ミトコンドリアは、好気性呼吸が可能な真核細胞の必須のオルガネラである。彼らの機能不全は、人間の病気のよく知られている原因です。ベーカーの酵母ミトコンドリアには、8つのタンパク質をコードする円形ゲノムが含まれています。
本ビデオでは、翻訳産物の放射性標識とゲル電気泳動によるその後の分離を通じて酵母ミトコンドリアにおけるタンパク質生合成をアッセイするプロトコルについて説明しました。この手順には、いくつかの主要な手順が含まれています。適切な培地で新鮮なプレートに冷凍ストック培養からストリーク酵母。
培養インキュベーターにプレートを30度30度24~48時間入れます。これらの培養物を15ミリリットルチューブの新鮮なストリークから2ミリリットルの培地で接種し、30度で200RPMで一晩撹拌してインキュベートする。600ナノメートルの波長で培養液の光学密度を測定する。
滅菌チューブの0.2吸収単位に相当する体積を室温で30秒間9,000 Gのパレット酵母細胞に取ります。この上清を捨てろ。5秒間渦を起させることで、0.5ミリリットルの無菌水で細胞を洗います。
9,000Gでパレット酵母細胞を室温で30秒間秒間用いた。上清を捨てます。新鮮なワイプ寒天培地の2ミリリットルで細胞を希釈します。
インキュベートエッジは、光密度が1.5から1.9の値に1.5から1.9に達するまで200 RPMと30度で撮影した。マイクロ遠心チューブ内の1つの光学ユニットに相当する培養体積を移動します。3000 G でチューブを 1 分間回転させます。
上清を捨てます。5秒間渦を起させることで、0.5ミリリットルの無菌水で細胞を洗います。9,000Gでのパレット酵母細胞を室温で30秒間、上清を捨てる。
無菌翻訳バッファーの 0.5 ミリリットルで酵母細胞を再中断します。.15ミリリットルのチューブに懸濁液を入れる。細胞懸濁液にシクロヘキシミドを加えて、細胞の翻訳を阻害するために200 RPMおよび30度で5分間の端のミリリットルインキュベートあたり0.2ミリグラムの最終濃度まで細胞懸濁液を加える。
25〜30に加えて、S35メチオニンのS35メチオニンの25〜30マイクロキュリーを細胞懸濁液に加え、200 RPMと30度で撮影した30分間のエッジをインキュベートします。ラベルなしの冷たいメチオニンとボリマイシンを加えて、200 RPMと30度で撮影した10分間のラベル付けインキュベートを停止します。9,000Gで30秒間遠心分離して酵母細胞を採取する。
5秒間渦を起させることで、0.5ミリリットルの無菌水で細胞を洗います。9,000Gでパレット酵母細胞を室温で30秒間秒間用いた。上清を捨てます。
75マイクロリットルのライシスバッファーをパレットに加え、渦を5~10秒間追加します。0.5モルトリスバッファーの0.5モルトリスバッファーの500マイクロリットルをpH 6.8で追加します。pH 6.8を使用します。
渦は簡単に。600マイクロリットルのメタノールをサンプルに加えます。5秒間渦。
サンプルにクロロホルムを150マイクロリットル加えます。5秒間渦。12,000 G.慎重にサンプラーでオパフェイスを捨てると、サンプルを2分間遠心分離します。
600マイクロリットルのメタノールをサンプルに加えます。チューブを数回反転して慎重に混ぜます。遠心分離機サンプルは12,000 G.Discard上清で2分間サンプルします。
空気は80度で2分間パレットを乾燥させます。沈殿タンパク質を60マイクロリットルのレムリサンプルバッファーに溶解します。サンプルを14度で10分間加熱します。
17.5%レムリSDSポリアクリルアミドゲルを引き起こす。各サンプルの15マイクロリットルをポケットに入れてください。青い染料がゲルリンパの約65%に達するまで、冷たい部屋でゲルを実行します。
クマシブリリアントブルーでゲルを染色し、負荷制御として必要とされるスキャンや写真を作ります。ゲルをゲル乾燥機で乾燥させます。蓄電池用蛍光体スクリーンを3~5日間カセットに入れておいてください。
蛍光体イメージャーで画面をスキャンします。上述のプロトコルに従って、我々は2つのサッカロミセスセレビシエ株からミトコンドリア翻訳産物を割り当てた。ミトコンドリア翻訳開始因子3をコードするAim23遺伝子の野生型および変異変異型欠失。
ミトコンドリア翻訳製品は、既に積極的に標識され、変性ポリアクリルアミドゲルで分離されました。サンプルは、時間コースを構築するために飽和の前に2分半ごとに収集されました。ゲルを染色し、乾燥させ、5日間の博覧会の後にスクリーニングした。
実験が成功した場合、画像は標準パターンに従って割り当てられた8つのバンドを示しています。しかし、個々のバンドの強度は、歪みや実験条件に応じて非常に可変することができます。各バンドは1つの翻訳商品に対応しています。
このデータは、野生型に現れるすべての産物がこの突然変異体に見えるので、突然変異株がミトコンドリアタンパク質合成が可能であることを示唆している。しかし、バンドの強度は野生のタイプとは異なり、Aim23のこの欠失はミトコンドリア遺伝子発現に影響を与えることを意味する。クマシは青い汚れで醸造され、ローディングコントロールとして機能します。
それらの結果をデータで定量化し、イメージGまたはイメージQuanソフトウェアを使用して、株または実験条件の違いを特定することができます。これらについて、全ての製品に対応する信号の比率が合計信号に対して計算される。平均値と標準偏差は、少なくとも3つの独立した実験で計算されます。
ひっくり返された合成タンパク質の運動学は、過去1年間の実験で研究されています。サンプルは、標識反応が冷メチオニンとボリマイシンによって停止された後、示された時点で収集される。この制御は、製品の安定性を推定するために必要です。
抗ポリン1抗体による免疫染色は、負荷制御である。我々は、酵母ミトコンドリアにおけるタンパク質生合成を研究するためにしばしば使用される方法を説明した。このプロトコルは比較的シンプルで高速に実行できます。
同時に、4つの酵母ミトコンドリアmRNAの翻訳速度に関する貴重な情報を得ることができます。しかし、それは追加の実験を必要とするいくつかの制限を有し、タンパク質およびmRNAのこの州間レベルにある。ミトコンドリア翻訳システムではこれらの関数に関する情報を提供できますが、より高度な技術を用い、メカニズムを発見する必要があります。
