Name: wild-type blocking pcr combined with direct sequencing as a highly sensitive method for detection of low-frequency somatic mutations
Uploaded: 2017-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
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倫理文：ヒトサンプルのすべてのテストは、治験審査委員会（IRB）の承認を得た後に行われました。 1. FFPE組織からのDNA抽出、末梢血、及び骨髄吸引<ol><li> DNA FFPE抽出キットと骨髄FFPE組織のための<ol><li> （ - 5時10節 - 10μmの厚さ5）未染色スライドからのFFPE組織で始まります。 注：組織の削りくずとの始まりは、3つを使用する場合 - 5で6セクションを - 10ミクロンの厚さと1.1.6に進みます。 </li><li>スライドバスケットにスライドを置き四の洗浄リザーバ（キシレンための2つの100％アルコールのための2つ）を調製。各バスケットに対する解決策の600ミリリットルの最小容積を追加します。 </li><li>第1トレイにおける5分間のキシレン洗浄を行うことによってスライドを脱パラフィン。さらに5分間、第二キシレン洗浄槽にスライドを転送します。 </li><li>脱パラフィン後、5分間100％アルコールでスライドを洗浄します。第二に、スライドを転送さらに5分間アルコール洗浄槽。 </li><li>スライドはマイクロ遠心チューブにカミソリの刃でそれらをこする前に、ボンネットの下に完全に乾燥することができます。 注：示された腫瘍領域とH＆Eスライドが利用可能な場合、スライドを整列のみ腫瘍領域をこすり。 </li><li>キットに含まれているメーカーの配布資料からの指示に進みます。 </li></ol></li><li> BM吸引および末梢血のために<ol><li>これらの仕様とメーカーの説明書の配布資料に基づいて抽出します。 注：FFPE組織や細胞からのDNA抽出のための多数の市販のキット及び方法があります。実際には、すべてを使用することができます。実験室で確立された方法を使用してください。 <ol><li> 200μLの末梢血（PB）又は100μLのBM +100μLのPBSを使用します。 </li><li> 4μLのRNase Aストック溶液を使用してください。 </li><li> 100μLの溶出緩衝液で溶出します。 </li></ol></li></ol></li><li> DNAの定量化<ol><li> （純粋なDNAの場合）約1.8の260nmで/ 280 nmの比率を確保する分光光度計を用いてDNA濃度を測定します。比がかなり低い場合には、下流アプリケーションに干渉する可能性タンパク質、フェノール、または他の汚染物質の存在を示すことができます。 </li><li>適切な溶出緩衝液で100 ng /μLで - 約50にDNA濃度を調整します。 </li></ol></li></ol> 2.野生型PCRブロッキング<ol><li>プライマー設計<ol><li>設計と以前にPCRプライマー設計13の一般的なガイドラインを説明に従って目的の遺伝子のためのプライマーを得ます。 M13フォワードを含めると、PCRプライマーにユニバーサル配列決定プライマーをリバース。 注：MYD88アッセイはMYD88のエクソン5を増幅するために開発された（G259 - N291）5&#39; に位置し、110個のヌクレオチドプライマーをイントロン4前方のスプライス部位と一部を覆い、逆にイントロン領域5&#39; を用いて設計しました-M13シーケンス（M13フォワード：TGT AAA ACG ACG GCC AGT。 M13リバース：CAG GAA ACA GCT ATG ACC）相補的配列決定プライマーのアニーリングを可能にする（ 材料表を参照）。 </li></ol></li><li>ロックされた核酸、オリゴヌクレオチドのデザイン<ol><li>約10であることをブロッキングオリゴヌクレオチドを設計 - 長さが15塩基および変異体濃縮が望まれるWTテンプレートに相補。 注：短いオリゴは、ミスマッチ識別が向上します。これは非常に「粘着性」オリゴヌクレオチドにつながることができるので、高い標的特異性を達成するために、あまりにも多くのブロッキングヌクレオチドを使用しないことが重要です。コンテンツの長さとブロッキングヌクレオチドを遮断する必要がある特定のヌクレオチドに応じて最適化されるようにすべきです。二次構造を損なうことと、自己相補性を危険にさらすことなく、高い結合特異性を達成することが重要です。 </li><li>拡張temperat上方15°C - T mの10を有するようにブロッキングオリゴを設計熱サイクリング中にURE。 GまたはC塩基を遮断- （4塩基3）ブロッキング塩基を追加または削除することによって、又は長いストレッチを回避しながら、DNAのためのブロッキングの塩基を置換することにより、T mを調整します。 <ol><li>オリゴツールのウェブサイトに移動します（ 材料の表を参照）、「オリゴTmの予測をブロッキング」ツールを選択します。 </li><li> 「オリゴシーケンス」ボックスにブロックされることが望まれるWTテンプレートの配列を貼り付けます。ブロッカー拠点を示すために、拠点の前に「+」を追加します。 </li><li> DNA-ブロッカーハイブリッドのおおよそのT mを決定するために、「計算」ボタンを選択します。 </li></ol></li><li>二次構造形成や自己二量体を避けるために、ブロッキングオリゴを設計します。 <ol><li>オリゴツールのウェブサイトに移動します（ 材料の表を参照）、「オリゴOptimizerをブロッキング」ツールを選択します。 </li><li>ボックスにブロックされることが望まれるWTテンプレートの配列を貼り付け。拠点を遮断示すために、拠点の前に「+」を追加します。 </li><li> 「二次構造」と「自己のみ」の2つのボックスを選択します。潜在的に厄介な二次構造または自己二量体のためのオリゴを検討する分析ボタンを押してください。 注：スコアは、二次構造および自己二量体のT m「sを非常に粗い推定値を表します。低いスコアは、したがって最適であり、ブロッカーブロッカーペアを制限することによって達成することができます。 MYD88 [MYD88blocker（TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T +のCC / invdT /）]のためのブロッキングオリゴヌクレオチドはQ262、I266アミノ酸をカバーするように設計されており、反転3 &#39;を備えましたdTの3&#39;-エキソヌクレアーゼによってDNAポリメラーゼおよび分解の両方によって伸長を阻害します。この特定のブロッキングオリゴは「+ N」と表記されている10のブロック塩基と17マーです。残りの7つの塩基は、通常のDNAヌクレオチドです。 </li></ol></li></ol></li><li> WTB-PCRセットアップおよび熱サイクル<ol><li> WTB-PCRマスターマイルを準備X（MMX）フォワード10X W / 20mMのMgCl 2を 、250μMのdNTP、0.2μM2.5μLPCR反応緩衝液を使用し、リバースプライマー、1.2μMMYD88blocker、およびDNアーゼ、RNアーゼを含まない、超純H 2 Oは、最終を作成します反応あたり21.75μLの液量。 注：作業濃度は25μL（DNA鋳型とのポリメラーゼの添加後）の最終反応容量のためのものです。従来のPCR MMXは、単にブロッカーの添加を省略することにより調製されます。すべてのプロトコル手順はWTBと従来のPCRの両方に対して同一のままです。これは、検証に使用されるとブロッカーの添加によって達成濃縮を決定することができます。 <ol><li> MMXの量を計算する際に3つの追加反応（陽性および陰性対照および非テンプレートコントロール汚染をチェックする）とピペッティングエラーのための少なくとも1つの追加の反応を考慮してください調製しました。 </li></ol></li><li>徹底的にボルテックスMMX。 MMXはAYまでのために-80℃で保存することができます耳。 </li><li> MMXに反応当たり0.25μLのTaq DNAポリメラーゼを加え、混合して反転。ポリメラーゼはMMXに追加された後、氷の上に保管してください。 </li><li>各反応ウェルにコールドプレートピペットポリメラーゼとMMXの22μLに新しい96ウェルPCRプレートを置きます。 </li><li>ポリメラーゼでMMXを含む各ウェルに100 ng /μLで - 3μLゲノムDNA（50加えます。 </li><li>溶液は、各ウェルの底に到達確実にするために簡単にプレートと遠心分離をシール。 </li><li>サーモサイクラー上でPCRプレートを読み込みます。 <ol><li>次のようにWTB-PCR反応の熱サイクル条件を設定：6分間95℃での初期変性; 30秒間95℃での変性、30秒間56℃でのプライマーアニーリング、および1分20秒間72℃での伸長の40サイクル。 10分間72℃で最終伸長。 注：ベストプラクティスは、アンプリコンの汚染を避けるために、物理的に独立した領域に、プロトコルの残りを完了含まInは将来のセットアップ。 </li></ol></li></ol></li><li> WTB-PCRが成功したかどうかを判断し、非鋳型対照における増幅の欠如を確認するために、以前に記載されたプロトコル14に従ってゲル電気泳動を行います。 </li><li>磁気ビーズによるPCR生成物の精製<ol><li> 4°Cから磁気ビーズを取り出し、室温に持って来ます。 </li><li>新しいPCRプレートに10μLのPCR産物を転送します。 </li><li>渦磁気ビーズを激しく完全に磁性粒子を再懸濁します。 </li><li>新しいプレート上の各ウェルに18μLに磁気ビーズを追加します。ピペットを10回混ぜます。 </li><li> 5分間室温でインキュベートします。 </li><li>溶液から別のビーズに2分間サイドスカート磁石プレート上にPCRプレートを置きます。 </li><li>ビーズペレットを避け、マルチチャンネルピペットで上清を吸引除去します。 </li><li>各ウェルに150μLの70％エタノールを分配し、foは室温でインキュベートRは、少なくとも30秒。マルチチャンネルピペットでエタノールを吸引し、ヒントを捨てます。もう一度この洗浄手順を繰り返します。 </li><li> 20μLのマルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルからの残りのエタノールを吸引し、チップを廃棄します。 </li><li>ウェルを（約10分間）乾燥されると、磁石プレートから除去し、穏やかに各ウェルにピペットミックスに40μLを15回又は渦をヌクレアーゼフリー水を加えます。 </li><li> 2分間、室温でインキュベートします。 </li><li>溶液から別のビーズに1分間磁石板上PCRプレートを置きます。 </li><li>新しいPCRプレートに精製された生成物の35μLを移します。これは、精製されたPCR産物は、現在、双方向の配列決定を続行する準備ができているか、必要になるまで-20℃で保存することが可能です。 注：新規アッセイを開発する場合、精製されたPCR産物の定量化が必要とされ得ます。 1から3 ng /μLでアンプリコンのDNAは、双方向の配列決定のために最適です。濃度が一貫して低い場合、PCR産物及び磁性ビーズを高めるproportionally（1：1.8）。濃度が一貫して高い場合、水のより大きな容積で溶出します。 </li></ol></li></ol> WTB-PCR産物の3シーケンシング<ol><li>双方向シーケンシング 注：以下のプロトコルは、より少ない試薬を使用するために最適化された製造業者の使用説明書の改変された形態です。 <ol><li>フォワード準備と逆方向配列決定反応は、最終的な溶液を作成するために追加して、DNアーゼ、RNアーゼを含まない、超純H 2 O 0.25μLレディ反応混合物、1.88μL配列決定緩衝液、1.78μMM13-F又はM13-R配列決定プライマーとと混合します反応あたり9μLのボリューム。この配列決定反応ミックスは年まで-20℃で保存することができます。 </li><li>順方向配列決定反応のための新しい96ウェルPCRプレートの各ウェルに順方向配列決定反応混合物のピペット9μL。逆方向配列決定反応のために別々のプレート上で繰り返します。 </li><li>精製したWTB-PCR産物トンの1μLを追加各Oウェルの両方前方プレートを逆に。 </li><li>溶液は、各ウェルの底に到達確実にするために簡単にプレートと遠心分離をシール。 </li><li>サーモサイクラー上でPCRプレートを読み込みます。 <ol><li>次のように配列決定反応のための熱サイクル条件を設定：96℃を1分間; 10秒間96℃の30サイクル、5秒50℃、4分間60°C。浄化のための準備が整うまで4℃で保持します。 </li></ol></li></ol></li><li>シーケンシング製品を精製<ol><li> 3M酢酸ナトリウム（pH5.2）および100％エタノールの新鮮な1時25溶液を調製します。 </li><li>新鮮な70％エタノール溶液を調製します。 </li><li>酢酸ナトリウムの30μL/フォワードおよびシーケンシングプレートを逆にし、ピペットミックス5回の両方の各ウェルに100％エタノール溶液を加えます。 </li><li>プレートを再シールし、20分間室温で暗所でインキュベートします。 </li><li> 15分間2,250×gでプレートを遠心します。 </li><li>プレートシーラーを取り外し、廃棄物の上に反転コンテナ。 注：一度だけ反転またはペレットはウェル底部から緩むことがあります。 </li><li> 1分間150×gで清潔なペーパータオルと遠心分離機に反転プレートを置きます。 </li><li>各ウェルに150μLの70％エタノールを追加します。 </li><li>プレートを再シールし、5分間、2,250×gでスピン。 </li><li>繰り返しは3.2.6と3.2.7を繰り返します。 </li><li>ウェルが完全に乾燥していない場合は、室温で空気乾燥させます。乾燥しながら、サンプルを光から保護されていることを確認してください。 </li><li>各ウェルピペットミックスに10回を10μLホルムアミドを追加します。プレートを再シール。 </li><li> 5分間、4℃で、続いて3分間95℃でサーモサイクラーで変性。 </li><li>変性後、メーカーの指示15に従ってシーケンシングプラットフォームにセプタムおよび配列とプレートシーラーを交換してください。 </li></ol></li></ol>配列決定結果の分析4。 <ol><li>シーケンシングのDATを使用してシーケンシングトレースを可視化製造業者の説明書16とそれぞれの基準配列に整列に従って解析ソフトウェア。 NCBI参照配列「NM_002468」にMYD88を合わせます。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

