスGVフィルターユニットDuropore（0,22μM） </td><td>ミリポア</td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td>ボトルトップ吸引フィルター（PES 70ミリメートル直径Membran、0,22μmの孔径、45 mmの首のサイズ、500mLの容積） </td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 431118 </td></tr><tr><td>濃度計（Densito 30pxの）LWE37463 </td><td>メトラートレド</td><td> 51324450 </td></tr><tr><td>高速PESフィルターユニット0,2μmの</td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td>加熱コイル</td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> HC - 02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS - R </td><td>ヘレウス</td><td> 75015680 </td></tr><tr><td>ポンプ（標準）PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordiのチャンバー（600μmの孔径を持つ金属製のメッシュ） </td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td>モデル50 - U - 01、シリアル0503から001 </td></tr><tr><td>準備スタンド</td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> 50 - PS - 01 </td></tr><tr><td> O -リング</td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> OR - 50 - U - 01 </td></tr><tr><td>窒化ケイ素のビー玉（9、15 mmのセット） </td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> SN - 01 </td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>タイゴン</td><td> R 3603 8,0 X4、0ミリメートル</td></tr><tr><td>手術用鉗子</td><td>ブラウン</td><td> BD168R </td></tr><tr><td>外科はさみ（Aesculap） </td><td>ブラウン</td><td> BC273R </td></tr><tr><td>水浴OLS 200 </td><td>グラント</td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th>試薬</th><th></th><th></th></tr><tr><td>コラゲナーゼ - &gt;リベラーゼのRI（100 mg）を</td><td>ロッシュ</td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D（+） - グルコース</td><td>メルク</td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>メルク</td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone（DTZ） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNアーゼI（100 mg）を</td><td>ロッシュ</td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA研究所</td><td> H15 - 002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> PAA研究所</td><td> A15 - 101 </td></tr><tr><td>フィコール400 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F9378 </td></tr><tr><td>胎児ウシ血清（FBS） </td><td>ギブコ</td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - （4 - （2 - ヒドロキシエチル） - 1 - ピペラジニル）- ethansulfons‰URE（HEPES） </td><td>ロート</td><td> 9105.3 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、5 M </td><td>臨床薬学、病院</td><td> - </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン（100倍） </td><td> PAA研究所</td><td> P11 - 010 </td></tr><tr><td> Pipettaid（EXPRESS） </td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlo​​rid </td><td>フルカ</td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate無水</td><td> JTベイカー</td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JTベイカー</td><td> 3246〜01 </td></tr><tr><td> RPMI培地1640 [ - ] D -グルコース[+] L -グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI培地1640 [+] L -グルタミン</td><td> PAA研究所</td><td> E15 - 840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td>メルク</td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> メディアとソリューションジチゾン溶液<ul><li> 10ミリリットルのDMSOに100 mgのDTZを溶かし、40 mlのPBSで希釈</li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>酵素ソリューション<ul><li> 20ミリリットルRPMI 1640培地中に100 mgのリベラーゼRIを（サプリメントなしで）溶かす</li><li> （サプリメントなし）を1ml RPMI 1640培地で100mgのDNaseを溶かす</li><li>滅菌フィルターソリューション（0.22μm）と氷上で酵素を保つ</li></ul>ウォッシュメディア（1000ml/5.5mMグルコース） <ul><li> 100ミリリットルFBSを（熱不活性化）に溶かし</li><li> 450ミリリットルRPMI 1640（無糖）を追加</li><li> 450ミリリットルRPMI 1640（11 mMグルコース）を追加する</li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>膵島培養培地（5,5 mMグルコース/ 500ミリリットル） <ul><li> 10ミリリットル1M HEPES（pH7.4）を溶解する</li><li> 50ミリリットルFBSを追加</li><li> 5ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシンを（100倍）を追加</li><li> 2.75ミリリットル1 Mグルコース溶液を追加</li><li> 432.25ミリリットルRPMI 1640（無糖）を追加</li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>ユーロコリンズ液<ul><li> 4083グラムのカリウムの水素</li><li> 70,0 gのグルコース</li><li> 2237グラムの塩化カリウム</li><li> 14,80 gのカリウム一水素</li><li> 1680グラムの炭酸水素ナトリウム</li><li> 40mlの電解質溶液（E 154） </li><li> pH7.4の</li><li> 2000ミリリットルの蒸留水を追加します。 </li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>フィコールストック溶液<ul><li> 500グラムフィコールにユーロコリンズ液1000 mlを加え</li><li> 8.94グラムのHEPESを追加</li><li>フィコールが解決するまで一晩撹拌する</li><li> pH7.4の</li><li>密度を測定</li></ul>フィコール勾配<ul><li>密度に応じてFBSの量、ユーロコリンズ液やフィコールストックソリューションを計算する</li><li> 3ソリューションを組み合わせて、濃度計で濃度を測定</li><li>密度が調整されるまで、ユーロコリンズ液やフィコールストックソリューションを追加します。 </li><li>滅菌フィルタ4での解（0.22μm）とストアは、° C </li></ul>

