標準化された光遺伝学的プロトコルは、操作された哺乳類細胞系における細胞特性を制御するための刺激として光を使用することに関心のあるラボ向けに設計されています。このプロトコルは、光遺伝学に精通していないラボで簡単に実装でき、操作された生物学的システムの正確な空間的時間制御のための方法を提供します。この方法は、がん生物学、システム生物学、組織分化など、時空間情報が重要な特定の研究分野で幅広く応用されています。
まず、結合する遺伝子成分を選択して、単一の遺伝子回路またはプラスミドに結合する。例えば、哺乳動物DNA組み込み部位、光応答性エレメント、又は機能遺伝子が挙げられる。開始コドン、調節配列、翻訳配列などの必要なすべての特徴を組み立てて調べた後、遺伝子工学および分子クローニングソフトウェアを使用し、DNA配列に注釈を付けて保存し、後で使用するために、また参照として保存します。
配列アライメントなどの組み込みの分子クローニングソフトウェア機能を使用して、プラスミド構築のためのプライマーを計算的に検証します。安定な細胞株を生成するために、遺伝子回路DNAと適切なリコンビナーゼとのリポソーム混合物を用いて、設計遺伝子回路および所望の細胞をトランスフェクトする。細胞が 80 ~ 100% コンフルエントになったら、45% 古い培地、45% の新鮮な培地、および 10% DMSO を組み合わせて細胞を凍結します。
残りの細胞を滅菌チューブに移し、単一細胞選別を行い、モノクローナル細胞を96ウェルプレートに単離する。モノクローナル選別から約2~3週間後、96ウェルプレート内のウェルは病巣を有するはずである。50~60%のコンフルエンシーが達成されたら、細胞を12ウェルプレートに分割する。
マイクロコントローラプログラマを使用して、組み立てられたLPA回路にファームウェアを追加します。次に、取り付けプレート、回路基板、LEDスペーサー、プレートアダプター、24ウェルプレート、プレート蓋、取り付けボルト、ウィングナット、および積層コンポーネントを使用して、組み立てられた回路基板に3Dプリント部品を結合します。光遺伝学的実験を開始するには、Tabor Lab の Web サイトで入手できる Iris ソフトウェアを使用して、LPA 用の SD カードをプログラムし、適切な光条件を調べます。
次に、所望の実験アウトラインの技術反復とともに強度値を入力します。500マイクロリットルの総容量の24ウェルの黒いプレートに1ウェルあたり約75,000個の細胞を加え、次いで細胞を5%二酸化炭素で加湿されたインキュベーターに入れて、それらが2〜6時間沈降するようにする。インキュベーションの最後に組織培養フード内の細胞を移した後、プラスチック製の蓋を外し、プレートの上部に接着箔ストリップを追加して、ウェル間の光移動を最小限に抑え、ウェルの下部にあるLEDからのみ光が入るようにします。
LPA の取り付けられた 3D パーツにプレートを置き、各コーナーのデバイス ネジに収まる 3D プリントされた LPA ふたでプレートを覆います。デバイスを電源に接続し、LPA デバイスのリセット ボタンを押して、更新された LPA 実験設定が適用され、細胞をインキュベートすることを確認します。インキュベーション後、組織培養フードの内部で、プレートからホイルストリップを取り出し、プレートを1〜2分間座らせて、プラスチック製の蓋に結露が形成されないようにします。
次に、元のプラスチック製の蓋をプレートに戻し、適切な位相コントラストまたは蛍光顕微鏡で細胞を画像化する。誘導後24〜72時間後、続いてトリプシン処理を行い、約500マイクロリットルの各ウェルの内容物全体をセルストレーナーを備えた標識チューブに移す。次いで、適切なフローサイトメトリー装置ソフトウェアを使用して、破片および細胞凝集塊を排除するために適切なサイズおよび粒度の単一細胞を捕捉する順方向および側方散乱ゲートを作成する。
ゲートがセットされたら、適切なゲートで約10,000個のセルを捕捉し、必要なセルデータの量に応じてセル数を調整し、各チューブ内の実験細胞のキャプチャを繰り返します。誘導およびトリプシン処理後、約500マイクロリットルの各ウェルの内容物全体を標識チューブに移す。細胞を400倍G.で5分間遠心分離し、上清を捨てた後、サンプルを化学ヒュームフードに移す。
PBSで希釈した750〜1,000マイクロリットルの4%PFAで細胞を再懸濁し、数回ピペットを上下させて細胞凝集塊を切断する。15分間のインキュベーション後、750〜1,000マイクロリットルのPBSおよび再度ピペットを数回上下させ、次いで室温で400倍Gで5分間細胞をペレットダウンする。上清を捨てた後、サンプルを化学ヒュームフードに移動し、実証されたように750〜1,000マイクロリットルの氷冷メタノールに細胞を再懸濁し、細胞をマイナス20°Cの冷凍庫に30分間座らせる。
インキュベーション後、750〜1,000マイクロリットルのPBSを数回上下にピペッティングしながら加える。次いで細胞を400倍Gで5分間遠心分離した後、上清を捨て、試料を化学ヒュームフードに移した。標識一次抗体およびピペットの100マイクロリットルまたは他の適切な希釈液で細胞を6〜8回上下に再懸濁し、次いで室温で1時間インキュベートする。
次に、750〜1,000マイクロリットルのインキュベーションバッファーおよびピペット溶液を数回上下に添加し、次いで細胞を400倍G.Nextで5分間遠心分離し、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、数回上下にピペッティングすることによって凝集塊を壊す。各チューブの内容物全体を細胞ストレーナーで標識したチューブに移す。細胞を正しい波長のレーザーで適切なフローサイトメトリー機器に持って行きます。
装置について光学較正を行った。取得した画像を用いて、LEDの補正値を計算し、背景信号を減算し、画素強度を推定した。変動係数は96ウェル間で最小であった。
キャリブレーションソフトウェアは、場所ごとのLEDの変化を実証し、各LEDが同じ強度に正規化されるようにグレースケール調整を作成しました。遺伝子発現は、LPA上の異なる光パルス持続時間で蛍光顕微鏡を介して操作されたより軽い細胞において誘導され、細胞はブライトフィールドおよびGFP発現のために画像化された。フローサイトメトリーを用いて、細胞を異なるパルス長値で誘導し、非誘導状態からの4倍以上の変化の集団レベルで定量化された遺伝子発現の用量応答を示した。
負のフィードバックは、より軽いシステムと鮮やかなまたは明るいシステムのさまざまな光強度値を比較することによって示されるように、5倍以上の遺伝子発現ノイズ低減を達成した。qPCR分析では、操作された軽量細胞が、誘導されていない状態から10倍以上の誘導を伴う用量応答性でRNAレベルを発現し、フローサイトメトリー定量と一致することが示されました。操作されたより軽い遺伝子回路は、KRASタンパク質レベルおよびリン酸化ERKレベルの増加をもたらした青色光の増加量を示した。
増殖、細胞運動性、創傷治癒、増殖、または浸潤アッセイを含むいくつかの機能的アッセイが実施され得る。これらの方法は、がん生物学、組織分化、または薬剤耐性のメカニズムに関する特定の洞察を提供する可能性がある。