WTB-PCRアッセイは、ここで説明する拡張（ 図1）の間にWT DNAの増幅をブロックするように設計されたブロッキングオリゴプライマーの一般的なセットを使用します。 WTB-PCR産物は、次いで、変異解析のために配列決定されます。 WTB-PCR /サンガーの有用性は、その単純性、高感度、高スループットです。ここで説明するガイドラインを使用して、ほとんどの既存のサンガーベースの?...

サンガー配列決定は、伝統的に、既知および未知の体細胞変異の検査でゴールドスタンダードとなっています。 （ - WTのバックグラウンド中の20％の変異対立〜10）1サンガー配列決定の制限の1つは、検出の限界です。感度のこのレベルは、いくつかの循環腫瘍細胞、又は骨髄（BM）は、斑状のときと前悪性組織または患者からの試料中に存在し得る低レベルの体細胞変異を検出するためには不適切です。これはまた、治療後の残存疾患を評価する単独2従来の配列決定により困難な治療中に新たな耐性変異を検出することができます。ロックされた核酸（LNA）と、従来のPCRを置き換えることによって、サンガー配列決定にPCR（WTB-PCR）をブロックする野生型の媒介、WTの背景で最大0.1％突然変異対立遺伝子の感度は、2、3、4を達成することができます。にこれにより、WT DNAの増幅を防止WT DNAに優先的に結合する（LNA）、オリゴヌクレオチドをブロック - （14 NT〜10）WTB-PCRは、変異体対立遺伝子について富化は短いの添加を介して達成されます。変異体富化WTB-PCR産物は、次いで、配列決定することができます。 WT DNAを遮断ではなく、特定の変異について選択することによってWTB-PCRは、微小細胞画分中に存在する既知および未知の変異の濃縮を可能にします。 複数の方法は、現在、小細胞画分における変異を検出するために使用されます。これは、高速液体クロマトグラフィー（DHPLC）、ビーズ、エマルジョン、増幅、および磁気（のBEAMing）、電界誘起放出および測定（EFIRM）、高分解能変性、対立遺伝子特異的PCR、増幅不応性変異システム（ARMS）を含みます融点など。しかし、これらの方法のほとんどは偽陽性とのみアッセイは4のために設計された一つの変異を検出する能力によって制限されています</SUP&gt;。 WTB-PCRは、しかし、ユーザが複数の変異型の検出を可能にし、成果物または脱アミノ化の事象による偽陽性を除外するのを助けることができるシーケンシングトレースを視覚化することができます。次世代シーケンシング（NGS）が、実質的に大きなコスト、複雑さ、及びより長いアッセイ時間はそれをいくつかの異なる分子マーカーを有する多くの疾患の種類または新興のための治療を受けている患者を監視するための不要なオプションをレンダリング、従来の配列決定に適切な代替を提供することができます耐性変異。さらに、高い偽陽性率が5％未満の変異対立遺伝子頻度を有する変異体を検出した場合は、アンプリコンベースのNGS 5、6のための問題を提起することができます。 ここでは、Albitar らによって記載されているように骨髄分化因子88遺伝子の突然変異のスクリーニングにWTB-PCRによって達成感度の増加を示します。 3 MYD88のmutatioNSは、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）未知の重要性（IgMでMGUS）の、IgMモノクローナル免疫グロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫（SMZL）における重要な診断および予後因子であり、大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）を拡散します。 MYD88の変異は、WMとMGUSを分泌する免疫グロブリンM（IgM抗体）の患者の約50％のほぼすべてのケースで発見されました。対照的に、MYD88突然変異はSMZL患者の唯一の0から6パーセントに見られ、多発性骨髄腫7,8に存在しないされています。重複形態学、免疫表現型、細胞遺伝学的、およびWM及びSMZL又はIgM、多発性骨髄腫との間の臨床的特徴は、多くの場合、鑑別診断を複雑にすることができるので、MYD88変異の存在は、有用な同定因子9として機能することができます。 MYD88の変異はまた、治療7次DLBCLと貧しい全体的な生存患者においてより大きな疾病負担と関連しています</SUP&gt; 10。また、MYD88突然変異はより頻繁に活性化B細胞様（ABC）DLBCLで発見されているのでBが細胞様（GCB）DLBCLまたは原発性縦隔B細胞リンパ腫（PMBL）、MYD88の変異状態として働くことができる胚中心ABCサブタイプ11、12の代理マーカー。 ここで提供される詳細なプロトコルは、新しいアッセイを開発することができるか、またはほとんどの既存の配列決定アッセイを容易に正確に様々な試料タイプにおける低頻度変異を検出するように構成することが可能なテンプレートとして役立ちます。アプローチはまた、モニタリング及び腫瘍または患者は標的療法または抗生物質で治療されている間に発生することがあっても、細菌で発症し得る耐性変異を検出するために使用することができます。さらに、それは特にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織では、変異濃縮に関連する問題の多くに対処し、救済。