isolation of human islets from partially pancreatectomized patients

2型糖尿病とランゲルハンス故障1の島の病因の調査は、臓器提供者2からの2型糖尿病膵島の限られた可用性によって妨げられている。ここでは、2型糖尿病と異なる膵疾患（良性または悪性膵腫瘍、慢性膵炎、および総胆管や十二指腸腫瘍）による膵部分切除を受けた非糖尿病患者から得られたヒト膵組織からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有する。関係するすべての患者はまた、地元の倫理委員会によって承認されていたこの研究に同意を与えた。手術標本は、直ちに診断目的のために損傷した組織を維持し、膵島分離のために柔らかで健康的に出現する膵組織を選択した病理医に届けられました。我々は1,000以上の島を分離することがわかった、我々は、膵組織の少なくとも2gを開始しなければならなかった。我々のプロトコルにも不可欠の酵素含有培地を注入するときに目に見えて組織を膨張させると、続いて表面積を増やすことによって消化を助けるためにそれをミンチにしました。 ヒト膵臓組織の大量（&gt; 15グラム）が使用できる偶発症例を含めるために、我々のプロトコルの適用性を拡張するために、我々は組織を消化するためにRicordiのチャンバー（50ml）を使用。消化中に、我々は、手動で組織の線維化のそのレベルに応じて試料によって変化する強度でRicordiのチャンバ3を横に振った。不連続フィコール勾配は、その後、腺房組織から膵島を分離するために使用されていました。我々は、組織ペレットが均一に1.125グラム/ mlの密度でフィコール培地に再懸れるのに十分小さくする必要があることに注意。単離後、我々は彼らの機能回復を促進するために、少なくとも48時間、37時、5％CO 2でストレスフリーの条件（無揺れや回転）° C下で膵島を培養。我々のプロトコルとその将来の改良の広範なアプリケーションが大幅に2型糖尿病の研究を進め、糖尿病と臨床的にマッチした非糖尿病患者からヒト膵島の大量のタイムリーな収穫を有効にすることができます。

これは非常に大きく線維化とコラゲナーゼ活性の違いに起因する準備の間で変化が我々のプロトコルには、膵組織のグラムあたり〜500膵島の平均が得られた。私たちは、その後24時間分離した後、それらをhandpicking、組織の処理中に、ジチゾンを持つ最初の染色により&gt; 90％の膵島の純度を達成しました。精製された膵島の品質を決定するために、我々は、2時間静置条件下で25 mMのグルコース刺激によるインスリン分泌のためにテストされています。我々はECIT膵島分離および移植センターから得られた島に匹敵するインスリンの分泌を発見した。部分的に膵臓を摘出された膵臓から分離された島が膵島移植のために意味されないので、合計IEQのアセスメントは重要な要因であると考えられていなかった。 重要なことは、私たちの方法は、私たちは2005年から2008年5〜25部分的な膵臓を摘出された患者からの機能研究のために膵島を分離することができました。これらの島は、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によってグルコース刺激インスリン分泌および特定のタンパク質の発現について分析した。部分的にpancreatecomized膵臓から分離した膵島を、また、非糖尿病および糖尿病膵島の超微細構造外観と機能的反応を遺伝子やタンパク質発現プロファイルを比較するために使用することができる。臓器のドナーが存在するよりも、膵部分切除を受けて、より多くの患者が存在するため、我々のプロトコルは、十分なサンプルとデータを堅牢な統計分析のために収集される可能性があります。

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Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

研究のための2型糖尿病膵島の供給が不十分です。ここでは、膵部分切除を受けた患者からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有しています。このアプローチは、2型糖尿病と基礎および臨床研究のための十分な数の臨床的にマッチした非糖尿病患者からの膵島を得るためのユニークな会場を表します。

部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離

Investigations into the pathogenesis of type 2 diabetes and islets of Langerhans malfunction 1 have been hampered by the limited availability of type 2 ...

isolation-of-human-islets-from-partially-pancreatectomized-patients

Research

JoVE Journal

Medicine

15.9K ビュー.  University Hospital Carl Gustav Carus, University of Technology Dresden. 研究のための2型糖尿病膵島の供給が不十分です。ここでは、膵部分切除を受けた患者からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有しています。このアプローチは、2型糖尿病と基礎および臨床研究のための十分な数の臨床的にマッチした非糖尿病患者からの膵島を得るためのユニークな会場を表します。

