この技術の主な利点は、RNA分解の影響を受けていない新たに合成されたmRNAを測定することによってRNAポリメラーゼII活性を反映していることである。このプロトコルは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを用いて記述されたが、新たに転写されたmRNAのハイ・エアー・シーケンシングに容易に採用することができる。この手順を実証することは、私たちの研究室の元大学院生ティアゴ・バティスタです。
S.cerevisiae細胞を接種した後、150 RPMで一定の攪拌で摂氏30度で一晩成長させる。翌日、600ナノメートルで光学密度を測定する。培養液を約0.1のOD600に100ミリリットルのYPD培地で希釈する。
OD600が約0.8になるまで細胞を成長させます。この後、S.pombeの一晩培養物のOD600を測定する。この培養液を約0.1のOD600に希釈し、500ミリリットルのYAS培地で、OD600が約0.8になるまで成長させます。
まず、2つのモル4チオウラシルの新鮮な溶液を調製する。調製した溶液を室温に保ち、光から保護します。4チオウラシル溶液をS.cerevisiaeおよびS.pombe培養物に加え、最終的な濃度が5ミリモルになるようにします。
摂氏30度と摂氏32度でS.cerevisiaeとS.pombeの文化を6分間一定の攪拌でインキュベートします。この後、各培養物の小さなアリコートを取り除き、自動細胞カウンターまたはノイバウアーチャンバーのいずれかを使用して細胞を数えます。遠心分離機を2、500倍g、摂氏4度で5分間細胞を採取する。
上清を捨て、氷冷で細胞を1回PBSで洗います。2、500倍g、摂氏4度で5分間再び遠心分離機。次に、5ミリリットルの氷冷中の細胞をPBSを1回再懸濁する。
S.cerevisiaeとS.pombe細胞を3対1の比率で混ぜます。混合サンプルを2、500倍g、摂氏4度で5分間遠心分離する。その後、PBSを取り除き、液体窒素中の細胞をフラッシュ凍結します。
使用できる状態になるまで、サンプルをマイナス80°Cで保存します。進行する準備ができたら、約20〜30分間氷上の細胞を解凍します。テキストプロトコルで概説されているようにRNAを抽出するために適応された酵母RNA抽出キットを使用してください。
その後、フィルターカートリッジを最終回収管に移します。100°Cに予熱されたDEPC処理RNaseフリー水の50マイクロリットルでRNAをエルプ。遠心分離機は16,000回gで1分間行う。
その後、50マイクロリットルの予熱DEPC処理RNaseフリー水を使用して、RNAを同じチューブに再び溶出させます。16,000回gの遠心分離機で1分間、サンプルボリューム全体がフィルタを通過したことを確認します。それがない場合は、遠心分離機を再び長い期間待たします。
完了したら、適切な装置を使用してサンプルの純度を定量化し、確認します。DEPC処理ヌクレアーゼフリー水を使用して、以前に獲得したRNAの濃度を1ミリリットル当たり2ミリグラムに調整します。アリコート200マイクログラムの全RNAを摂氏60度で10分間加熱します。
すぐに氷の上で2分間冷やします。600マイクロリットルのDEPC処理RNaseフリー水を加えます。100マイクロリットルのビオチン化バッファーを加え、200マイクロリットルのビオチンHPDPを加えます。
バイオチン HPDP 溶液が溶液から沈殿する場合は、テキスト プロトコルで概説されているように、DMSO または DMF の量を最大 40% の反応量まで増やします。光からサンプルを保護し、3時間穏やかな攪拌で室温でインキュベートします。この後、ほぼ等量のクロロホルムをチューブに加え、激しく混ぜます。
13,000倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。次に、上相を新しい2ミリリットルチューブに慎重に移します。サンプル量の約1/10に等しい5モル塩化ナトリウムの量を加えます。
その後、サンプルを混ぜます。まず、ビオチン化したRNAを摂氏65度で10分間加熱します。その後、氷の上でサンプルを5分間冷やします。
ビオチン化されたRNAにストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズを100マイクロリットル加えます。90分間わずかな揺れで室温でインキュベートします。キットに付属の柱を磁気スタンドに置きます。
次に、900マイクロリットルの室温洗浄バッファーをカラムに加えます。200マイクロリットルビーズとRNA混合物をカラムに塗布します。1.5ミリリットルのチューブでフロースルーを収集し、同じ磁気カラムに再度適用します。
ラベルなし RNA の端数を表すため、必要に応じてこのフロースルーを保持します。異なる分数のRT-qPCR検証を開始するには、まずテキストに概説されているようにcDNAを合成します。次に、標準プロトコルを使用してリアルタイムqPCRでcDNAを増幅します。
4チオウラシルの有無にかかわらず培養した野生型細胞から精製された分画中の転写物の測定レベルは、この手順が特異的に標識RNAを精製したことを確認した。spt20デルタ株の分析は、全定常RNAの量がほとんど変わらないか、または試験された遺伝子に対して軽度にしか減少しないことが明らかである。bre1 で削除された株に対しても同様の結果が見られます。
しかし、spt20デルタ株における新たに転写されたRNAの分析は、すべての試験された遺伝子に対するmRNA合成の3〜5倍の減少を明らかにする。一方、bre1の損失は、より控えめですが、まだ目に見える減少につながります。spt7の誘導可能な枯渇に際して、サガ複合体の構造サブユニットは、新たに転写されたmRNAレベルが、欠失株と同様の程度に減少する。
全RNAレベルをゲノム全体解析で測定すると、spt20の欠失時に、調節または下方調節のいずれかによって発現レベルが変化すると見られる遺伝子はわずかです。しかし、新たに転写されたRNAの分析は、4,000以上の遺伝子のレベルがspt20の欠失時に有意に2倍有意に減少することを明らかにし、芽出芽酵母におけるRNAポリメラーゼII転写に対するサガの世界的なプラス効果を示唆している。この方法はサッカロミセス・セレビシエの転写に関する洞察を提供することができるが、このプロトコルを用いてわずかなばらつきでしか適用されなかったが、mRNA分解の世界的な減少によって補償されたmRNA合成の世界的な減少を検出することができた。