<table><tbody><tr><td>1.5 or 2 mL Safe-Lock microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>100% alcohol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td>Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol</td></tr><tr><td>3730XL sequencer</td><td>ABI</td><td></td><td>or equivalent</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>For magnetic bead PCR purification</td></tr><tr><td>Aluminum sealing foils</td><td>GeneMate</td><td>T-2451-1</td><td>For PCR and cold storage</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit</td><td>Life Technologies</td><td>4337455</td><td>For bi-directional sequencing. With 5x Sequencing Buffer</td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 Series</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>A-2-DWP rotor (for PCR plate)</td></tr><tr><td>Cold plate for 96 well plates</td><td>Eppendorf</td><td>Z606634</td><td></td></tr><tr><td>DNAse, RNAse-free, ultra-pure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297-117</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side-Skirted Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>For use in PCR Purification.</td></tr><tr><td>Ethanol Absolute&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>200 proof, for molecular biology</td></tr><tr><td>Exiqon website Oligo Tools</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.exiqon.com/oligo-tools&quot;&gt;www.exiqon.com/oligo-tools&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/&amp;micro;L)</td><td>Roche</td><td>12032937001</td><td>With10x concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td></td><td></td><td>2% agarose gel</td></tr><tr><td>GeneRead DNA FFPE extraction Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>180134</td><td>Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamide</td><td>ABI</td><td>4311320</td><td>For sequencing.</td></tr><tr><td>LNA oligonucleotide</td><td>Exiqon</td><td>500100</td><td>5&#039;-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)</td></tr><tr><td>M13-F Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5&#039;-tgt aaa acg acg gcc agt</td></tr><tr><td>M13-R Sequencing Primer</td><td>ABI</td><td></td><td>5&#039;-cag gaa aca gct atg acc</td></tr><tr><td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>E950030020</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Model 5430</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 mL microcentrifuge tubes)</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5&#039;-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td></tr><tr><td>PCR reverse primer</td><td>IDT</td><td></td><td>5&#039;-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td></tr><tr><td>PCR plates</td><td>GeneMate</td><td>T-3107-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipettors</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Plate septa, 96 well</td><td>ABI</td><td>4315933</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td>For BM aspirate and peripheral blood</td></tr><tr><td>SeqScape Sortware v3.0</td><td>ABI</td><td>4474978</td><td>For sequencing analysis</td></tr><tr><td>Slide basket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate (3 M, pH 5.2)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filtered pipette tips</td><td></td><td></td><td>20, 200, 1,000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Thermomixer C&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>Vortex genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wash reservoir</td><td></td><td></td><td>~ 1,000 mL</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td>Histology grade</td></tr></tbody></table>