ビデオ: Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

ヒト膵島の染色プロトコル

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

医学

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

手術標本からヒト膵島のレーザーマイクロダイセクションのために改良されたプロトコル

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Dynamic Visual Tests to Identify and Quantify Visual Damage and Repair Following Demyelination in Optic Neuritis Patients

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to assess changes in myelination at the central nervous system (CNS). However, standard measurements, including routine visual tests and MRI scans, are not sensitive enough for this purpose. We present two visual tests addressing dynamic monocular and binocular functions which may closely associate with the extent of myelination along visual pathways. These include Object From Motion (OFM) extraction and Time-constrained stereo protocols. In the OFM test, an array of dots compose an object, by moving the dots within the image rightward while moving the dots outside the image leftward or vice versa. The dot pattern generates a camouflaged object that cannot be detected when the dots are stationary or moving as a whole. Importantly, object recognition is critically dependent on motion perception. In the Time-constrained Stereo protocol, spatially disparate images are presented for a limited length of time, challenging binocular 3-dimensional integration in time. Both tests are appropriate for clinical usage and provide a simple, yet powerful, way to identify and quantify processes of demyelination and remyelination along visual pathways. These protocols may be efficient to diagnose and follow optic neuritis and multiple sclerosis patients.
In the diagnostic process, these protocols may reveal visual deficits that cannot be identified via current standard visual measurements. Moreover, these protocols sensitively identify the basis of the currently unexplained continued visual complaints of patients following recovery of visual acuity. In the longitudinal follow up course, the protocols can be used as a sensitive marker of demyelinating and remyelinating processes along time. These protocols may therefore be used to evaluate the efficacy of current and evolving therapeutic strategies, targeting myelination of the CNS.

Object From Motion (OFM) and Time-constrained stereo protocols are sensitive tools to identify monocular and binocular dynamic visual function deficits, which are uniquely affected in optic neuritis patients. Furthermore, these tests may be used as quantitative noninvasive tools to assess the extent of myelination along visual pathways.

視神経炎患者における脱髄次のVisual損傷と修復を特定し、定量化するために、動的なビジュアルテスト

In order to follow optic neuritis patients and evaluate the effectiveness of their treatment, a handy, accurate and quantifiable tool is required to ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Full-root Aortic Valve Replacement by Stentless Aortic Xenografts in Patients with Small Aortic Roots

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial valve might not meet the functional needs. The implantation of a too-small stented pericardial valve, leading to an effective orifice area indexed to a body surface area less than 0.85 cm2/m2, is regarded as prosthesis-patient mismatch (PPM). A PPM negatively affects the regression of left ventricular hypertrophy and thus the normalization of left ventricular function and the alleviation of symptoms. Persistent left ventricular hypertrophy is associated with an increased risk of arrhythmias and sudden cardiac death. In the case of predictable PPM, there are three options: 1) accept the PPM resulting from the implantation of a stented pericardial valve when comorbidities of the patient forbid the more technically demanding operative technique of implanting a larger prosthesis, 2) enlarge the aortic root to accommodate a larger stented valve substitute, or 3) implant a stentless biological valve or a homograft. Compared to classical aortic valve replacement with stented pericardial valves, the full-root implantation of stentless aortic xenografts offers the possibility of implanting a 3-4 mm larger valve in a given patient, thus allowing significant reduction in transvalvular gradients. However, a number of cardiac surgeons are reluctant to transform a classical aortic valve replacement with stented pericardial valves into the more technically challenging full-root implantation of stentless aortic xenografts. Given the potential hemodynamic advantages of stentless aortic xenografts, we have adopted full-root implantation to avoid PPM in patients with small aortic roots necessitating an aortic valve replacement. Here, we describe in detail a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses. Limitations of this technique and alternative options are discussed.

Full-root aortic valve replacement by stentless aortic xenograft is a viable option in patients with small aortic roots. We describe, a technique for the full-root implantation of stentless aortic xenografts, with emphasis on the management of the proximal suture line and coronary anastomoses, and discuss its limitations and alternative options.

小型大動脈瘤患者におけるステントレス大動脈異種移植による全大動脈弁置換術

In patients with small aortic roots who need an aortic valve replacement with biological valve substitutes, the implantation of the stented pericardial ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

用語胎盤の胎児膜から主のひと脱落膜細胞の分離

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

マウス モデルにおける膵島の門脈内移植

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...