このプロトコルは、シングルガイドRNAおよびCAS9によって誘導される二本鎖切断の修復中に生じる変異を同定するのに役立つ。この技術の主な利点は、特定のゲノム遺伝子座での変異を検出するための費用対効果が高く堅牢な方法であることです。ヒトケラチノサイトを例にとりますが、このプロトコルはあらゆるトランスフェクタブル細胞株に適合させることができます。
このプロトコルを実証するのは、私たちの研究室の学部助手であるTaylor Bugbeeです。開始するために、ヒトケラチノサイト増殖サプリメントおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むケラチノサイト培養培地を含むジャケットインキュベーター中で、5%二酸化炭素を用いて摂氏37度の10センチメートルプレートでHFK LXSNおよびHFK 8E6細胞を培養する。培養培地を3ミリリットルのトリプシン-EDTAと交換し、摂氏37度で3分間インキュベートする。
次いで、等量のFBS補充培地でトリプシンを中和する。次に、細胞を15ミリリットルの遠沈管に移し、300倍Gで5分間遠心分離する。ヒトケラチノサイト増殖サプリメントを用いて10ミリリットルのケラチノサイト培養培地で細胞を再懸濁し、血球計数器で細胞の濃度を決定する。
その後、HFK LXSNおよびHFK 8E6細胞についてそれぞれ2つのプレートを、ヒトケラチノサイト増殖サプリメントおよび1%ペニシリンストレプトマイシンと共に4ミリリットルのケラチノサイト培養培地に播種した。播種後、細胞をジャケットインキュベーター内で摂氏37度および5%二酸化炭素でインキュベートする。トランスフェクション当日、培地を抗生物質フリーの3ミリリットルの補充培地と交換し、ジャケットインキュベーター内で摂氏37度で2時間インキュベートします。
細胞をトランスフェクトするには、トランスフェクション試薬を室温に温め、使用する前に穏やかにピペットでピペットします。各細胞株の 2 本の滅菌 1.5 ミリリットル遠沈管に適量のトランスフェクションバッファーを入れ、それらをチューブ 1 およびモックトランスフェクションまたはチューブ 2 としてラベル付けします。次に、DNA発現するプラスミド、CAS9、シングルガイド、RNA標的ヒトCD4の2マイクログラムをチューブ1本およびピペットに穏やかに加えて、完全に混合する。
等量の滅菌水をチューブ2本に加える。適量のトランスフェクション試薬をDNA混合物および模擬トランスフェクションまたはチューブ2と共にチューブ1本に加える。ピペットを使用して、それらを完全に穏やかに混合し、室温で15〜30分間インキュベートして複合体を形成する。
トランスフェクション混合物をプレートに滴下し、培養プレートを 1 分間静かに振って、トランスフェクション混合物を均等に分配します。トリプシン処理によって細胞を回収するには、培養培地を1ミリリットルのトリプシンEDTAと交換し、摂氏37度で3分間インキュベートする。次いで、等量のFBS添加培地でトリプシンを中和する。
細胞の各プレートについて、細胞懸濁液を等しいアリコートを有する2つの微量遠心チューブに移し、300倍Gで5分間遠心分離する。遠心分離後、1つのチューブから細胞ペレットをシークエンシング用の1ミリリットルのPBSに再懸濁し、別のチューブにイムノブロット用の氷冷PBSで再懸濁する。イムノブロットアッセイは、非形質移入および形質移入HFK細胞におけるCAS9発現を比較するために実施した。
この結果は、トランスフェクションされていないHFK細胞とトランスフェクトされたHFK細胞が同量のCAS9を発現したことを示し、トランスフェクション効率が2つの細胞株間で類似していることを示している。SgRNA/CAS9形質移入細胞および非形質移入対照におけるリン酸化ヒストンH2AX S139の免疫蛍光顕微鏡像が得られた。結果は、CAS9 SgRNAによって2つの二本鎖切断が誘導されたことを示した。
ゲノム変異をHFK LXSNおよびHFK 8E6における変異事象の種類によってグループ化し、そこでゲノム変異の各群および変異の総数をHFK LXSNおよびHFK 8E6の間で比較した。結果は、8E6がCAS9誘発二本鎖切断の周囲200キロ塩基以内でゲノム変異を増加させることを示し、HPV 8E6が二本鎖切断修復を調節解除し、ゲノム不安定性を増加させることを示している。イムノブロットの目的は、データ解析中に考慮する必要があるトランスフェクション効率を測定することです。
トランスフェクション効率に加えて、免疫蛍光顕微鏡を用いて、ホスホ-H2AXをマーカーとして用いて二本鎖切断誘導を確認することができた。例としてベータHPV 8E6を使用します。この技術は、小分子阻害剤などの他の試薬によって引き起こされる突然変異頻度またはタイプの変化を検出するために使用することができる。
