このプロトコルは、尿管と膀胱に尿をポンプ腎臓内の平滑筋器官である腎盂の無傷のペースメーカー領域をもたらす。腎盂から細胞を分離するのとは異なり、このアプローチは、腎盂ペースメーカー領域の現場環境で無傷を提供し、腎骨盤のペースメイキングを研究するためのより生理学的な準備を提供します。このテクニックを行ったことがない個人は、均一なセクションをカットするのに苦労するかもしれません。
初めてのユーザーは、腎臓がビブラートメステージ上のレベルであることを確認する必要があり、切断プロセスをスピードアップしません。内部組織鉗子と内部解剖はさみを使用して、腸をつまんで腹壁から離れて持ち上げます。同時に、腎臓を含む後腹膜空間へのアクセスを得るために、近位十二指腸と遠位結腸で体から解放された腸の下側を切断する。
尿管の遠位端を組織鉗子でそっとつまんで持ち上げます。解剖はさみを使用して、周囲の結合組織から解放されるまで、腎臓に向かってつままれた尿管の下を切断する。腎臓が露出したら、それらを個別に抽出します。
シリコンエラストマーコーティングされた皿に氷冷KRB溶液を充填します。腎臓を解剖皿に移し、それが完全に水没していることを確認する。細かいスプリングハサミと内鉗子を使用して、腎臓の基部から脂肪組織を取り除き、遠位腎盂、またはRP、および近位尿管を露出させる。
近位尿管と遠位RPの一部を、細かいスプリングハサミと鉗子を使用してベースから取り外します。細かい先端鉗子で外側の腎カプセルを突き刺し、腎臓の体から離れて先端を引き離す。各手で鉗子を使用して、カプセルの緩い端をつまみ、残りの腎カプセル膜が完全に取り除かれるまでそれらを引き離す。
ビブラートメの刃ホルダーにカミソリの刃を挿入し、ブレードクリアランス角度を約18度に調整します。テキスト原稿に記載されているようにブレードパラメータを調整し、腎臓セクションの厚さが150マイクロメートルを超えないようにし、カルシウムイオンイメージング実験に悪影響を及ぼします。鈍い終わりの鉗子を使用して、調製した腎臓を氷冷KRB溶液からそっとつかんで取り除きます。
腎臓を吸収性の紙に2~4秒ほど置き、余分な外部水分を除去します。腎臓を吸収性の紙にそっと転がして、パレンチマのすべての側面が乾燥し、ビブラートメステージへの腎臓の最適な接着が確実に行えるようにします。すぐにビブラートメの標本の版の基部にシアノアクリルの接着剤の薄い層を適用し、接着剤で覆われた領域に腎臓尿管側を下に置くために鈍い終わりの鉗子を使用する。
鉗子の平らな端で腎臓の上部に穏やかに下向きの圧力を塗布し、約10〜20秒間接着剤を乾燥させます。試料プレートを緩衝皿の底にしっかりと固定し、腎臓の上部が完全に浸漬されるようにKRB溶液のレベルを調整します。自動ビブラートメ切断の場合、腎臓の全体が切断されていることを確認するために、ビブラートの刃の切断サイクル0.5〜1センチメートルの開始位置と終了位置を選択します。
自動切断プロセスを開始し、ブレードが腎臓と接触することを確認します。鉗子を使用して、腎臓から解放されたセクションを収集し、すぐに個々の井戸に移します。断面化プロトコルを継続し、PKJ領域がより明らかになるまで、光顕微鏡を使用して腎臓スライス中のPKJ領域を同定します。
シリコンエラストマーコーティングされたイメージングディッシュに氷冷KRB溶液を充填します。個々の腎臓スライスを皿に移します。腎臓スライスの周囲にMinutienピンを挿入して、イメージング皿の基部にセクションを固定します。
直立した回転ディスク共焦点顕微鏡のステージ上にイメージング皿を置き、すぐにKRB溶液で浸透を開始します。低倍率の水浸漬対物レンズを使用して、腎臓スライスを見つけます。ランドマークを使用して、PKJ が存在するスライスの領域にイメージング フィールドを中央に配置します。
PKJが配置されたら、より高い倍率の水浸漬対物レンズを使用して、対象領域を拡大します。PKJ壁のカルシウムイオン過渡持続時間の異なるタイプで関心のある異なる細胞を区別する。目的のセルが特定されたら、レーザー強度を調整して良好な信号対雑音比を得て、16 ~32 ヘルツの時間サンプリング周波数で画像を記録します。
腎臓セクション全体の光顕微鏡画像は、単一のPKJ領域のアコード化されたランドマークを示しています。複数のPKJ領域は、内側の髄質および遠位腎臓の近くに存在する。PKJ腎動脈およびPKJ境界の位置をここに示す。
PDGFR α陽性細胞でGCaMPを発現するマウスからのPKJセクションをここに示す。接合組織間に懸濁した薄いPKJ壁は、腎動脈膜などのランドマークを用いて区別することができる。この特定のトランスジェニック組織におけるGCaMP6fの発現は、PKJの全幅にわたって、筋肉層および来期層の両方に広がっている。
PDGFR α GCaMP6f陽性腎臓スライスでは、通常PKJ壁の幅にわたって延びる細胞のネットワークが蛍光であり、様々な持続時間および周波数の振動カルシウムイオン過渡を表示する。SMC GCaMP3陽性腎臓スライスにおいて、GCaMP3陽性細胞の層が筋肉層に存在する。時空間マップは、PKJアドベンティアに位置するPDGFRアルファ陽性細胞が長期間低周波カルシウムイオン過渡的を引き起こすのに対し、SMCはより短い期間のカルシウムイオン過渡性を発した。
同様に、SMC内の集集ダおよび発振カルシウムイオン過渡量の蛍光カルシウムイオン信号の配列も観察された。この手順を試みる場合、均一な腎臓スライスがブロックから解放されるように、ビブラートメ切片の間に腎臓が可能な限りレベルにすることが重要である。この手順に従って、単細胞単離、免疫体化学、分子研究などの他の方法を行い、腎盂におけるペースメーカーのメカニズムの理解を深めることができます。
