これらの方法は、実験的操作、疾患原因タンパク質、またはRNAがシナプスプロセスに影響を与えることができるかどうか、および治療用化合物が機能を回復できるかどうかについての迅速な評価を可能にする。これらの技術は、電気生理学と比較して比較的短期間にニューロンのグループからシナプス機能の信頼できる読み出しを提供する。このプロトコルは、ニューロンの発達または変性のあらゆる疾患に適用することができる。
これは、初代げっ歯類ニューロン培養物、および誘導多能性幹細胞に由来するニューロンに対して良好に機能する。まず、共焦点イメージング取得ソフトウェアを使用して画像取得設定を最適化します。励起パワー露光時間、検出器ゲイン、フレームレートをすべてのサンプルで一定に保ちます。
タイムラプスイメージングでは、染料の漂白を最小限に抑えるために、512 x 512のアスペクト比と1秒あたり2つの画像のフレームレートを選択します。次に、GCaMP6 M/GCaMP 3とフィッツィー、ステアロイル色素とTrixiの蛍光励起、二色性、発光フィルターの組み合わせを選択します。タイムラプスイメージング中のZドリフトを回避するには、共焦点イメージング集録ソフトウェアの完璧なフォーカス機能を使用してください。
次に、画像取得パネルの時間タブを選択します。フェーズ 1 の場合は、間隔を 500 ミリ秒、期間を 3 ~ 5 分に設定します。フェーズ 2 では、間隔を 500 ミリ秒、期間を 5 分に設定します。
次に、人工脳脊髄液またはACSF用の重力灌流装置を組み立てるために、装置の上部にある50ミリリットルのシリンジに高塩化カリウムACSF緩衝液をロードし、流量を毎分1ミリリットルに設定した。次に、ニューロンを含む35ミリリットルのガラス皿を、灌流チューブの端を皿の端に置いた共焦点イメージングステージにロードし、イメージング用のフィールドを選択します。トランスフェクション後48時間、初代皮質または運動ニューロンを低塩化カリウムACSF緩衝液中で摂氏37度で10分間インキュベートする。
次いで、ピペットを用いて吸引して緩衝液を除去し、50ミリモルの塩化カリウムおよび10マイクロモルのスチリル色素を含むACSFで満たされたガラス底のシャーレ上に暗所でニューロンをロードする。5分後、ローディング溶液を除去し、ニューロンを摂氏37度の低塩化カリウムACSF緩衝液に10分間浴びせて、非特異的色素ローディングを除去した。次いで、ディッシュを倒立共焦点顕微鏡の撮像ステージ上に置き、20回の空気対物レンズまたは40回の油浸対物レンズの下で細胞を観察した。
546ナノメートルのレーザーを使用してスチール染料を励起し、570〜620ナノメートルのバンドパスフィルターを使用して発光を収集します。イメージングフィールドを選択し、完璧な焦点を合わせた後、明視野、Trixi、蛍光マーカーチャンネルを含む単一の静止画を撮影して、ニューロン境界をマークします。次に、集録ソフトウェアでRun Nowを開始し、3~5分間基本記録を実行して色素強度の変動を除外します。
フェーズ2への切り替えで、灌流システムのオンボタンをトリガーし、50ミリモルの塩化カリウムをニューロンに絶えず灌流して、色素のアンロードを容易にします。録音を5分間実行し、灌流システムのオフスイッチをトリガーします。後で共焦点ソフトウェアを使用してデータ分析のために実験を保存します。
GCaMP6Mによるトランスフェクション後48時間、初代げっ歯類皮質ニューロンを低塩化カリウムACSFで15分間インキュベートする。次に、ディッシュをイメージングプラットフォームにマウントし、フィッツィーフィルターと20倍または40倍対物レンズを使用してGCaMP 6M蛍光を視覚化しました。イメージングフィールドを選択し、完璧なフォーカスを合わせた後、明視野、Fitzy、蛍光マーカーチャンネルを使用して単一の静止画を撮影し、ニューロン境界をマークします。
次に、集録ソフトウェアでRun Nowを起動し、基本録音を3~5分間実行します。次に、以前に実証したように50ミリモルの塩化カリウムを含むACSFをニューロンに灌流し、5分間記録する。画像取得が止まったら、実験を保存し、共焦点ソフトによるデータ解析に進みます。
画像解析では、共焦点ソフトウェアでタイムラプス画像を開き、「画像」をクリックして画像を整列させ、次に処理を行い、次に現在の文書を整列させてから、「最初のフレームに整列」を選択します。ROI選択ツールを使用して神経突起に沿った関心領域を選択し、バックグラウンド蛍光強度を表すROIもマークします。次に、時間測定パネルから測定機能を開始し、選択したROIの経時的な生蛍光を測定します。
測定後、生の蛍光強度を表計算ソフトにエクスポートします。スチリル色素を負荷した培養ラット初代皮質ニューロンをここに示す。色素装填の特異性は、シナプス小胞マーカーシナプトフィジンによる共標識によって決定され、滅菌色素陽性穿刺の大部分はこのマーカーに対して共陽性である。
イメージング期間全体にわたる生の強度値を解析したところ、シナプトフィジンと強度は一定のままであるが、スチリル色素の強度は刺激後に減少することが明らかになった。緑色蛍光タンパク質トランスフェクトされた対照ニューロンの場合、シナプス小胞放出の成功は、高い塩化カリウム脱分極時に色素蛍光の顕著な損失をもたらした。この代表的なビデオは、刺激に続いて新しい右領域にスチリル色素を選択的にアンロードするニューロンを示す。
対照的に、GA50に色素ペプチド反復構築物に連結されたC9ORF72でトランスフェクトされたニューロンでは、シナプス伝達の障害は、高い塩化カリウム脱分極後でさえも保持された色素蛍光によって表される。塩化カリウム脱分極前後のGCaMP6Mでトランスフェクトされた皮質ニューロンの代表的な蛍光像をここに示す。蛍光値の増加およびGCaMP six Mでトランスフェクトされた皮質ニューロンは、塩化カリウム誘導脱分極後の神経突起へのカルシウム進入を示す。
ベースライン記録期間の終わりに、ニューロンは低い蛍光でGCaMP6Mを発現した。その後、刺激の開始時に劇的な蛍光増加が観察される。スチリル色素およびGCaMPの蛍光ベースライン記録が安定していることを確認してください。
画像のドリフトを避けるために、常に完璧なフォーカスを使用し、ポスト画像データの処理が困難になります。ニューロンのさらなる培養は、皿が氾濫中に空気にさらされるため、推奨されない。しかし、タンパク質またはRNAの免疫染色または抽出は、シナプス変化の潜在的な原因を評価することができる。