wild-type blocking pcr combined with direct sequencing as a highly sensitive method for detection of low-frequency somatic mutations

治療、治療中に耐性変異を出現するためのスクリーニング、または場合患者が少数の循環腫瘍細胞を有していた後に残存病変を評価する場合、低周波変異の正確な検出と識別が問題となり得ます。配列決定分析に続くPCRブロッキング野生型は、これらの低周波数の変異を検出するための方法として、高感度、柔軟性、および単純さを提供しています。新しいまたは以前に確立された従来のPCRに基づく配列決定アッセイにカスタム設計されたロックされた核酸、オリゴヌクレオチドを添加することにより、1000個のWT対立遺伝子のバックグラウンドで約1変異対立遺伝子の感度は、（1,000 1）を達成することができます。一般的に、ホルマリン固定パラフィン包埋組織で見出さ脱アミノ化イベントに関連付けられたシーケンシングアーチファクトが部分的に抽出工程中のウラシルDNAグリコシラーゼを使用することによって改善することができます。ここで最適化されたプロトコルは、MYD88の変異を検出するための具体的であるが、任意のを設計するためのテンプレートとして機能することができWTB-PCRアッセイ。対立遺伝子特異的PCR及びリアルタイム定量PCRを含む低頻度変異の検出のための他の一般的に利用されるアッセイオーバーWTB-PCRアッセイ法の利点は、偽陽性の少ない発生、柔軟性と実装の容易さ、および検出する能力を含む既知の両方および未知の変異。

拡張時WTB-PCRの概念の概要は、 図1に示されています。ブロッカー-DNAハイブリッド中の一塩基ミスマッチが大きく、その融解温度低下するため（ΔTM = 20から30°C）の変異鋳型DNAは、拡張17を完成するのに自由であるが、WT対立遺伝子の増幅が阻止されます。 WT DNAが直線的に増幅されている間、このように、変異体DNAを指数関数的に?...

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Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K ビュー.  NeoGenomics Laboratories. Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

ビデオ: Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

遺伝学

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

行動学

<meta charset="utf8"></head><body>野生型ブロッキングPCRによる低頻度変異検出の最適化

Wild-type Blocking PCR Combined with Sanger Sequencing for Detection of Low-frequency Somatic Mutation

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting for drug resistance mutations and circulating tumor cell mutations during therapy. Traditional Sanger sequencing has 5%-20% wild-type mutation detection, so its limit of detection cannot meet the corresponding requirements. The wild-type blocking technologies that have been reported to overcome this include blocker displacement amplification (BDA), non-extendable locked nucleic acid (LNA), hot-spot-specific probes (HSSP), etc. These technologies use specific oligonucleotide sequences to block wild-type or recognize wild-type and then combine this with other methods to prevent wild-type amplification and amplify mutant amplification, leading to characteristics like high sensitivity, flexibility, and convenience. This protocol uses BDA, a wild-type blocking PCR combined with Sanger sequencing, to optimize the detection of RHOA G17V low-frequency somatic mutations, and the detection sensitivity can reach 0.5%, which can provide a basis for MRD monitoring of angioimmunoblastic T-cell lymphoma.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:がん組織における低周波変異の検出の促進

This article introduces the application of a low-frequency detection method based on Sanger sequencing in angioimmunoblastic lymphoma. Provide a basis for applying this method to other diseases.

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

When monitoring minimal residual disease (MRD) after tumor treatment, there are higher requirements of the lower limit of detection than when detecting ...

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

要約

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この動画の章

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

レンチウイルス媒介トランスジェニックマウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

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単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

目標シーケンシングアプローチによる比較病変分析

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築

レンチウイルス媒介トランスジェニックマウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応