心不全は、世界の男性と女性の両方の主要な死因です。新しい証拠は、心臓代謝および全身代謝の変化が心不全の病理に寄与することを示唆している。励起収縮結合に影響を及ぼす代謝産物を迅速に特定することは依然として課題である。
心臓筋細胞を成虫マウスから隔離するという従来のアプローチは、時間と挑戦のプロセスです。この記事の革新的な方法により、厳格なプロセスがより効率的で、実行しやすくなります。また、蛍光プローブを用いて、化学物質が細胞レベルでの心臓毒性や機能障害を誘導する方法について、多くのフェロチ型評価を行うことができます。
どの分子が筋細胞機能を変化させるかを特定することにより、心不全の治療のための新しい治療法を同定することができる。トランスジェニックマウスを使用して、さまざまな遺伝子をプローブして、心不全を予防し、寄与させることができる遺伝子を特定することができます。この情報は、心不全の将来の治癒に不可欠です。
手順を実証するには、マシュー・クロスと学生シュレヤス・スレッシュです。まず、作業用ラミニン溶液を氷の上で解凍します。P1000ピペットを使用して、200マイクロリットルのラミニンを吸引し、滅菌カバースリップの片端に沿ってピペットチップをそっとドラッグして、キャピラリーアクションが6ウェルプレートへのカバースリップ付着を容易にするために少量のラミニンを引き出すことを可能にします。
次に、残りのラミニンをカバースリップの中央に円形の動きで吐き出します。ラミニン液滴をカバースリップに広げます。カバーリップを37°Cのインキュベーターに少なくとも1時間、そして24時間まで分離する前に置きます。
調製した心臓からミオサイトを冷たいKHB-HBで分離するには、試料をステレオ顕微鏡の下に置きます。塞栓を防ぐために、大動脈カニューレをKHB-HB溶液に浸し、20ミリリットルのシリンジを使用して溶液を強制的に通過させることでプライムします。心臓が水没し、カニューレが心臓切除前にプライミングされていることを確認してください。
5鉗子で、心臓をカニューレにする。カニューレの先端を約1ミリメートル上の大動脈挿入心室に可視化してカニューレの適切な位置を確認する。次に、ランゲンドルフのストップコックを回転させることでKHB-HBの流れを開始します。
カニューレをランゲンドルフに接続して、心臓を5分間穿孔します。次に、ストップコックを回転させて、KHB-HBリザーバから消化バッファーリザーバへの灌流を切り替えます。消化バッファーが心臓に到達したら、タイマーを設定します。
無菌100ミリリットルビーカーにパーフューズを集める。消化時間が経過するまで、消化バッファーリザーバーをパーフューズ処理で必要に応じて補充します。消化後、無菌100ミリリットルビーカーで、鉗子とアイリスはさみで心臓のチャンバーを分離する。
各チャンバーを6ウェルプレートの別々のウェルに入れます。各井戸にコラゲターゼ溶液を5ミリリットル注ぎます。すぐに約1立方メートルの塊に心臓組織をミンチするためにはさみを使用してください。
滅菌移動ピペットを使用して、消化バッファーでひき肉組織を穏やかにトリチュレートする。組織の塊が白く羽毛になったら、プレートを反転した顕微鏡の下に置いて細胞を調べます。生存可能な細胞の数が80%を超える場合は、100ミクロンの細胞ストレーナーを用いて50ミリリットルの円錐管に細胞を緊張させる。
生存可能な細胞の数が80%未満の場合は、カニューレートにかかった時間を確認してください。缶取時間が5分を超える場合は、別の心臓を試してみてください。そうでなければ、コラゲナーゼサンプリングプログラムを通じて新しいコラゲナーゼスロットをアッセイする。
次に、215回gで2分間遠心分離して細胞をペレット化する。ペレットは、コンパクトで緩んでいない必要があります。ペレットが緩んでいる場合、調製物は、多くの死んだ細胞を含む。
組織培養フードでは、コンパクトペレットを停止バッファーの 10 ミリリットルに再懸濁します。215回gで2分間遠心分離して細胞を再びペレット化する。5ミリリットルのめっきバッファーで細胞を再懸濁します。
細胞カウンタに細胞数を加え、めっきバッファーの体積を調整して、1ミリリットル当たり4細胞に対して2倍の10倍の最終的な筋細胞濃度に達するようにします。ラミニンコーティングされたカバーリップをインキュベーターから取り除きます。ラミニン液滴が存在する場合は吸引する。
各カバースリップに200マイクロリットルのミオサイト懸濁液をプレートします。カバーリップを21%の酸素と5%の二酸化炭素を持つ37°Cインキュベーターに2時間置き、取り付けられるようにします。2時間後、カバースリップを取り出し、未接続の細胞を吸引する。
37°Cの培養器に2ミリリットルの培養培地と培養液を最大4日間加えます。まず、膜電位キットから成分Aおよび成分Bを取り除きます。15ミリリットルの円錐管で、50マイクロリットルの成分Bと5マイクロリットルの成分Aを組み合わせて、電圧色素混合物を形成します。
混ぜる渦。10ミリリットルのめっき媒体を電圧色素混合物を含む15ミリリットルの円錐管に加える。繰り返しますが、渦が混ざります。
その後、インキュベーターから筋細胞の6ウェルプレートを1つ取り除きます。メディアを吸引する。各ウェルに膜電位染料混合物の800マイクロリットルを追加します。
プレートをホイルで覆い、プレートを室温で15分間放置します。その後、各ウェルから染料培地混合物を吸引し、各井戸に変性タイローデの溶液の1ミリリットルを追加します。ホイルで覆います。
機器の電源を顕微鏡、アークランプ、ハイパースイッチ、蛍光インターフェースシステム、MyoCam電源、電界刺激装置、コンピュータの順にオンにします。励起放出フィルタセットがイメージング色素に適していることを確認します。例えば、フラ2は340ナノメートルと380ナノメートルの光で励起される。
それは510ナノメートルの光で放出する。Fluo-4と電圧膜色素は485ナノメートルの光で励起され、520ナノメートルの光で発光します。真空をオンにし、ホースクランプを完全に開き、マニホールド内のタイロードの溶液で各60ミリリットルのシリンジを穏やかに突っ込むことで、記録システムをプライムします。
カルシウムの記録のために、標準的なタイローデの解決を使用する。電圧記録の場合は、変更されたタイロードの溶液を使用してください。ラインヒーターをオンにします。
チャンバー内のパーフューズルが36プラスマイナス1°Cで少なくとも15分間になるように温度を維持します。次に、取得ソフトウェアを開きます。正しいイメージング色にパラメータが設定されていることを確認します。
刺激装置をオフにします。暗闇の中で、6ウェルプレートからホイルを取り出し、ペーシングチャンバーにカバースリップを置きます。プレートを顕微鏡下に置き、10Xの目的を使用して筋細胞に焦点を当てます。
一度フォーカスを得て、1つのヘルツと0.2ボルトで刺激するフィールドによってペーシングを開始します。1対1のペースが得られるまで、徐々に電圧を上げます。次に、しきい値の1.5倍になるまで電圧を上げます。
10Xの目標から40Xの目標に切り替えます。1 対 1 のペースに従っているセルにフォーカスします。1 つのセルだけが視野に入るように、プラスチックシェードを調整します。
ソフトウェアを使用して、適切に定義されたサルコメアに関心領域ボックスを配置します。集録ソフトウェアを起動して励起光を開始します。ニュートラル密度フィルタを使用して、適切な信号対雑音比を得るために、それに応じて強度設定を調整します。
ここで、フラ2を用いてC57BL/6マウス筋細胞から記録された代表的なカルシウム及びサルコメア短縮トレースを示す。C57BL/6マウスとそのトランスジェニックごみ合致から得られたアンサンブル平均データの定量化は、10ヘルツペーシングでの緩和時間を除いて、群間に差を示さない。10ヘルツでのC57BL/6マウスのミオサイトから記録された電圧トレーシングは、使用できる信号を得るためにポスト処理された。
低いパスバターワースまたはSavitzky-Golayデジタルフィルタが適用された後のアンサンブル平均アクションポテンシャルは、アクションポテンシャルの形状に微妙な違いを示しています。1つのヘルツでペーシングされたラット筋細胞から記録された痕跡は、カルシウム信号よりも低い電圧信号に加えて、収縮動態も異なることを示している。これは、カルシウム染料はカルシウムを緩衝し、電圧色素はバッファしないからである。
カルシウム過渡性と同様に、筋細胞は光学作用電位持続時間のペーシング依存性変化を示した。薬剤誘発性の作用電位の延長も実証された。20秒の記録の最後の11秒は、青色光への筋細胞の長期暴露が誘発された活動につながることを示した。
この手順を試みるとき、覚えておかねばならない最も重要なことは、筋細胞を損傷しなくてはならない限り、最も低い強度の光を使うことだ。当社のアプローチを用いて単離されたミオサイトは、免疫体化学にも使用することも、ウェスタンブロット分析に使用することもできます。この技術の美しさは、研究者が分子や遺伝子の多様性が単一のシステムを使用して励起収縮結合を助ける方法を迅速に評価することを可能にする。
